抗氧化劑在家禽精液儲存中的應用研究進展

姜麗君,宗云鶴,李云雷,陳繼蘭,耿照玉,孫研研*,金四華*

(1.安徽農業大學動物科技學院,合肥 230036;2.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所 畜禽生物育種全國重點實驗室,北京 100193)

家禽是全球重要的農業資源,對家禽業可持續發展具有重要意義。然而,由于諸多因素,家禽種質資源正面臨持續損失的風險。為了避免這種災難性的損失,對種質資源的保護和利用技術的需求顯得尤為迫切。精液儲存是一種廣泛應用的方法,可以長期保存優質種質資源,保持遺傳多樣性,還可以用于提高優良種禽繁殖利用效率。然而,家禽精液在儲存過程中極易受到氧化損傷,導致精子質量下降和受精能力減弱。氧化損傷是由于自由基的生成超過機體抗氧化能力所引起的,它們具有高度反應性,可以直接或間接地對細胞結構和功能造成損害。

為了解決這一問題,研究人員開始探索外源添加抗氧化劑在家禽精液儲存中的應用。抗氧化劑是一類能夠中和自由基、抑制氧化反應的化合物,具有保護細胞免受氧化損傷的能力。維生素類、酶類、氨基酸類、植物提取物類抗氧化劑以及一些新型抗氧化產品被廣泛研究利用,以提高精子的儲存穩定性和質量。了解抗氧化劑在家禽精液儲存中的應用和效果對于提高家禽生產和繁殖的效率具有重要意義。本文旨在綜述現有的研究,以深入了解抗氧化劑在家禽精液儲存中的應用,評估其對精液質量和受精能力的影響,并探索優化策略,為進一步研究和應用提供指導和參考。

1 家禽精液特性與精子結構特征

家禽精子相比于哺乳動物更易受到氧化損傷,這是由家禽精液特性和獨特的精子結構特征所致。公雞的單次射精量較少,但精子密度卻很高,每毫升精液可達數十億個精子,這使得它成為單位體積精子密度最大的動物之一。在精液儲存中精子產生的過氧化物等代謝產物聚集,精漿緩沖能力有限。此外,與哺乳動物的扁卵圓形精子頭部不同,家禽精子是長圓柱形的,兩端呈錐形,頭部較哺乳動物要小很多,呈絲狀,與精子尾部直徑相似[1]。因此,家禽精子頭部具有較低的細胞質體積,只可以累積相對較低的冷凍保護劑,不足以在精液冷凍儲存中保護精子免受冷凍損傷。而且家禽精子頂體容易脫落,影響受精能力。家禽精子的尾部與哺乳動物相比非常長,約為頭部的8倍,精子的活動受到了很大阻礙,這使得精子在稀釋、冷凍和解凍過程中易斷裂,并且可能導致精子細胞的超微結構(特別是線粒體)受損[2]。與其他動物相比,家禽精子細胞質膜富含不飽和脂肪酸,極易發生脂質過氧化(lipid peroxidation,LPO),導致精子活力和受精能力的下降并對DNA造成不可逆的損害[3]。

2 家禽精子儲存及其氧化損傷

家禽精子儲存包括低溫保存和冷凍保存。4 ℃低溫儲存可抑制精子的代謝活動[4],有利于精液的短期保存和運輸。在精子低溫儲存中,最重要的一個變量就是儲存時間的長短。精液在低溫儲存的最初幾小時內并沒有發現顯著的有害效應[5]。隨著儲存時間延長,有害效應明顯。在火雞中,低溫儲存精液24 h,細胞內LPO的產物丙二醛(malondialdehyde,MDA)增加了3倍[6]。低溫儲存48 h,由于精液發生過氧化,會導致精子失去作為呼吸活性的最重要的細胞內底物游離膽固醇和磷脂[7]。精液在4 ℃儲存72 h后,總抗氧化能力(total antioxidant capacity,TAC)明顯下降[8]。并且在4 ℃低溫儲存過程中,隨著時間延長,精子的超微結構會出現嚴重受損,主要集中在質膜不完整、頂體破損和線粒體結構損傷[9],這些都可能是影響最終受精率的重要因素。

精液冷凍保存是指將精液經過適當稀釋和保護處理后,利用液氮(-196 ℃)等冷源將精子長期保存在超低溫的環境中,期間精子基本上不進行生命活動。精液冷凍技術實現了精液的長距離運輸和長時間保存,使需要的遺傳基因得以有效利用,利于珍稀瀕危物種的保護。家禽精液冷凍過程復雜,包括篩選公雞、精液采集、精液質量檢測、稀釋精液、添加冷凍保護劑、包裝、程序化冷凍、解凍、去除冷凍保護劑和解凍精子評估等關鍵步驟。在冷凍和解凍過程中,精子暴露在溫度變化的沖擊下,細胞膜發生結構的改變以及膜脂質和蛋白質的重組,從而引起滲透性改變[10]。氧化損傷是精液低溫和冷凍儲存過程中導致精子死亡的重要因素[11]。精子細胞和體內其他細胞一樣,依靠線粒體呼吸鏈式反應產生腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)。在線粒體呼吸過程中,電子通過由各種蛋白質復合物組成的電子傳輸鏈轉移。盡管電子傳輸鏈是高效的,但有一小部分電子可以從鏈中泄漏,泄漏的電子可以直接與環境中氧氣(O2)反應生成超氧陰離子(O2·-),最終形成活性氧物質(reactive oxygen species,ROS)[12]。此外,當細胞受到外來刺激時,會激活煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)氧化酶,在細胞膜上組裝形成NADPH氧化酶復合體,促進了依靠電子從細胞內的NADPH轉移到細胞外的O2產生O2·-,最終形成ROS[13]。正常生理情況下,ROS的產生在調節精子活動的許多方面是必需的,如精子的運動、獲能,精子-透明帶相互作用,頂體反應和精子-卵子融合等[14]。然而,過多的ROS卻會引起精子氧化應激,對精子造成損傷。ROS對精子的氧化損傷主要涉及LPO、蛋白質氧化和DNA氧化3個方面[15]。精子膜上富含多不飽和脂肪酸,ROS會攻擊細胞膜磷脂雙聯甲基組,膜脂質的過氧化及其鏈式反應造成精子細胞膜損傷[16];ROS影響蛋白氧化修飾從而引起精子中蛋白結構和功能的變化,進而降低精子的運動能力、受精率和孵化率,例如增加的ROS會減少軸絲蛋白的磷酸化,導致細胞膜流動性下降[16],繼而影響與卵母細胞結合;ROS可以直接作用于精子細胞核中的DNA分子,導致DNA的氧化損傷,影響精子的遺傳信息傳遞[17];ROS引起的精子線粒體DNA改變,將影響其編碼蛋白的正常合成,而這些蛋白可能是細胞中線粒體呼吸功能所必需的酶,其活性缺失導致精子活力下降[18]。

3 家禽精液抗氧化系統組成

精子和精漿內都具有一定抗氧化能力的物質,其主要作用就是通過清除ROS來保護精子細胞免受結構和功能損傷。這些物質構成了家禽精液中的抗氧化防御系統,主要包括許多相互作用的抗氧化劑,任何一個缺乏都會影響TAC[11]。主要酶類抗氧化系統包括超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GPx)和過氧化氫酶(catalase,CAT)[19]。3種抗氧化酶之間相互作用,形成一個協同的抗氧化防御系統(圖1)。SOD和GPx的相互作用:SOD主要負責將細胞內產生的O2·-轉化為過氧化氫(H2O2),而H2O2是一種中間物質;GPx則專門負責將H2O2和有機過氧化物轉化為無害的水和相應的醇。SOD和CAT的相互作用:SOD主要將O2·-轉化為H2O2,而CAT則負責催化分解H2O2為水和O2。因此,SOD和CAT共同參與了O2·-的清除和H2O2的分解過程。不僅僅是酶類抗氧化劑在精液中起保護作用,天然抗氧化物質如維生素E(vitamin E,VE)、維生素C(vitamin C,VC)和GSH(glutathione,GSH)等在減少精子氧化應激損傷上也起到很大作用。VE是一種脂溶性維生素,它能夠捕捉和中和自由基。而且VE對線粒體磷脂以及網狀組織磷脂等有很強的親和力,與細胞膜上的磷脂結構相結合,可阻止LPO反應的發生從而保護精子[20]。VC是水溶性維生素,可直接消除ROS,也可間接促進其他抗氧化劑的再生,增強其抗氧化能力。GSH是細胞內含有巰基的非蛋白化合物,屬于一種三肽,它通過巰基發揮抗氧化作用[21],在細胞內參與清除自由基、減少氧化應激和保護細胞免受氧化損傷。

SOD.超氧化物歧化酶;GPx.谷胱甘肽過氧化物酶;CAT.過氧化氫酶;GSH.谷胱甘肽;GSSG.氧化型谷胱甘肽SOD. Superoxide dismutase; GPx. Glutathione peroxidase; CAT. Catalase; GSH. Glutathione; GSSG. Oxidized glutathione

抗氧化防御系統中抗氧化酶活性和含量存在物種特異性差異。例如,與人、綿羊、公牛和兔子等哺乳動物相比,雞精子中SOD活性最低[23]。在家禽中比較,鵝、雞和火雞精子中的SOD活性依次降低,而水禽精漿中的SOD活性要低于火雞[24-26]。不僅如此,精子和精漿中SOD分布也不一致,雞和火雞精子中SOD含量高于精漿中SOD含量[11]。火雞精漿中GPx活性高于鴨和鵝,而鵝精子和精漿中的GPx含量卻高于雞[25]。對于CAT的活性和含量關系,雞精液中CAT活性尤其是精子細胞中的CAT活性低于鵝精液,而鵝精漿中的CAT含量高于公雞[25]。在外來和本土印度雞品種之間,CAT活性水平也存在差異[27]。總之,在家禽精液中,高抗氧化酶活性和高水平LPO表明精子處于氧化應激中,而這些酶并不能完全保護精子免受結構和功能損傷。在冷凍保存過程中,雞精液中CAT、GPx和SOD的活性和含量也都受會到影響。有研究表明,在雞精液低溫保存過程中,精漿中的CAT減少了約14%[28]。也有研究發現,雞精液冷凍保存過程中精子中的SOD活性下降,但精漿中的SOD活性卻在增加[11]。相反,GPx在精漿中的活性較高,但在精子中沒有變化[28]。然而,Nguyen等[16]卻持不同觀點,指出冷凍保存時精子中SOD和GPx活性顯著下降,但CAT活性沒有顯著變化。冷凍狀態下精子和精漿中抗氧化酶活性變化不同,這可能與它們的生理特性和應激響應有關。不同物種精液中其他物質含量也具有特異性。雞精子中VE含量為0.25 μg·10-9精子,精漿中為0.074 μg·10-9精子[29],雞精液的VE水平高于鴨精液。在雞精液中,VC幾乎均勻分布在精子和精漿中,其濃度是VE的100倍,GSH的濃度比VC少2.5倍[30]。不同物種精液抗氧化系統的組成差異可能與其精液儲存過程中的抗氧化水平相關。

Bréque等[31]進一步總結了家禽精液中高效的抗氧化防御系統的3個層面:SOD與GPx和與金屬相關的蛋白質共同構成了第一道防線,負責防止自由基的形成;天然抗氧化劑(VC、VE、GSH和類胡蘿卜素等)與GPx結合,構成第二道防線,防止和限制過氧化物的產生和擴散;多種酶如磷脂酶、蛋白酶、轉移酶組成了第三道防線,負責修復和清除精子細胞膜中的損傷。

4 抗氧化劑及其在家禽精液儲存中的添加效果

研究已明確了精液儲存過程中的氧化應激對精子受精能力存在負面影響。在精液儲存過程中,可在介質中添加額外的抗氧化劑來克服氧化應激的影響。抗氧化添加劑基本可以分為維生素類抗氧化劑、酶類抗氧化劑、氨基酸類抗氧化劑、植物提取物類抗氧化劑和新型抗氧化劑。其不同抗氧化劑對家禽精液的作用效果各不相同(表1)。

表1 雞精液儲存過程中抗氧化劑添加效果

4.1 維生素類抗氧化劑

VE、VC、煙酸和輔酶Q10是精液儲存時常見的維生素類抗氧化劑。Bréque等[31]發現飼糧補充VE可以有效限制雞和火雞精子質膜發生過氧化。大量的研究也表明,在稀釋液中添加適量的VE能夠有效改善精子質量[29,32-33],并且可以提高雞精子膜完整性和存活率[34]。Blesbois等[29]也指出低溫儲存時補充8 μg·mL-1VE盡管不能改善雞精子運動能力,卻能顯著提高受精率。也有研究發現,補充VE并不會減少火雞精液中的LPO[6],這可能由于品種間差異產生的。還有研究發現,VE通過和硒結合,可以顯著改善精子活力,并增強GPx和CAT的活性[35-36],因此,抗氧化劑和其他物質結合添加或許能加強抗氧化劑對家禽精液保存的效果。有研究發現,在冷凍保存的雞精子中添加VC可以提高精子存活率[32]。Tabatabaei[37]也發現,在稀釋液中添加10 mg·mL-1VC能夠明顯降低精子畸形率。輔酶Q10是唯一已知的動物細胞可以從頭合成的脂溶性抗氧化劑,并且存在酶機制,可以從其氧化形式中再生抗氧化劑。Masoudi等[38-39]發現,不管是低溫保存還是冷凍保存雞精液,輔酶Q10都能改善精子質量,降低LPO,提高受精率,對于雞精液低溫保存,5 μmol·L-1輔酶Q10的效果更好,而1和2 μmol·L-1輔酶Q10 對冷凍保存改善的效果更好。煙酸是維生素B3的一種形式,參與能量代謝和細胞生長。有研究表明,添加煙酸處理后的綿羊精子存活時間可以延長至120 h,能有效提升綿羊精子質量和低溫保存效果[40]。然而其是否也能有效改善家禽精子質量還需要進一步研究。

4.2 酶類抗氧化劑

酶類抗氧化劑主要包括CAT和SOD。CAT廣泛存在于動植物以及微生物中,其酶促反應為機體提供了抗氧化能力。研究發現,在冷凍保存的雞精液中添加CAT可以改善公雞精液解凍后的質量[41]。Amini等[42]也發現,補充100 μg·mL-1CAT能提高精子的運動能力和存活率,并且MDA含量也顯著降低。SOD催化O2·-轉化為較穩定的O2和H2O2,減少其對精子的有害作用。精液中SOD的含量與精子的活力呈正相關[43]。也有研究表明,添加適量SOD能提高精子運動能力,改善精子質量[32],減少精子質膜中的LPO[44]。

4.3 氨基酸類抗氧化劑

GSH、左旋肉堿(L-carnitine,LC)和半胱氨酸是在精液儲存時常見的氨基酸類抗氧化劑。研究結果表明,添加2或4 mmol·L-1GSH會使得低溫儲存中家禽精子有更高的運動能力[45]、頂體完整率和受精率,并且還能降低精子LPO[46-47]。Izanloo等[8]指出,添加1 mmol·L-1GSH可增加CAT、SOD和GPx活性和TAC。不僅如此,最新研究指出0.4 mmol·L-1GSH能顯著提高精子運動能力、質膜完整性和頂體完整性,并且顯著改善DNA完整性[48]。然而,Donnelly等[49]發現添加GSH對精子運動能力和DNA完整性沒有顯著影響,盡管如此,GSH仍然可以顯著減少H2O2誘導的ROS產生,對精子提供保護作用。因此,對于抗氧化劑GSH改善精子各參數的情況和其最適添加劑量還需進一步研究。LC是一種氨基酸衍生物,由賴氨酸和甲基化的組氨酸組成。它在能量代謝和抗氧化過程中起著關鍵的作用。LC的抗氧化特性包括清除自由基,破壞H2O2和金屬螯合[50]。研究指出,LC能顯著提高精子運動能力、存活率、膜完整性、線粒體活性和受精率[51],并且顯著降低精子畸形率[52]和LPO[53],冷凍精液時最適添加濃度為1～2 mmol·L-1。半胱氨酸是一種天然氨基酸,屬于含硫非必需氨基酸,極易被氧化還原成胱氨酸,具有一定的抗氧化性。半胱氨酸參與GSH的合成過程,為細胞提供足夠的GSH,從而增強細胞內的抗氧化能力[54]。因此,半胱氨酸在精液冷凍保存過程中,可以保護精子質膜免受氧化損傷[21]。相關研究也證實了這一點,添加半胱氨酸增加了精子運動能力和線粒體活性[44]。Sari?zkan等[55]研究表明,添加半胱氨酸可以改善精子頂體損傷率,并且其SOD活性顯著提高。不僅如此,半胱氨酸的衍生物N-乙酰-L-半胱氨酸(N-Acetyl-L-cysteine,NAC)也可以提高低溫儲存后的精子運動能力和存活率[56]。Partyka等[44]指出,5 mmol·L-1NAC可以顯著保護冷凍后雞精子的功能。其它氨基酸抗氧化劑如谷氨酰胺和絲氨酸,也被證實可以保護精子[57-58]。

4.4 植物提取物抗氧化劑

植物提取物中含有豐富的抗氧化成分,如多酚類、類黃酮、維生素等。多項研究已經探索了不同植物提取物在家禽精液儲存中的應用效果。槲皮素是一種天然的黃酮類化合物,屬于植物次生代謝產物。槲皮素對O2·-、過氧基和羥基自由基具有很強的清除活性[59]。與VC和VE相比,槲皮素具有較高的抗氧化活性和較低的細胞毒性,可以通過抑制細胞膜上依賴鈣調素的酶活性,如ATP酶和磷脂酶,影響細胞膜的通透性[60]。它廣泛存在于許多水果、蔬菜、谷物、草藥和茶葉中。研究表明,添加槲皮素可以顯著改善凍后精液各參數指標,Rakha 等[60]認為15 mmol·L-1槲皮素可以顯著改善冷凍保存后精子的運動能力、線粒體活性、頂體完整性和膜完整性。Siari等[61]指出添加10 mmol·L-1槲皮素能改善凍后精子質量并且能降低精子的LPO損傷。Appiah等[62]卻指出添加0.01 mg·mL-1槲皮素能更好地改善精子各項參數指標。各研究其最適添加濃度不一致,這在很大程度上是受動物品種和品系的影響。番茄紅素是一種親脂性類胡蘿卜素,其抗氧化特性能改善精子質量。研究已報道一定濃度的番茄紅素對秦川牛精子在冷凍過程受到的結構損傷和繁殖性能降低具有良好的保護作用[63]。番茄紅素能夠最大限度地減少雞精子LPO和DNA完整性的損失,并在一定程度上挽救雞精子的結構損傷,維持精子活力[64],這與Mangiagalli等[65]的研究結果一致。白藜蘆醇是一種天然產生于植物中的多酚類化合物。它能有效抑制蛋白質氧化和LPO,因其具有消除多種含有羥基和O2·-的ROS的潛力。在家禽精子培養基中補充白藜蘆醇的有益作用已被報道,Najafi等[66]指出添加40 μmol·L-1白藜蘆醇可以提高冷凍解凍后公雞精子的質量,具有更高的TAC和更低的MDA,然而,精子的形態特征和SOD含量不受白藜蘆醇劑量的影響。另一項研究還表明,白藜蘆醇可能是通過增加腺嘌呤核糖核苷酸(adenosine monophosphate,AMP)激活的蛋白激酶磷酸化來改善精子質量的[67],這還需大量研究驗證。喻宗崗等[68]研究表明不同劑量白藜蘆醇不會顯著改善精子活力和降低LPO程度,但卻能顯著改善精子的線粒體膜電位。不僅如此,20 μg·mL-1生姜提取物能夠顯著改善低溫儲存時雞精子活力和運動能力,維持DNA完整性[69]。這可能是因為生姜中姜黃素的抗氧化效果[70]。另一項研究表明,咖啡因對火雞精子的一些參數有積極的影響,一系列濃度(0.16～7.5 mg·mL-1)的咖啡因可顯著提高低溫保存精子的活力,并具有提高受精率的潛力[71]。

4.5 其他抗氧化劑

除了上述常見的抗氧化劑,還有很多具有抗氧化效應的物質也在研究的范圍內。研究發現,石榴皮中多酚類化合物具有可以保護低溫儲存48 h的雞精子免受氧化損傷的潛在能力[72],這與Sadeghi等[5]的研究結果一致。褪黑素可以保持線粒體的完整性,中和ROS的毒性。Mehaisen等[27]指出,褪黑素可以降低精液中的LPO,提高精子DNA完整性和精子活率,這與Yan等[73]的研究結果一致。Appiah等[74]的研究也表明,褪黑素可以通過降低氧化應激水平,提高冷凍雞精液的質量,且其最佳濃度為0.25 mg·mL-1。Nogueira等[75]還指出,單獨添加褪黑素或者聯合添加褪黑素和輔酶Q10都會降低馬精液中的LPO,抗氧化劑之間的協同效應還需要進一步探索。

線粒體靶向抗氧化劑等新型抗氧化劑在家禽精液儲存中備受關注。線粒體靶向抗氧化劑是一類具有特定結構或載體的化合物,能夠進入線粒體并在其內部發揮抗氧化作用,包括MitoQ和Mito-TEMPO等。它們具有不同的化學結構和作用機制,但都具有針對線粒體的抗氧化特性[76]。Mito-TEMPO是一種由四甲基哌啶氧化物與三甲胺基乙醇結合而成的化合物。Kumar等[77]指出,補充Mito-TEMPO能降低精子的冷凍損傷。研究表明,添加5和50 μmol·L-1Mito-TEMPO能顯著改善低溫儲存和冷凍儲存家禽精子的膜功能、線粒體活性、頂體完整性、存活率和受精率[78]。最新研究還指出Mito-TEMPO能降低家禽精子的LPO[79]。MitoQ是一種由輔酶Q10與三乙胺基甲基苯酚結合而成的化合物。三乙胺基甲基苯酚的作用是使MitoQ能夠靶向線粒體,并通過其親脂性質進入線粒體內部。Nazari等[80]也指出,MitoQ能提高家禽精子的膜完整性、存活率、TAC和GPx活性,減少冷凍對精子的損傷。研究表明,150 nmol·L-1MitoQ不僅能通過恢復ATP水平和防止膜損傷來改善解凍后的家禽精子質量和運動參數,還能降低家禽精子過氧化水平和精子凋亡程度[81]。

納米結構脂質載體(nanostructured lipid carriers,NLC)雖然不是抗氧化劑,但是因其可以保護藥物免受降解和氧化作用,增強藥物穩定性;提高藥物溶解度和滲透性;靶向給藥,降低副作用;制備方法簡單等優點,它與抗氧化劑組合使用可以提升抗氧化劑的效用,使其成為當前精液儲存研究中備受關注的一種可以降低精子氧化損傷的方法。Najafi團隊通過NLC遞送α-硫辛酸[82]、白藜蘆醇[66]和γ-谷維素[83]作用于家禽精液冷凍儲存,研究結果顯示NLC可以通過增強藥物的抗氧化作用來改善公雞精子解凍后的質量。使用NLC載負30 μmol·L-1的α-硫辛酸可顯著降低細胞凋亡率和活化的caspase-3基因表達,提高受精率;NLC載負40 μmol·L-1白藜蘆醇可以顯著降低MDA含量和提高TAC;NLC載負60和80 μmol·L-1的γ-谷維素能夠更好的提高解凍后精子質量。這些結果都暗示著NLC結合抗氧化劑在精液儲存上有非常大的應用潛力。

5 展 望

由于精子低溫生物學特性差異,家禽精液儲存技術的發展水平和應用不如哺乳動物。在這篇綜述中介紹了當前抗氧化劑在家禽精液儲存中應用效果的研究進展。盡管部分抗氧化劑顯示出了明顯的保護效果。然而,家禽精液儲存技術仍然存在許多挑戰和未知領域,需要進一步深入研究。首先,不同種類的抗氧化劑在精液中的作用機制和效果尚不完全清楚,需要深入的研究來解析其作用途徑。其次,抗氧化劑的添加劑量對精液質量的影響仍需要進一步的優化和研究。此外,精液儲存條件和時間的優化以及抗氧化劑與其他輔助劑的協同效應也是需要探索的方向。另外,長期效果評估對于抗氧化劑的應用和實際儲存中的可行性至關重要,現今大部分研究的周期不是很長,無法確保抗氧化劑對精液長期儲存的影響,還需要加強長期應用效果的研究,確保其在精液儲存中的應用是安全可靠的。