線粒體自噬調控哺乳動物胚胎發育的研究進展

李鈺浚,何翃閎,楊麗雪,楊小耿,李 鍵,張慧珠

(1.青藏高原動物遺傳資源保護與利用教育部重點實驗室,成都 610041;2.西南民族大學畜牧獸醫學院,成都 610041;3.西南民族大學青藏高原研究院,成都 610041)

生物體都在不斷地持續更新,通過將細胞以及細胞內的成分進行重塑和回收,用質量更好的新產物取代受損衰老的舊成分,生物體內的自噬過程即是如此。自噬是一個進化保守的過程,在生理和病理條件下維持細胞的平衡中發揮著重要作用[1]。自噬是細胞內成分溶酶體降解過程的總稱,這個過程只存在于真核細胞中。根據哺乳動物細胞內底物轉運到溶酶體的方式不同,可將自噬分為3種主要類型:巨自噬、微自噬和伴侶介導的自噬[2]。每一種自噬的發生都有其獨特的機制,并且會受到各種相關因子的影響和細胞信號的調節。

細胞中的線粒體是能量產生、基本生物分子合成和細胞命運決定的中心[3]。在哺乳動物的生長發育過程中,不免會受到疾病或某些自身原因的影響,導致機體產生損傷,面對這些損傷,機體會自身進行修復,因此線粒體會面臨巨大的挑戰,比如氧化應激和線粒體DNA損傷,線粒體均需要通過選擇性自噬的形式進行降解。線粒體自噬從類型上來說屬于巨自噬,巨自噬主要來源于內質網、線粒體、高爾基體或質膜等的雙層膜結構延伸,將受損的細胞器與健康的細胞器分離形成自噬體,最終自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體,通過溶酶體對蛋白進行降解[4]。當細胞處于不利的環境下,消除過多或受損的線粒體以維持細胞穩態,減輕細胞運行的壓力,線粒體自噬被認為在其中起主要作用[5]。簡而言之,線粒體自噬就是指線粒體在受損或某些發育條件下的選擇性自我消除[6]。

線粒體是卵母細胞中最突出的細胞器之一[7]。據報道,自噬在卵巢原始卵泡儲備的維持和調節中起著重要作用,如果將自噬相關基因敲除會導致原始卵泡和卵母細胞的減少[8]。在大多數哺乳動物的有性生殖中,精子為受精的卵母細胞提供DNA和中心粒,也就是說在受精的過程中,精子會攜帶自噬調節基因進入卵母細胞,同卵母細胞一起通過線粒體自噬促進早期胚胎發育[9-10]。此外,還有研究發現,缺氧條件下,胎兒生長受限(fetal growth restriction,FGR)胎盤和CoCl2處理的滋養層細胞的mtDNA含量明顯降低,阻礙了早期胚胎的生長發育,但mtDNA的降低會增強線粒體自噬,可以使得胚胎發育受阻得到緩解[11-13]。因此,研究線粒體自噬在哺乳動物卵母細胞和胚胎發育過程中的調控機制對提高卵母細胞成熟率、早期胚胎的發育能力以及哺乳動物的繁殖性能具有十分重要的意義。本文主要綜述了線粒體自噬的生物學功能,線粒體自噬的相關因子調控以及線粒體自噬在哺乳動物生殖中的作用機制,為進一步研究線粒體自噬對哺乳動物繁殖的作用機制提供參考依據。

1 哺乳動物線粒體自噬及其功能

1.1 線粒體自噬

線粒體是真核細胞進行有氧呼吸的主要部位,是一個特殊的細胞器,在細胞代謝中發揮著重要作用,并且關系著細胞的存活與凋亡,維持細胞穩態[14]。自噬,是一種高度保守的過程,通過降解錯誤折疊、受損和過量的蛋白質、無功能細胞器、外來病原體和其他細胞成分來維持其體內平衡。它既是可選擇性的,也可以是非選擇性的,一般通過被降解的細胞成分不同用來區分選擇性與非選擇性[15-16]。線粒體自噬屬于選擇性自噬的一種,它可以通過自噬體選擇性地識別、隔離和降解特定靶標,通過降解異常或過量的線粒體來維持細胞穩態[17]。線粒體自噬是一種中樞穩態機制[18],正常生理條件下,線粒體通過質量控制系統的穩定運行,有效地保護線粒體免受應激和損傷,而當線粒體發生損傷時,線粒體通透性轉換孔(mitochondrial permeability transition pore, MPTP)會隨之開放,線粒體外膜膜電位丟失,激活線粒體自噬,開始啟動調節線粒體質量降解損傷的線粒體,使線粒體恢復原始的狀態或將其消除[19-20]。線粒體自噬在決定卵母細胞的發生發展過程中起著十分重要的作用,卵母細胞中的大部分線粒體缺乏膜電位[21],在發育的過程中這部分線粒體可能被誤認為是受損線粒體而被降解,從而影響卵母細胞中線粒體的數量,導致細胞功能障礙,最終影響胚胎的發育,而線粒體自噬可以選擇性地清除受損的線粒體,恢復受損細胞的功能,保證卵母細胞和胚胎的正常發育。線粒體自噬的發生也受許多相關因素的影響,線粒體的數量變化、形態變化以及膜電位變化等異常現象都可能會導致線粒體自噬的發生,自噬激活后,對異常線粒體進行修復或者清除,維持穩態。此外,細胞所處環境的改變也可能會導致線粒體自噬的發生[22],某種程度上來說線粒體自噬就像人體的極限反應,以對抗生存受到的挑戰,例如機體面對病毒和細菌的感染時會立即作出反應,線粒體自噬亦是如此。

1.2 線粒體自噬在哺乳動物生殖發育過程中的功能

線粒體自噬實際上是起著一種保護作用,受損的線粒體通過自噬被溶酶體降解,對機體的各種刺激產生反應,使機體更好地運行。有研究發現,由于線粒體自噬與線粒體衍生的囊泡和線粒體動力學在維持細胞穩態中的相互作用,所以線粒體自噬與其他用于線粒體質量控制的保護途徑之間的協同作用對于線粒體的功能穩態很重要[23]。近期研究發現,對熒光標記線粒體的細胞進行成像,觀察到了線粒體從細胞釋放到細胞外空間,大多細胞外線粒體是游離形式的,少數被包圍在囊泡中,研究結果表明細胞外線粒體釋放是一種與線粒體自噬相當的質量控制新途徑[24],有助于線粒體質量控制系統的穩定運行,與線粒體自噬共同維持線粒體穩態。綜上,正常情況下,線粒體可使得質量控制系統平穩運行,但當線粒體發生損傷時,線粒體自噬被激活,形成的自噬體能夠選擇性的包裹住受損的線粒體,改變線粒體的通透性,使線粒體外膜膜電位下降,線粒體外膜上的配體蛋白不斷募集受體蛋白,二者結合后完成線粒體自噬。

線粒體通過感知和響應細胞環境作為許多代謝過程的中心樞紐。所以機體生長發育過程中的細胞分化與組織發育都與線粒體自噬有關。有研究發現,在卵子產生的早期階段,可以通過線粒體自噬去除異常的線粒體。形成卵母細胞后,自噬調節因子會繼續存在于卵母細胞中,卵母細胞周圍的顆粒細胞可以通過線粒體自噬進一步改善線粒體功能,從而提高卵母細胞的發育能力[25]。此外,還有研究發現,線粒體自噬與父系線粒體的清除作用有著密不可分的關系,因為幾乎大多數哺乳動物的線粒體DNA都是由母系遺傳,精卵結合形成胚胎后,其線粒體幾乎都來源于卵母細胞[26],父系線粒體及其mtDNA在胚胎中經線粒體自噬被選擇性降解,從而對機體進行發育調控[27-28]。自噬對哺乳動物體細胞的發育也起著重要作用,抑制自噬會導致核移植胚胎效率降低[29]。總之,線粒體自噬時刻調節著細胞的穩態,在雌性生殖中尤其是卵母細胞發育過程中是不可缺少的一個生命過程。

2 線粒體自噬調控哺乳動物卵母細胞和早期胚胎發育的相關因素

在細胞缺氧情況下,功能失調的線粒體通過線粒體自噬選擇性地去除。ER-線粒體接觸位點(mitochondrial-associated ER membranes,MAM)與吞噬前線粒體的裂變存在著十分重要的聯系[30-31]。有研究發現,FUN14結構域蛋白1(FUN14 domain-containing 1, FUNDC1)是一種新型MAM蛋白,通過與缺氧細胞中的ER膜蛋白鈣連接蛋白相互作用而積累在ER-線粒體接觸位點,并且在線粒體整個裂變過程中充當線粒體分裂蛋白(dynamin-related protein 1,DRP1)的接頭,同時還參與缺氧誘導的線粒體自噬,哺乳動物細胞在缺氧條件下FUNDC1通過與DRP1和鈣連蛋白協同工作,在MAM的界面上整合線粒體裂變和線粒體自噬[32-33]。泛素特異性蛋白酶19(ubiquitin specific peptidase19,USP19),是一種ER駐留的去泛素酶[34],在缺氧條件下,會積聚在ER-線粒體接觸部位并促進缺氧誘導的線粒體分裂。為了響應缺氧,USP19在ER-線粒體接觸位點與FUNDC1結合并去泛素化,使DRP1寡聚化與DRP1三磷酸鳥苷結合,將水解活性提高[35],促進線粒體分裂,進而促進線粒體自噬的發生[36-37]。根據USP19影響FUNDC1的MAM定位試驗發現,USP19是 MAM 中 FUNDC1積累所必需的[35]。綜上所述,FUNDC1是一種關鍵的缺氧誘導的線粒體自噬受體[38],并且FUNDC1作用的發揮離不開USP19的協助,因此FUNDC1和USP19對于高原哺乳動物的生長繁殖具有十分重要的作用,二者共同促進哺乳動物機體線粒體自噬的運行,保證卵母細胞和早期胚胎的正常發育,對哺乳動物的生長繁殖起著積極的作用。

間隙連接蛋白43(connexin-43,CX43)是間隙連接的一個組成部分,是哺乳動物細胞中分布最為廣泛的間隙連接蛋白之一。CX43功能性的缺乏可能會誘導體細胞的氧化應激、自噬和凋亡。有研究對豬單性生殖器中進行CX43敲低,發現顯著降低了囊胚發育速率和囊胚中的細胞總數[39]。因此CX43通過調節早期胚胎的線粒體自噬、膜通透性、活性氧(reactive oxygen species,ROS)生成和細胞凋亡來維持線粒體功能和細胞穩態,保證早期胚胎的正常發育。

2-巰基乙醇(2-mercaptoethanol,2-ME)是一種有機硫化合物,經常作為一種抗氧化劑,可維持細胞增殖、分化和生長[40]。最近有研究通過探討2-ME對暴露于自噬激活劑(雷帕霉素)或自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)中的豬卵母細胞在體外成熟的影響,發現2-ME通過降低表現出異常自噬卵母細胞的自噬活性來提高卵母細胞成熟的質量,并且改善了3-MA和雷帕霉素暴露對卵母細胞胚胎發育的影響[41]。此研究進一步證實了2-ME可以維持自噬穩態,促進豬卵母細胞成熟和早期胚胎發育。

17β-雌二醇是一種內源性激素,可以改善卵母細胞成熟及胚胎的發育[42]。此外,17β-雌二醇還是一種抗氧化劑,可以降低ROS水平,改善線粒體功能。有研究發現,采用17β-雌二醇調節經自噬抑制劑處理的豬卵母細胞,結果顯示17β-雌二醇能促進成熟卵母細胞的自噬,阻斷自噬抑制的發生,并且17β-雌二醇還改善了自噬抑制劑誘導的高ROS水平、線粒體分布異常的現象,降低了成熟卵母細胞的凋亡率[43]。此研究證實了17β-雌二醇可以增強自噬,降低ROS水平和體外成熟凋亡活性,在卵母細胞成熟發育過程中起著重要的調控作用。

綜上所述,在哺乳動物卵母細胞和早期胚胎發育過程中,MAM蛋白FUNDC1和USP19二者共同促進機體線粒體自噬的運行。CX43可以調節早期胚胎的線粒體自噬,維持線粒體的功能和細胞穩態。有機硫化合物2-ME可以降低表現出異常自噬卵母細胞的自噬活性。內源性激素17β-雌二醇可以增強自噬,降低ROS水平和卵母細胞體外成熟凋亡活性。所有的相關因素發揮著各自不同的作用,共同促進卵母細胞的成熟和早期胚胎的發育,保證哺乳動物生殖發育過程的穩定運行。

3 線粒體自噬在哺乳動物生殖調控中的作用機制

在哺乳動物的生殖發育過程中,有多種途徑引發線粒體自噬從而對其生殖過程進行調節。發揮線粒體自噬的最佳研究途徑是PTEN誘導假定激酶(PTEN induced putative kinase 1, PINK1)-Parkin途徑,但是越來越多的研究表明有替代途徑的存在,其中不同的蛋白質和脂質能夠獨立于PINK1-Parkin的非依賴性線粒體自噬機制[44-48]。無論是哪種途徑引發的線粒體自噬都會受到各種受體的調節,并且每種途徑作用的部位和反應的生理病理過程也不盡相同。

3.1 PINK1-Parkin途徑

PINK-Parkin通路是線粒體自噬途徑中最重要的通路之一,也被認為是最成熟的介導哺乳動物線粒體自噬的機制[49]。當線粒體衰老或發生功能障礙時,為維持細胞的正常運轉,細胞會將功能異常的線粒體通過線粒體激酶 PINK1 依賴的自噬途徑清除。PINK1是一種絲氨酸/蘇氨酸泛素激酶,Parkin是一種E3泛素連接酶,在線粒體受到損傷后,PINK1和Parkin會協同作用,特異性靶向受損線粒體被自噬體吞噬,從而進行溶酶體降解[50-51]。PINK1主要位于哺乳動物細胞的線粒體內膜中,作用于Parkin的上游[52],整個途徑的發生過程如下[53-57]:PINK1首先在受損線粒體上形成二聚體,絲氨酸228(serine228,Ser228)在二聚化的PINK1中通過分子間自磷酸化進行磷酸化,然后Ser228磷酸化穩定并將“插入”固定在正確的位置,泛素進而被PINK1識別為真正的底物,泛素、絲氨酸65(serine65,Ser65)殘基通過腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)水解磷酸化,磷酸化的泛素被釋放,線粒體外膜上的泛素鏈裝配并促進線粒體自噬受體的募集,進而被自噬體捕獲而降解。此外,還有研究發現,使用基因和抑制劑敲低PINK1會顯著損害囊胚的形成和發育質量,誘導線粒體伸長和腫脹,引起線粒體功能障礙、氧化應激和ATP缺乏,使細胞凋亡顯著增加[58]。濾泡閉鎖是哺乳動物卵巢中常見的現象,會破壞99%以上的卵巢卵泡,氧化應激誘導的顆粒細胞損傷與濾泡閉鎖的發生之間存在密切的相關性。有研究發現,經促卵泡素(follicle-stimulating hormone,FSH)處理后,氧化應激引起的顆粒細胞活力喪失顯著降低,這與氧化應激時線粒體自噬的激活受損有關[59-60]。FSH抑制了氧化應激期間絲氨酸/蘇氨酸激酶PINK1的誘導,主要原因是抑制了E3泛素連接酶Parkin的線粒體易位,并最終通過線粒體自噬殺死損傷細胞。還有研究發現,FSH通過靶向PINK1-Parkin介導的線粒體自噬來保護顆粒細胞免受氧化損傷,從而保證卵母細胞的正常發育[61-62]。綜上所述,PINK1-Parkin途徑在哺乳動物生殖過程中起著重要的調控作用。

3.2 FOXO3a途徑

FOXO3a是由FOXO3a基因編碼的人類蛋白質,屬于叉頭轉錄因子FOXO亞家族的成員,也稱Forkhead box O3或 FOXO3。其介導多種細胞過程[63],包括細胞的凋亡和增殖、氧化應激、DNA損傷和腫瘤的發生[64-67]。隨著對線粒體自噬研究的深入,現有研究已證明FOXO3a介導的線粒體自噬在調節癌細胞[65]、改善動脈粥樣硬化[68]、調節脂肪細胞炎癥[69]、減弱心肌細胞凋亡[70]等方面發揮著重要作用。最近的研究發現,FOXO3a通過參與調節哺乳動物卵母細胞生長發育的線粒體自噬,影響卵母細胞的質量[71]。FOXO3a是白藜蘆醇的下游信號分子之一,白藜蘆醇可以增加FOXO3a的表達,但當FOXO3a的表達受到抑制時,線粒體的功能和卵母細胞的質量都會受到顯著影響[72-74]。還有研究發現,成熟培養基中補充白藜蘆醇,可以增加青春期前山羊卵母細胞的囊胚產生[75]。根據上述結果不難發現,FOXO3a也是參與線粒體自噬調控的途徑之一,并且白藜蘆醇可以通過激活線粒體自噬來改善卵母細胞的衰老以及參與早期胚胎的發育,進而提高卵母細胞的發育能力。

4 展 望

線粒體自噬是一個隨著哺乳動物機體自身內環境改變而發生的動態過程,當線粒體發生損傷或存在缺陷時會被選擇性的清除。線粒體自噬在許多過程中起著重要作用,線粒體自噬的缺乏或過度都會影響到卵母細胞發育、早期胚胎發育、細胞分化、炎癥和細胞凋亡[76]。因此如何控制線粒體自噬的發生需要進一步的深入研究。目前,關于線粒體自噬的機制研究大多集中于PINK1-Parkin途徑,而對于其他途徑的研究有待進一步深入,并且基于現有途徑的基礎上發現新的途徑,從而解決目前已知途徑中未能進一步深入的問題。此外,國內外對于線粒體自噬領域的研究大多集中于人[77]和鼠[78],且研究的內容多為帕金森病[62]、癌癥[79]、病毒病[44]和衰老[80]等。雖有研究發現了豬卵母細胞和早期胚胎發育以及山羊卵母細胞的發育受線粒體自噬的影響,但關于牛、牦牛和藏豬的該領域研究未見報道,未來在該領域的研究可以從上述的哺乳動物中進行深入。根據目前國內外所有關于線粒體自噬對于哺乳動物生殖方面影響的研究,不難發現哺乳動物的線粒體自噬在生殖方面存在著巨大潛力,并且在疾病防控方面也發揮著重要作用。因此,深入研究哺乳動物線粒體自噬在生殖方面的作用對于提高哺乳動物的繁殖率具有重大應用價值。