匹多莫德對支原體感染小鼠肺功能損傷的影響及其機制研究*

王坤，李嫣

（蘇州大學附屬兒童醫院 感染性疾病科，江蘇 蘇州 215000）

支原體是一種無細胞壁的病原體，可侵入呼吸道、泌尿生殖道和關節等部位，引起多種感染性疾病。支原體肺炎是支原體感染（mycoplasma pneumoniae infection，MPI）最常見的疾病之一，主要發生在兒童和青少年，占社區獲得性肺炎的10%～40%，以發熱、咳嗽、胸悶、呼吸困難等為主要臨床特征，可伴有肺間質纖維化、肺泡蛋白沉積、肺水腫等肺功能損傷[1]。目前，抗生素是支原體肺炎的主要治療手段，但由于支原體的耐藥性和抗生素的副作用，整體療效仍有待提升[2]。因此，迫切需要尋找新的治療方法和藥物防治支原體肺炎。匹多莫德是一種人工合成的免疫調節劑，可提高免疫力，預防或輔助治療感染性疾病[3]。近年來有研究發現，匹多莫德聯合連花清瘟可顯著改善老年支氣管肺炎患者肺功能，為治療支原體肺炎提供了新的思路[4]。但匹多莫德治療支原體肺炎的作用機制尚不清楚。本研究通過動物實驗觀察匹多莫德對MPI小鼠肺功能損傷的療效及可能的機制，以期為臨床提供新的藥物選擇和理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

50只SPF級雄性BALB/c小鼠，6～8周齡，體重18～22 g，購自北京維泰瑞技術服務發展有限公司。實驗動物生產許可證號：SCXK（京）2019-0013，實驗動物使用許可證號：SYXK（蘇）2021-0065。小鼠在12 h光/暗周期、（22±2）℃恒溫環境下飼養，自由進食飲水。實驗前1周，小鼠進行適應性飼養。

1.2 藥品與試劑

肺炎支原體標準菌株（上海舜冉生物科技有限公司），匹多莫德顆粒劑（浙江仙琚制藥股份有限公司，生產批號：20030325），谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司），γ干擾素（Interferon-γ，IFN-γ）、白細胞介素-4（Interleukin-4，IL-4）試劑盒（上海信裕生物科技有限公司），兔抗小鼠核因子E2相關因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）、血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）一抗（美國R&D公司）。

1.3 儀器

GENios Pro酶標儀（瑞士Tecan公司），Pneupac Small Animal Ventilator小動物呼吸機（美國DRE Veterinary公司），Axio Scope.A1光學顯微鏡（德國蔡司公司），Gel SMART凝膠成像儀（北京大龍興創實驗儀器股份公司）。

1.4 方法

1.4.1 MPI模型的復制 支原體菌液置于PPLO培養基內，在37 ℃培養箱中培養12 h后達對數生長期，當培養液顏色由紅變黃時進行連續傳代，以變色最高稀釋濃度為顏色改變單位（color change unit，CCU），CCU/mL為菌株濃度單位，用10倍梯度稀釋法將菌液稀釋為1×108CCU/mL備用。40只小鼠吸入乙醚麻醉后，經移液器滴入50 μL支原體菌液（1×108CCU/mL），滴入后將鼠頭后仰使菌液隨自主呼吸抵達下呼吸道，滴鼻持續3 d，期間觀測小鼠日常活動及體重變化，末次滴鼻6 h后采集腹主動脈血。經顆粒凝集法判斷，血清滴度≥1∶160表示存在支原體抗體，且出現嗜睡、蜷縮、豎毛、少動、拒食或少食，眼角出現分泌物等臨床癥狀為模型復制成功[5]。

1.4.2 動物分組及給藥 模型復制成功后，取40只MPI模型小鼠隨機分為MPI組及實驗A、B、C組，各10只；另外10只健康小鼠僅滴鼻同體積生理鹽水設為正常組。氣血檢查后1 h，實驗A、B、C組小鼠分別灌胃匹多莫德顆粒（終濃度100、200、400 mg/kg溶于生理鹽水）[6]。正常組、MPI組小鼠灌胃等量生理鹽水，1次/d，持續3 d。

1.4.3 小動物呼吸機檢測肺功能 使用腹腔戊巴比妥鈉深度麻醉小鼠，沿頸部切開皮膚、肌肉和筋膜，暴露甲狀腺后小心分離周圍組織，避免出血，用鉗子隔開頸前肌露出氣管，固定氣管后在氣管上切開約1 mm大小切口，沿氣管向下插管，置于小動物呼吸機的密閉箱中，等待一段靜息呼吸后，測量每分鐘通氣量（minute ventilation，MV）、潮氣量（tidal volume，TV）、最大呼氣量（maximum expiratory volume，MEV）[7]。

1.4.4 組織取材 肺功能檢測完成后采集小鼠腹主動脈血，離心取血清保存于4 ℃條件下備用。采血后脊椎脫臼處死，沿胃下緣、小腸區上部橫切口開腹，暴露腹腔中、上部結構，從劍突下剪破膈肌，使肺回縮，隨后向兩側擴大破口，與腹壁切口靠近，將灌注針從心軸方向進針，刺入心尖3～4 mm，開始灌流后剪破右心耳，先以生理鹽水40 mL快速沖洗血管，然后用含4%多聚甲醛的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液20 mL灌注固定，先快后慢。灌注固定完成后，用解剖剪沿胸骨中線剪開胸壁，暴露肺部結構。用解剖鑷和剪刀分別夾住和切斷氣管、支氣管、肺動脈及肺靜脈，取出整個肺部，用刀片單向切割成約3～4 mm厚的組織塊，放入4%多聚甲醛中固定24 h，脫水、包埋、浸蠟、切片（厚度4 μm）備用。剩余肺組織投入液氮中冷凍保存備用。

1.4.5 血清氧化應激指標檢測 取小鼠冷藏保存的部分主動脈血清，采用紫外分光光度法檢測血清GSH-Px活性，細胞色素C還原法檢測SOD活性，均嚴格按照試劑盒說明書進行操作[8]。

1.4.6 酶聯免疫吸附試驗檢測血清免疫指標 取冷藏保存的部分主動脈血清，按照酶聯免疫吸附試驗試劑盒說明書進行操作，準備酶聯免疫吸附板，將特異性抗IL-4或抗IFN-γ的單克隆抗體稀釋后加入板孔中，包被在固相載體上，4 ℃過夜。去除多余的抗體，用磷酸鹽緩沖液洗滌板孔，加入封閉液，室溫孵育1 h，阻止非特異性結合。去除封閉液，加入標準品或待測血清樣本，用不同濃度的標準品繪制標準曲線，將待測血清樣本稀釋到合適的范圍，室溫孵育2 h，使IL-4或IFN-γ與固相抗體結合。去除未結合的IL-4或IFN-γ，用磷酸鹽緩沖液洗滌板孔，加入生物素標記的山羊抗小鼠IgG二抗，室溫孵育1 h，使二抗與固相復合物結合。去除未結合的二抗，洗滌板孔，加入辣根過氧化物酶標記的親和素，室溫孵育30 min，使親和素與生物素結合。去除未結合的親和素，洗滌板孔，加入適當的底物，室溫顯色10～30 min，使底物在酶的作用下發生有色反應。加入終止液，停止反應，并使有色反應由藍色變為黃色。用酶標儀在450 nm波長處讀取各孔的吸光度（optical density，OD）值，并根據標準品的OD值和濃度繪制標準曲線，計算待檢樣本IL-4、IFN-γ水平[9]。

1.4.7 蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色觀察肺組織病理變化 取肺組織切片放在玻璃載片上，用火焰加熱使其貼合。置于二甲苯中脫蠟，5 min/次，重復2次。將載片轉移到乙醇中脫脂，分別用100%、95%、70%乙醇各處理2次，3 min/次。沖洗載片，蘇木精染色15 min。沖洗載片，0.5%鹽酸乙醇溶液分化5 s。沖洗載片，Scott氏溶液藍化1 min，伊紅溶液染色10 min。沖洗載片，用95%乙醇去除多余的伊紅染料，3 min/次，重復2次。將載片轉移到100%乙醇中脫水，3 min/次，重復2次。將載片轉移到二甲苯中透明化，5 min/次，重復2次。用玻璃蓋片覆蓋載片，封片膠固定，在顯微鏡下觀察[10]。

1.4.8 Western blotting檢測肺組織Nrf2、HO-1蛋白表達 取冷凍保存的肺組織，充分研磨、勻漿、裂解，10 000 r/min低溫離心10 min，離心半徑15 cm，取上清液定量蛋白。取少量樣本蛋白，混合4倍量上樣緩沖液，水浴加熱變性蛋白，以20～30 μg/孔加載到凝膠槽中，加入預染色蛋白作為分子量標準，用恒壓電源進行電泳分離。將分離好的蛋白從凝膠轉移到聚氟乙烯膜上，用轉印儀或半干法轉印。將轉印好的膜用5%牛奶在室溫或4 ℃封閉1～2 h，防止非特異性結合。將封閉好的膜用含適當稀釋比例的Nrf2或HO-1一抗溶液在4 ℃過夜或室溫2 h孵育，使一抗與目標蛋白結合。將孵育好的膜用含Tween-20的TBST緩沖液洗滌3次，10 min/次，去除未結合的一抗。將洗滌好的膜用含適當稀釋比例的熒光標記的二抗溶液室溫孵育1 h，使二抗與一抗結合。重復上述洗滌步驟，去除未結合的二抗。用熒光成像儀掃描和分析洗滌好的膜，根據熒光信號的強度和分子量計算Nrf2、HO-1蛋白相對表達量[11]。

1.5 統計學方法

數據分析采用SPSS 23.0統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠肺功能指標比較

正常組、MPI組、實驗A組、實驗B組、實驗C組MV、TV、MEV比較，經方差分析，差異均有統計學意義（F=17.626、15.133和20.238，均P=0.000）。與正常組比較，MPI組MV、TV、MEV減少（P＜0.05）；與MPI組比較，實驗A、B、C組MV、TV、MEV增加（P＜0.05）；與實驗A組比較，實驗B、C組MV、TV、MEV增加（P＜0.05）；與實驗B組比較，實驗C組MV、TV、MEV增加（P＜0.05）。見表1。

表1 各組小鼠肺功能指標比較 （n=10，±s）

表1 各組小鼠肺功能指標比較 （n=10，±s）

注：①與正常組比較，P＜0.05；②與MPI組比較，P＜0.05；③與實驗A組比較，P＜0.05；④與實驗B組比較，P＜0.05。

MEV/（L/min）0.56±0.07 0.32±0.04①0.41±0.06②0.48±0.09②③0.53±0.07②③④20.238 0.000組別正常組MPI組實驗A組實驗B組實驗C組F 值P 值MV/（mL/min）29.41±5.19 15.59±4.31①19.18±3.87②23.77±3.60②③28.16±4.91②③④17.626 0.000 TV/mL 0.22±0.04 0.11±0.03①0.15±0.04②0.19±0.03②③0.22±0.05②③④15.133 0.000

2.2 各組小鼠血清氧化應激指標比較

正常組、MPI組、實驗A組、實驗B組、實驗C組血清GSH-Px、SOD活性比較，經方差分析，差異均有統計學意義（F=18.642和70.428，均P=0.000）。與正常組比較，MPI組血清GSH-Px、SOD活性降低（P＜0.05）；與MPI組比較，實驗A、B、C組GSH-Px、SOD活性增強（P＜0.05）；與實驗A組比較，實驗B、C組GSH-Px、SOD活性增強（P＜0.05）；與實驗B組比較，實驗C組GSH-Px、SOD活性增強（P＜0.05）。見表2。

表2 各組小鼠血清氧化應激指標比較 （n=10，±s）

表2 各組小鼠血清氧化應激指標比較 （n=10，±s）

注：①與正常組比較，P＜0.05；②與MPI組比較，P＜0.05；③與實驗A組比較，P＜0.05；④與實驗B組比較，P＜0.05。

SOD/（u/mL）68.54±7.21 21.62±5.67①36.51±7.57②48.91±5.02②③57.17±8.27②③④70.428 0.000組別正常組MPI組實驗A組實驗B組實驗C組F 值P 值GSH-Px/（u/L）126.17±10.24 82.16±9.63①91.35±10.27②102.99±15.14②③120.03±19.91②③④18.642 0.000

2.3 各組小鼠血清免疫指標比較

正常組、MPI組、實驗A組、實驗B組、實驗C組血清IFN-γ、IL-4水平比較，經方差分析，差異均有統計學意義（F=26.663和31.635，均P=0.000）。與正常組比較，MPI組血清IFN-γ水平降低，IL-4水平升高（P＜0.05）；與MPI組比較，實驗A、B、C組IFN-γ水平升高，IL-4水平降低（P＜0.05）；與實驗A組比較，實驗B、C組IFN-γ水平升高，IL-4水平降低（P＜0.05）；與實驗B組比較，實驗C組IFN-γ水平升高，IL-4水平降低（P＜0.05）。見表3。

表3 各組小鼠血清免疫指標比較 （n=10，±s）

表3 各組小鼠血清免疫指標比較 （n=10，±s）

注：①與正常組比較，P＜0.05；②與MPI組比較，P＜0.05；③與實驗A組比較，P＜0.05；④與實驗B組比較，P＜0.05。

IL-4/（ng/L）33.98±6.37 75.46±12.71①67.27±8.90②56.45±9.16②③48.16±7.10②③④31.635 0.000組別正常組MPI組實驗A組實驗B組實驗C組F 值P 值IFN-γ/（ng/mL）71.69±9.40 39.43±4.55①47.52±7.13②58.38±7.42②③63.12±9.45②③④26.663 0.000

2.4 各組小鼠肺組織病理變化

HE染色結果顯示，正常組小鼠肺組織結構完整，肺泡狀態正常。MPI組小鼠肺組織結構受損嚴重，肺泡壁斷裂變形，組織間隙腫脹，毛細血管擴張充血，可見大量炎癥細胞浸潤。實驗A、B、C組小鼠肺泡壁恢復連接，組織結構成形，炎癥細胞浸潤減少，間隙腫脹程度變小；實驗C組較實驗A、B組改善更顯著，呈劑量依賴性。見圖1。

圖1 各組小鼠肺組織病理變化 （HE染色×200）

2.5 各組小鼠肺組織Nrf2、HO-1蛋白相對表達量比較

正常組、MPI組、實驗A組、實驗B組、實驗C組肺組織Nrf2、HO-1蛋白相對表達量比較，經方差分析，差異均有統計學意義（F=186.820和123.063，均P=0.000）。與正常組比較，MPI組肺組織Nrf2、HO-1蛋白相對表達量降低（P＜0.05）；與MPI組比較，實驗A、B、C組肺組織Nrf2、HO-1蛋白相對表達量升高（P＜0.05）；與實驗A組比較，實驗B、C組肺組織Nrf2、HO-1蛋白相對表達量升高（P＜0.05）；與實驗B組比較，實驗C組肺組織Nrf2、HO-1蛋白相對表達量升高（P＜0.05）。見表4和圖2。

圖2 各組小鼠肺組織Nrf2、HO-1蛋白表達

表4 各組小鼠肺組織Nrf2、HO-1蛋白相對表達量比較（n=10，±s）

表4 各組小鼠肺組織Nrf2、HO-1蛋白相對表達量比較（n=10，±s）

注：①與正常組比較，P＜0.05；②與MPI組比較，P＜0.05；③與實驗A組比較，P＜0.05；④與實驗B組比較，P＜0.05。

HO-1 0.46±0.04 0.04±0.01①0.21±0.03②0.28±0.07②③0.40±0.06②③④123.063 0.000組別正常組MPI組實驗A組實驗B組實驗C組F 值P 值Nrf2 0.92±0.15 0.08±0.02①0.24±0.03②0.47±0.05②③0.76±0.08②③④186.820 0.000

3 討論

支原體肺炎是一種由肺炎支原體引起的急性呼吸道感染伴肺炎，其主要危險因素包括與患者密切接觸、秋冬季節、兒童和青年年齡段、人群密集環境、免疫力低下及合并其他呼吸道感染等[12-13]。支原體肺炎發病機制涉及支原體對宿主細胞直接損傷、宿主對支原體的免疫反應，以及支原體與其他微生物的共同作用[14-16]。作為一種無細胞壁的病原體，肺炎支原體可抵抗細胞壁靶向性抗生素，并可改變自身大小和形狀以適應周圍環境，從而增加耐藥性和免疫逃避能力，治療難度高[17]。盡管已經有許多藥物和治療方法用于支原體肺炎，但是療效仍不理想，因此迫切需要尋找新的治療策略。

Th1/Th2平衡是指機體在應對不同類型的病原體時，產生適當比例的Th1、Th2細胞，以發揮最佳的免疫效應，IFN-γ、IL-4分別是兩者的代表性因子，廣泛參與支原體肺炎發生、發展[18-19]。本研究結果顯示，與MPI組比較，實驗A、B、C組MV、TV、MEV均增加，IL-4水平降低，GSH-Px、SOD活性、IFN-γ水平均升高，提示匹多莫德可改善MPI小鼠肺功能、氧化應激及免疫功能。匹多莫德是一種由2個L-丙氨酸和1個D-苯丙氨酸組成的二肽類化合物，常用于治療有細胞介導免疫抑制證據的肺部及泌尿道感染，其可刺激和調節細胞因子的產生和釋放，從而增強非特異性自然免疫、體液免疫和細胞免疫等相關免疫反應，增強巨噬細胞、中性粒細胞的抗感染能力，促使輔助性/抑制性T細胞比值恢復正常[20-21]。XU等[22]研究認為，輔助匹多莫德治療支原體肺炎可改善患者的炎癥反應和肺功能，增強免疫功能。

Nrf2/HO-1信號通路是機體內一條重要的細胞保護通路，參與調節氧化應激、炎癥和凋亡等多個生物學過程。Nrf2是該信號通路的核心轉錄因子，具有還原敏感性，可維持細胞內氧化還原穩態，在受到氧化應激或親電性物質的刺激時，從細胞質中解離出來，轉移至HO-1[23-24]。HO-1是一種血紅素加氧酶，可將血紅素降解為一氧化碳CO、膽紅素和游離鐵，從而發揮抗氧化、抗炎、抗凋亡和穩定血管的作用[25]。在MPI中，Nrf2/HO-1信號通路也起著重要作用。Nrf2和HO-1蛋白在肺組織中主要由Ⅱ型肺泡細胞分泌，Ⅱ型肺泡細胞是一種位于肺泡拐角處的立方形或球形細胞，具有合成、分泌肺表面活性物質的功能。Nrf2和HO-1蛋白可以保護肺泡細胞免受氧化應激和炎癥反應損傷，對預防和治療急性肺損傷等疾病有重要意義。支原體肺炎感染可導致肺組織產生大量的活性氧自由基，造成氧化應激損傷，Nrf2/HO-1通路可調節細胞內抗氧化酶和抗氧化物質的表達，清除活性氧自由基，維持氧化還原平衡，減輕氧化應激反應。支原體肺炎感染可激活細胞膜上的Toll樣受體4，啟動核轉錄因子κB信號通路，釋放炎癥因子，引發炎癥反應，而Nrf2/HO-1通路可以抑制該信號通路的激活，減少炎癥因子的表達，從而抑制炎癥反應。支原體肺炎感染可通過黏附、入侵、毒素等方式直接損傷肺泡上皮細胞，導致肺泡水腫和氣體交換障礙。Nrf2/HO-1通路可通過增加CO的生成，改善微循環，增加血流灌注，保護肺泡上皮細胞。有學者發現，Nrf2/HO-1信號通路活性在支原體肺炎中被抑制，激活該通路可有效減輕小鼠肺部炎癥反應，促進細胞增殖并抑制其凋亡[26]。本研究結果顯示，MPI小鼠經不同劑量匹多莫德干預后，肺組織Nrf2、HO-1蛋白相對表達量均升高，提示匹多莫德可能通過調節Nrf2/HO-1信號通路發揮對MPI小鼠的治療作用。

綜上所述，匹多莫德可能通過調節Nrf2/HO-1信號通路改善MPI小鼠肺功能及免疫功能，減輕氧化應激損傷。本研究仍存在一定不足及局限性，如研究中使用的小鼠數量較少，導致結果的可信度和推廣性受到限制，且由于小鼠和人類在生理和基因上存在一定差異，實驗結果可能不完全適用于人類，無法完全模擬臨床情況。未來研究應增加樣本量，以提高實驗的統計學能力和結果的可靠性，并逐步進行臨床隨機對照試驗，進一步觀察匹多莫德對MPI的影響。