西瓜枯萎病菌和哈茨木霉的GFP標記及根部動態定殖比較

孟素玲 王媛 顧欣 王新譜

摘 要 為明確西瓜枯萎病菌和生防哈茨木霉在西瓜根部動態定殖的差異，采用PEG-CaCl2介導的原生質體轉化法，將攜帶綠色熒光蛋白基因的pCT74質粒分別與尖鐮孢菌西瓜?；秃凸哪久筂3菌株的基因組整合獲得相應的轉化子；將轉化子接種于土壤，利用激光共聚焦顯微鏡示蹤并比較兩菌株轉化子對西瓜幼苗根部的侵染動態過程。結果表明，轉化子連續傳代6次仍能發出綠色熒光且熒光強度穩定，能夠穩定遺傳，經PCR驗證綠色熒光蛋白基因轉入成功。盆栽試驗中，兩種轉化子均能成功定殖于西瓜幼苗根部，在定殖初期，尖鐮孢菌西瓜?；驮诟鶅鹊臄U散速度快于哈茨木霉M3菌株。

關鍵詞 哈茨木霉；尖鐮孢菌西瓜?；?；綠色熒光蛋白；定殖

西瓜枯萎病是由尖鐮孢菌西瓜專化型（Fusarium oxysporum f. sp. niveum，FON）侵染引起的土傳病害，世界各地西瓜栽培區均有發病，且一旦暴發，嚴重影響西瓜產量甚至造成絕收［1］。利用生防木霉防控西瓜枯萎病已被證明是可行的綠色防控方法［2］。因此，兩種微生物在植物根部的定殖及活性被學者們關注。

在植物與土傳病害的關系中，病害發病時間和發病程度與病原菌在植株根部的定殖能力密切相關［3］。FON對植株根部的侵染始自孢子在根表皮的固著與萌發，隨后菌絲侵入表皮，再沿著皮層細胞侵入維管束，通過維管束由根部繼續向上侵染［4］。雖然FON的侵染情況與病原菌生物學特性和植株抗性有關，但是，枯萎病病情等級通常與FON在西瓜根內定殖的數量呈正相關［5］。針對FON的生物防控已篩選獲得多種生防菌，其中哈茨木霉（Trichoderma harzianum）的研究和應用最多［6］。已知哈茨木霉對致病性鐮刀菌的生防機制涉及競爭、重寄生、抗生作用、誘導植物抗性等，且都與木霉在植株根部的定殖緊密關聯［7-8］。哈茨木霉在作物根部的定殖過程與鐮刀菌相似，從孢子附著根表皮后萌發，然后菌絲逐步侵入皮層細胞，進而在根部維管束中定殖［9-10］。因此，作為土傳病害的生防菌，木霉在土壤或寄主植物中的有效定殖對其發揮拮抗作用具有重要意義。

綠色熒光蛋白（Green fluorescence protein，GFP）標記技術可實現微生物-植物互作領域研究中的可視化跟蹤，具有熒光性質穩定、直觀、無需添加外源底物即可檢測等優點［11］。該技術被用于多種病原菌和生防菌，如炭疽菌（Bacillus anthracis）［12］、鐮孢菌［13］、芽孢桿菌（Bacillus）［14］和木霉菌［15］等的研究中。實現GFP標記的主要方法有PEG-CaCl2介導的原生質體轉化法、電激法、基因槍法和農桿菌轉化法。其中，PEG-CaCl2介導的原生質體轉化法因轉化效率高、操作簡便、不受昂貴儀器限制等優點被廣泛應用［16-17］。

已有研究明確了FON和生防哈茨木霉在不同植株根部定殖的基本規律，但是對兩種微生物在相同生境、同種植物的根部動態定殖差異的認識尚不足?；谇捌谘芯糠蛛x獲得的生防哈茨木霉M3菌株，在對峙培養和盆栽試驗中對FON均表現出較好的拮抗作用。為比較二者在西瓜根部的動態定殖差異，本研究采用PEG-CaCl2介導的原生質體轉化法，分別構建含有潮霉素B磷酸轉移酶基因（hygr）和綠色熒光蛋白基因（gfp）的哈茨木霉M3和FON轉化子，并利用轉化子示蹤兩菌株在西瓜根部的動態定殖，對比其侵染進程的差異，以促進對生防菌和病原菌在根際動態定殖的認識，為西瓜枯萎病的生物防控研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株與土壤來源 哈茨木霉M3菌株（NCBI編號ITS-JX473715，TEF1-MT809679，RPB2-MT809710）和FON均由寧夏大學農業微生物學實驗室分離鑒定并保存。西瓜品種為‘金城5號。土壤取自寧夏中衛市興仁鎮紅圈子村非耕作地，過2.0 mm篩，備用。

1.1.2 質粒與感受態細胞 含有潮霉素B磷酸轉移酶基因（hygr）的質粒pCT74，購自淼靈質粒平臺。擴增質粒所用的大腸桿菌感受態細胞Trans5a購自北京全式金生物技術有限公司。

1.1.3 引物 gfp基因的特異性引物P28（5′-TAGTGGACTGATTGGAATGCATGGAGGAGT-3′）/P29（5′-GATAGAACCCATGGCCTATATTCATTCAAT-3′）參照文獻［18］，由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.1.4 培養基與試劑 馬鈴薯葡萄糖瓊脂（Potato Dextrose Agar，PDA）培養基、馬鈴薯葡萄糖液體（Potato Dextrose Broth，PDB）培養基、LB瓊脂培養基、LB液體培養基、再生培養基和水瓊脂培養基的配制參考文獻［19］。氨芐青霉素（Ampicillin，Amp）、潮霉素B（Hygromycin B，HmB）、崩潰酶（Driselase）購自北京索萊寶科技有限公司，真菌基因組DNA提取試劑盒（E.Z.N.A○RAFungal DNA Kit）購自美國omega公司，EcoTaq○[KG-*3/4][HT6”SS]RPCR SuperMix （+dye）、質粒提取試劑盒（EasyPure○[KG-*3/4][HT6”SS]R Plasmid MiniPrep Kit）購自北京全式金生物技術有限公司。STC溶液、PTC溶液和酶解液依據文獻［19］配制。

1.1.5 儀器設備 ROX-250智能人工氣候箱，Azure c200凝膠成像系統，DYY-6C型電泳儀，Olympus BX51熒光顯微鏡，Leica TCS SP5 型激光共聚焦掃描顯微鏡。

1.2 試驗方法

1.2.1 M3野生型和FON野生型對HmB的敏感性測定 將4 ℃保存的M3菌株和FON分別接種于PDA培養基，28 ℃培養5 d。用滅菌打孔器打取直徑5 mm的M3菌餅，分別接種至含0、200、400、600、800和1 000 μg/mL HmB的PDA培養基。用接種環挑取FON菌絲，采用點接法分別接種至含0、20、40、60、80、100、150、200? ?μg/mL HmB的PDA培養基。28 ℃培養8 d。每處理5個重復。觀察不同處理的菌落生長情況，確定HmB對M3菌株和FON的最低致死濃度，為轉化后的原生質體培養提供合適的HmB選擇濃度。

1.2.2 質粒的提取 將pCT74質粒干粉3 000 r/min離心1 min后加入20 μL無菌水溶解；取1支100 μL的大腸桿菌感受態細胞，加入2 μL質粒，冰浴30 min后，42 ℃熱激60 s，再冰浴 ?2 min；加入900 μL無抗生素的LB液體培養基， ?37 ℃、180 r/min震蕩培養45 min；6 000 r/min離心5? min，棄去多余上清液，留100 μL用于重懸細菌沉淀，并涂布至含Amp抗性的LB瓊脂培養基上；37 ℃培養14 h；挑取單菌落至LB液體培養基中，加入Amp抗生素，220 r/min震蕩培養14 h。質粒DNA提取方法按試劑盒的操作步驟進行，將提取的質粒DNA經10 g/L 瓊脂糖電泳檢測其純度，-20 ℃保存，備用。

1.2.3 M3野生型和FON野生型的原生質體制備 原生質體的制備過程參照文獻［20］，略作修改。用無菌水沖洗PDA培養7 d的M3菌株和FON，經紗布過濾后制成孢子懸液，吸取適量孢子懸液接種到PDB培養基中，28 ℃、140 r/min搖床培養12～15 h，用滅菌的濾紙過濾收集菌絲，并用0.8 mol/L NaCl反復沖洗。挑取0.1 g菌絲，加入1 mL 50 mg/mL的崩潰酶，充分混勻，28 ℃、140 r/min崩潰2～3 h，每隔0.5 h觀察1次，直至鏡檢視野中無菌絲，即為崩潰完全。于4 ℃、3 000 r/min離心8 min，棄上清液，沉淀即為原生質體，并用STC重懸沉淀，將原生質體濃度調至1.0×108 mL-1。

1.2.4 PEG-CaCl2介導的原生質體轉化

分別取200 μL M3菌株和FON原生質體，加20 μL質粒DNA，50 μL PEG，輕輕顛倒混勻，冰上放置30 min，緩慢滴入1 mL PEG，充分混勻，室溫放置20 min，將原生質體懸浮液與15 mL再生培養基（含HmB）混合，倒至平板上，28 ℃過夜培養。在平板上分別鋪10 mL含有1 000、150? ?μg/mL HmB的水瓊脂培養基，28 ℃培養8 d后獲得轉化子。

1.2.5 M3轉化子和FON轉化子的篩選及穩定性檢測 將“1.2.4”培養獲得的M3轉化子和FON轉化子分別接種至含有1 000、150? ?μg/mL HmB的PDA培養基上，28 ℃培養5 d進行復篩，挑取菌絲在熒光顯微鏡下觀察。選擇熒光強度最高的菌落進行單孢分離，在不加HmB的PDA培養基中連續傳代培養6代，再將M3轉化子和FON轉化子分別轉接至含有1 000、150? ?μg/mL HmB的PDA培養基上，此時仍能正常生長且穩定發光的視為具有穩定遺傳能力。

1.2.6 M3轉化子和FON轉化子的分子鑒定

將PDA培養基中培養5 d的轉化子用無菌載玻片刮取菌絲至1.5 mL離心管中，采用真菌基因組DNA試劑盒提取DNA。以野生型菌株和清水為對照，利用gfp基因特異性引物P28/P29進行PCR驗證，目的片段大小為417 bp。PCR反應體系（25 μL）：2×EcoTaq PCR SuperMix （+dye） 12.5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 9.5 μL。反應條件： ?94 ℃預變性5 min；94 ℃變性 45 s，58 ℃退火 ?1 min，72 ℃延伸 1 min，35個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產物經15 g/L 瓊脂糖凝膠電泳檢測，利用凝膠成像系統分析結果。

1.2.7 M3轉化子和FON轉化子在西瓜根部的定殖 挑選籽粒飽滿的西瓜種子播種于裝有營養土的育苗缽中，長至兩葉一心時備用。將M3和FON活化培養6 d后，用無菌水沖洗菌落，經8層無菌紗布過濾，獲得孢子懸液。以血球計數板法計數，配制孢子濃度為1×107 mL-1的M3和FON孢子懸液。營養缽（口徑10 cm，底徑6.5 cm，高10 cm）裝土300 g/缽，每缽移植西瓜苗1株，保持土壤含水率約60%，置于日光溫室，室溫約24 ℃。采用灌根法分別接種M3孢子懸液和FON孢子懸液20 mL，每處理12株。在接種后第1、3、5、7天取植株全根，用無菌水多次沖洗至根表面沒有土壤附著。將根置于載玻片上，利用激光共聚焦熒光顯微鏡（Confocal laser scanning microscope，CLSM）觀察真菌轉化子在西瓜根部的定殖狀況。CLSM的激發光波長為488 nm/507 nm。

2 結果與分析

2.1 M3野生型和FON野生型抗生素濃度的 ?篩選

利用HmB對M3和FON的野生型進行敏感性測試。結果表明，隨著HmB濃度的升高，野生型M3和FON菌絲生長受抑制程度顯著增強。28 ℃培養條件下，HmB質量濃度為1 000?? ?μg/mL時，M3菌絲無生長跡象（圖1-a）。HmB質量濃度為150 μg/mL時，FON菌絲無生長跡象（圖1-b）。因此，分別采用1 000 μg/mL和150? ?μg/mL HmB培養基作為M3轉化子和FON轉化子的篩選條件。

2.2 M3野生型和FON野生型原生質體的制備

利用崩潰酶處理M3和FON菌絲，發現M3菌株在崩潰處理2.5 h時原生質體產量最高（圖2-a），FON在崩潰處理2 h時原生質體產量最高（圖2-b）。

2.3 M3轉化子和FON轉化子的熒光穩定性 ?檢測

挑選發光良好的哈茨木霉M3轉化子和FON轉化子進行熒光穩定性檢測。經單孢分離，傳代培養6代，將其轉接至分別含有1 000、150 μg/mL HmB的PDA培養基上。兩種轉化子均生長良好，在熒光顯微鏡下呈現強烈的綠色熒光（圖3）。

2.4 M3轉化子和FON轉化子的分子鑒定

采用引物P28/ P29對野生型M3、FON和傳代培養后的轉化子基因組DNA分別進行PCR擴增。結果表明，M3轉化子和FON轉化子分別擴增出1條大小為417 bp左右的目標片段，即圖4中樣品1的條帶，與預期目標片段大小一致。野生型菌株和清水對照組均未擴增出片段，說明gfp基因已轉入M3和FON菌株中。

2.5 M3轉化子和FON轉化子在西瓜根部的定殖

利用激光共聚焦顯微鏡觀察M3轉化子侵染西瓜根部的過程。結果表明，接種1 d，部分孢子吸附在西瓜根表面萌發，形成長芽管并逐漸伸長（圖5-a）。第3天時，在植株根表面可以看到少量菌絲纏繞（圖5-b）。接種至第5天，大量菌絲分布在根表面（圖5-c），部分菌絲已經侵入表皮（圖5-d）。至第7 天，根內部的菌絲進一步侵染擴散，已經沿著細胞間隙形成類網狀結構，說明該菌株已完全定殖于植株根內（圖5-e）。橫切面圖顯示部分菌絲沿著皮層細胞已侵入到維管束（圖5-f）。

FON轉化子侵染西瓜根部的過程與M3菌株有相似之處。接種1 d，部分孢子附著于根表面并開始萌發，由芽管逐漸長成菌絲（圖6-a），該現象主要集中在根毛區域。接種至第3 天，菌絲在表皮上生長蔓延，部分開始進入細胞間隙（6-b），且大量菌絲纏繞在植株根表面，呈現較強的熒光（圖6-c），至第5天，菌絲穿過皮層細胞（圖6-d），到達維管束（圖6-e）。接種至第7天，FON轉化子的菌絲已完全定殖于西瓜根內，圍繞細胞生長的菌絲形成密集的類網狀結構（圖6-f）。

3 討? 論

確定真菌的抗生素最低致死濃度是實現GFP轉化的重要步驟。研究表明，鉤狀木霉（T.hamatum）在HmB 質量濃度為50 μg/mL的平板上不能正常生長［9］。棉花枯萎病菌在HmB篩選壓力300 μg/mL時成功獲得含gfp的轉化子［21］。本研究發現HmB對哈茨木霉M3菌株和FON的最低致死質量濃度分別為1 000 μg/mL和150 μg/mL，說明不同種類微生物的生物學特性導致其抗生素耐受性差異較大。以HmB作為抗性篩選標記，通常假轉化子背景高［22］。為克服該缺點，本研究將初篩獲得的轉化子再次轉接到含HmB的平板上進行復篩，以保證轉化子的篩選有效性。同時對轉化子繼代培養6次后再轉接到含HmB抗性平板上，結果顯示轉化子均生長良好。明確了兩種微生物轉化子的遺傳穩定性，為后續相關研究提供了重要的材料。

原生質體的數量和質量是真菌gfp基因成功轉化的關鍵。原生質體在制備過程中受多種因素影響，包括酶的濃度、酶解溫度、穩滲劑、酶解時間和菌齡等［23-24］。菌絲的不同生長階段和生理狀態均影響原生質體的形成。新生菌絲在酶解過程中極易降解，過快釋放導致原生質體破裂的幾率增加。老化的菌絲通常細胞壁較厚，增加了酶解難度，造成原生質體產量較低［25-26］。因此，菌絲處于指數生長期是最佳的原生質體制備階段［27］。本研究發現，哈茨木霉M3和FON的菌絲體分別在培養14 h和12 h時最有利于原生質體的生成。最適的酶解時間既能增加原生質體的產率，又不會因酶解時間過長導致細胞膜破裂［28］。本研究中，哈茨木霉M3的菌絲酶解時間超過 ?2.5 h，FON菌絲酶解時間超過2 h，都會導致原生質體的質量和數量降低。

通過GFP標記微生物，觀察其侵染植物組織尤其是根部的過程，是微生物-植物互作關系研究中重要的一部分。利用鉤狀木霉GFP轉化子研究其在辣椒幼苗根部的動態定殖。接種1 d后進行取樣觀察，發現該木霉已定殖于根表皮，3 d時菌絲侵染至植株根部維管束，第7 天時可觀察到大量木霉菌絲定殖于根莖的交接處［9］。通過灌根接種致病性尖鐮孢菌，觀察其對地黃的侵染進程，發現接種84 h后，病原菌已通過傷口或毛孔等通道侵入植株根部，并迅速蔓延至維管組織，導致接種僅4 d的地黃就表現出枯萎癥狀［29］。Batista等［30］研究了尖鐮孢菌菜豆專化型（Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli）轉化子在菜豆根部的定殖，結果表明，病原菌首先接觸的部位是根毛，第11 天時病原菌侵入細胞間隙，第19天時到達木質部導管，但發出的綠色熒光強度較弱。說明該致病菌主要在根冠的細胞間定殖，在木質部導管的定殖較弱。前人研究盡管明確了木霉菌或尖鐮孢菌在某作物根部的侵染動態，但是不同試驗選用的土壤、植物和其他環境條件具有較大差異，因此無法將兩種微生物侵染作物根系的動態進行直接比較。本研究在相同土壤來源和栽培環境條件下，研究了哈茨木霉M3菌株和FON在西瓜根部的動態定殖，發現二者在根部的定殖既具有相似性又具有差異。接種后，M3和FON孢子均能在根表面附著并萌發；隨著培養時間的增加，萌發的芽管逐漸生成大量菌絲，由表皮逐漸侵入皮層細胞，然后到達維管束組織。以上定殖的整體規律與前人研究較為相似。但是，不同時間段的熒光影像表明，M3菌株和FON在西瓜根部的侵染進程具有差異。接種第3 天，已有部分FON菌絲進入細胞間隙，而同時期M3菌株處理未見該現象。至第5 天，M3的菌絲出現在細胞間隙，但是FON菌絲已大量侵入皮層細胞和維管束。M3菌絲在第7 天時才定殖到維管束中。說明病原菌FON在西瓜根部的定殖侵染較哈茨木霉M3菌株更快。這可能是致病性尖鐮孢菌能夠快速導致寄主植物發病和該類病害防治難度較大的重要原因。未來在利用哈茨木霉開展枯萎病的生物防治時，還需考慮兩種真菌在根際復雜的互作關系。

4 結? 論

本研究通過PEG-CaCl2介導的原生質體轉化法，成功獲得能夠穩定表達gfp的哈茨木霉轉化子和FON轉化子，二者都能通過表皮侵入西瓜根部維管束組織。在接種7 d內，FON的定殖和侵染較哈茨木霉更快。這可能是FON能夠快速導致西瓜發病和西瓜枯萎病防治難度較大的重要原因。本研究結論將促進人們對哈茨木霉和FON在寄主植物根部定殖的重新認識。

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Comparison of GFP Markers and Root Dynamic Colonization of Fusarium oxysporum f. sp. niveum? and Trichoderma harzianum in Watermelon

Abstract To clarify the differences in colonization dynamics of watermelon roots by Fusarium oxysporum f. sp. niveum （FON） and Trichoderma harzianum ，the protoplast mediated by PEG-CaCl2 method was used to integrate the pCT74 plasmid carrying the green fluorescent protein （GFP） gene， so as to obtain the corresponding transformants with the genomes of FON and T.harzianum M3 strains，respectively.The transformants were inoculated in soil，and laser scanning confocal microscope （ LSCM） was used to trace and compare the dynamic of root infestation of watermelon seedlings by the two strains.The results showed that the transformants could still emit green fluorescence with stable fluorescence intensity for six consecutive passages and could be inherited stably，and the green fluorescent protein gene was successfully transferred by PCR. In this experiment，both transformants were successfully colonized in the roots of watermelon seedling. At the early stage of colonization，the FON spread faster in the roots than the T.harzianum M3 strain. The relationship between Trichoderma，FON and host plants，environment provides a basis for clarifying the colonization pattern of Trichoderma.

Key words Trichoderma harzianum; Fusarium oxysporum f. sp. niveum; Green fluorescent protein; Colonization