常山散對雛雞感染柔嫩艾美耳球蟲不同發育階段的防治效果

王 賀,郭志廷,李建喜,張景艷,王 磊,張 康,孫繼文,尚小粉,馬永華*

(1.甘肅農業大學動物醫學院,蘭州 730070;2.中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所,農業農村部獸用藥物創制重點實驗室,甘肅省中獸藥工程技術研究中心,蘭州 730050)

球蟲病是雞最常見的腸道寄生蟲病,對全世界養雞場造成巨大危害,嚴重影響雞場經濟效益。柔嫩艾美耳球蟲作為致病力和毒性最強的球蟲[1-2],重癥感染病雞剖檢會發現一側或兩側盲腸嚴重腫大,盲腸內充滿大量血液或帶有腸芯[3-4];柔嫩艾美耳球蟲屬于宿主特異性的胞內寄生蟲,主要寄生在雞盲腸隱窩上皮細胞[5],可造成盲腸黏膜損傷,上皮細胞腫脹、壞死崩解和脫落[6],從而阻礙腸道對于養分的吸收影響機體的新陳代謝[7],導致血痢、體重減輕,甚至死亡。目前,在飼料中添加抗球蟲藥物是防治雞球蟲病的主要方法。其中,應用廣泛的為一些聚醚類離子載體抗生素和化學合成藥物抗球蟲飼料添加劑[8],但是耐藥性的產生[7],使得這些藥物治療或預防效果降低,且存在藥物殘留影響食品安全[9]。艾美耳球蟲幾乎對所有已知的抗球蟲藥物產生耐藥性。由于艾美耳球蟲感染可產生較強免疫反應,疫苗接種成為預防球蟲病的有效方法之一[7-8],但疫苗可能引發嚴重的出血性反應或吸收障礙[9-13]。中草藥具有耐藥風險低、安全、副作用小等優勢[14-15],逐漸成為消費者追求的主流產品[16]。研究表明,許多中草藥對治療雞球蟲病有效,如常山、青蒿[17]、檳榔[18]、川楝子[19]、白頭翁、肉桂[20]等。目前,市場上存在很多用于控制球蟲病中草藥復方[21]。有些中藥并不是直接作用于球蟲,而是作用于腸道,因其具有免疫調節作用、抗氧化或抗炎特性,從而幫助宿主抵抗球蟲感染[22-23]。有些中草藥提取物可以通過改變卵囊壁形成和抑制孢子形成[24-25],或通過破壞子孢子[26],對球蟲產生直接殺滅作用。部分中草藥提取物可以提高球蟲病后機體的恢復能力[27-28]。

研究表明,中藥常山提取物可以有效預防和治療雞球蟲病,其中的主要成分常山堿在一定程度上能夠增強機體的免疫力,刺激機體免疫反應中相關免疫細胞的發育,如參與細胞免疫的淋巴細胞和巨噬細胞,同時也可以抑制球蟲在宿主腸道黏膜中的生長發育,從而減輕對宿主寄生部位的破壞和減少球蟲卵囊的形成[29]。本試驗通過常山散對感染柔嫩艾美耳球蟲不同發育階段的雛雞生長性能、每克糞便卵囊數(OPG)、盲腸病變評分、抗球蟲指數、血清免疫球蛋白及免疫器官指數測定,研究常山散對感染雛雞抗球蟲效果和免疫功能的影響,明確最佳給藥時間,為后期常山散防治雞球蟲病提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

1日齡白羽肉雞購自酒泉市旺苗禽業養殖場,前期于SPF隔離艙內飼養至12日齡,后轉移至嚴格消殺且無球蟲污染的試驗動物房,并于14日齡滴鼻接種新-傳二聯苗,飼養至16日齡。

1.2 球蟲卵囊

柔嫩艾美耳球蟲由中國農業大學寄生蟲病實驗室提供。試驗開始前,將柔嫩艾美耳球蟲卵囊重新進行傳代,確保卵囊感染活力。將孢子化率為85%以上的球蟲卵囊于2.5%重鉻酸鉀溶液4 ℃保存備用。

1.3 藥品與試劑

常山散中試產品(100 g·袋-1,批號2021111501,1 g本品相當于常山原藥材10 g;有效成分是常山生物堿,含量1.5%),石家莊正道動物藥業有限公司生產。常山散主要生產工藝:利用超聲波提取技術,從中藥常山中提取得到常山浸膏,干燥粉碎后,加入適量淀粉混勻即得(常山浸膏和淀粉質量比9∶1)[30];雞新城疫-傳染性支氣管炎二聯活疫苗(La Sota株+H120株),購自乾元浩生物股份有限公司南京生物藥廠;免疫球蛋白IgG、IgA、IgM檢測試劑盒,購自北京索萊寶科技有限公司。

1.4 試驗動物分組與給藥

試驗開始前連續3 d進行糞檢,確認雛雞沒有感染球蟲。試驗分為6大組:攻蟲前1天(15日齡)、攻蟲當天(16日齡)、第2天(17日齡)、第3天(18日齡)、第4天(19日齡)和第5天(20日齡)給藥試驗組,每個試驗組又分為3個處理組,分別為Ⅰ組(健康對照組)、Ⅱ組(感染性對照組)和Ⅲ組(常山散推薦劑量組,連續給藥4 d)。每組10只雞,共180只,Ⅰ組單獨飼養,各試驗組開始試驗之前均禁食12 h,正常飲水。除Ⅰ組外,其他各組試驗雞均于16日齡按照5×104·只-1劑量人工感染柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊。各試驗組雞分別于19、20、21、22、23和24日齡早上9:00先稱重后捕殺,采集雞盲腸內容物檢查球蟲卵囊,觀察雞臨床癥狀和盲腸病理變化。具體分組見表1。

1.5 測定指標和方法

1.5.1 生長性能測定 以重復組為單位,試驗雞于試驗前后分別稱重(稱重前均禁食12 h,不禁水),詳細記錄各組雞的采食量,計算各組雞平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)、料重比(F/G)。綜合評判常山散對感染柔嫩艾美耳球蟲不同發育階段雛雞生長性能的影響。

1.5.2 抗球蟲指數測定 抗球蟲指數(anticoccidia index,ACI)根據美國默克(Merck)公司計算公式:ACI=(存活率+相對增重率)-(病變值+卵囊值)。根據ACI值判定其抗球蟲效果:120以下為無效;120～160為差;160～180良好;180以上為優秀[31]。

存活率=(各試驗組結束雛雞數量/各試驗組開始雛雞數量)×100%

相對增重率=(各試驗處理組的平均增重/健康對照組的平均增重)×100%

試驗結束,每組試驗雞分別稱量,采血后捕殺,取盲腸組織并打開進行盲腸病變計分。收集各組雞盲腸內容物,破碎,用飽和食鹽水漂浮,紗布過濾2～3次,過濾液靜置10 min,蓋玻片蘸取濾液表面,用細胞計數板于顯微鏡下觀察并進行卵囊計數。

病變記分參照Johnson和Reid(1970)的病變記分方法,兩側盲腸病變不一致者以嚴重一側為準。見表2。

表2 病變記分標準

病變值=各試驗組的平均病變記分×10。

將收集的盲腸內容物用血細胞計數板計算每克糞便卵囊數(OPG值),根據卵囊比數換算成卵囊值。卵囊比數=(健康組或藥物試驗組OPG值/攻蟲對照組OPG值)×100%。見表3。

表3 卵囊值與卵囊比數關系

1.5.3 中藥常山散對健康雛雞免疫功能的影響 分別于試驗結束日,每組隨機抽取6只雞,稱重后心臟采血8～10 mL,室溫靜置2 h,4 500 r·min-1離心20 min,分離血清。將收集的血清置于-20 ℃保存備用,ELISA 法檢測血清免疫球蛋白IgG、IgA、IgM含量。采血完畢后處死,取脾和法氏囊,去除粘連的脂肪及其他組織,用吸水紙吸干表面液體后稱重,計算免疫器官指數。

臟器指數=臟器重量(mg)/體質量(g)

1.6 數據統計與分析

2 結 果

2.1 常山散對雛雞感染球蟲不同發育階段生長性能的影響

由表4可知,攻蟲前1天和攻蟲當天試驗組中Ⅰ組和Ⅲ組的日均增重(ADG)無顯著差異(P>0.05),但與Ⅱ組相比差異顯著(P<0.05);攻蟲后第2、3、4、5天試驗組各小組間ADG差異顯著(P<0.05),與Ⅰ組相比,Ⅱ組ADG下降明顯,Ⅲ組有所改善。隨著球蟲的不斷發育,與Ⅰ組相比,Ⅱ組和Ⅲ組的日均采食量(ADFI)呈現不同程度的下降,其中Ⅱ組ADFI下降較多,Ⅲ組相對較少;攻蟲后,Ⅱ、Ⅲ組料重比(F/G)逐漸增加,但與Ⅱ組相比,Ⅲ組的料重比相對較低。

表4 常山散對雛雞感染球蟲不同發育階段生長性能的影響

2.2 常山散對雛雞感染不同球蟲發育階段OPG及盲腸病變計分的影響

研究結果表明,除攻蟲前1天和攻蟲當天試驗組無球蟲卵囊外,隨著球蟲的發育,其他試驗組的OPG值差異顯著(P<0.05),與Ⅱ組相比,Ⅲ組的OPG顯著降低(P<0.05);Ⅱ組和Ⅲ組的盲腸病變計分差異顯著(P<0.05),由于球蟲生長發育過程中對宿主寄生部位盲腸的不斷侵害,各試驗組中Ⅱ組的盲腸病變計分逐漸上升,Ⅲ組雖也呈上升趨勢,但相較于Ⅱ組,病變計分均有所下降。詳見表5和圖1。

A. 健康對照組;B. 感染對照組(1～6分別為攻蟲前1天至攻蟲第5天);C. 常山散推薦劑量組(1. 攻蟲前1天給藥組;2. 攻蟲當天給藥組;3. 攻蟲第2天給藥組;4. 攻蟲第3天給藥組;5. 攻蟲第4天給藥組;6. 攻蟲第5天給藥組)A. Healthy control group; B. Infected control group (1-6 are from 1 day before to 5 days after the attack, respectively); C. Recommended dose group of RDP (1. Dosing group 1 day before attacking worms; 2. Dosing group on the day of attacking worms; 3. Dosing group on the second day of attacking worms; 4. Dosing group on the third day of attacking worms; 5. Dosing group on the fourth day of attacking worms; 6. Dosing group on the fifth day of attacking worms)

表5 常山散對雛雞感染球蟲不同發育階段OPG及盲腸病變計分的影響

2.3 常山散對雛雞感染球蟲不同發育階段抗球蟲指數的影響

由表6 可知,各試驗組雞存活率基本為100%。隨著球蟲的不斷發育,與Ⅰ組相比較,攻蟲后Ⅱ組和Ⅲ組的相對增重率逐漸下降,盲腸病變值差異顯著(P<0.05)并呈上升趨勢,相較于Ⅱ組,Ⅲ組的相對增重率下降不大,盲腸病變值較低。試驗結果顯示,攻蟲前1天、攻蟲當天和攻蟲第2天試驗組中Ⅲ組的ACI分別為198.83、190.23和165.49,攻蟲第3、4和5天試驗組中Ⅲ組的ACI分別為150.53、155.00和146.18。

表6 各試驗組ACI比較

2.4 常山散對雛雞感染球蟲不同發育階段免疫功能的影響

2.4.1 對血清免疫球蛋白的影響 由表7 可知:隨著球蟲在雞體內的不斷發育,Ⅰ組的血清免疫球蛋白IgA、IgM、IgG含量均顯著低于其他兩組(P<0.05),Ⅱ組和Ⅲ組的血清免疫球蛋白IgA、IgM、IgG含量呈不同程度的升高,差異顯著(P<0.05)。與Ⅱ組相比,Ⅲ組3種血清免疫球蛋白含量相對較高。

表7 常山散對雛雞感染球蟲不同發育階段血清免疫球蛋白的影響

2.4.2 對免疫器官指數的影響 由表8 可知:各試驗組中Ⅰ組的脾臟指數和法氏囊指數均顯著低于其他兩組(P<0.05)。在攻蟲前1天、攻蟲當天試驗設計組中,Ⅱ組和Ⅲ組的脾臟指數差異不顯著(P>0.05),在攻蟲第2、3、4、5天試驗設計組中,Ⅲ組的脾臟指數顯著高于Ⅱ組(P<0.05);在球蟲發育的各個時期,各試驗組中Ⅲ組的法氏囊指數顯著高于(P<0.05)Ⅱ組。且隨著球蟲的不斷發育,Ⅱ組和Ⅲ組的免疫器官指數均呈不同程度的升高。

表8 常山散對雛雞感染球蟲不同發育階段免疫器官指數的影響

3 討 論

雞球蟲病為濕熱癥,治療時應以清熱解毒、涼血止瀉,輔以補氣補虛、健胃益脾為原則[32]。本試驗以中獸醫理論為基礎,選擇中藥常山治療肉雞球蟲病,中藥常山具有多種藥理作用,具有分布廣、毒副作用小等特點。本試驗采用超聲提取技術從中藥常山中提取常山浸膏,利用超聲波的空化效益和攪拌作用可以充分提取中藥有效成分,與傳統提取工藝相比提取率顯著提高,提取時間大幅縮短[33],但由于提取設備較昂貴,市場上規模化應用較少。從中藥常山中提取得到的常山浸膏,可以制備成散劑和口服液;散劑具有生產工藝簡單、成本相對較低的優點,但規模化養雞中拌料不方便;口服液具有易吸收、起效快、抗球蟲療效更好的優點[34],適合集約化養雞給藥,但生產成本相對較高、產品保質期較短。

雛雞人工經口灌服感染5×104·羽-1柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊,患病雛雞的發病癥狀比較明顯,病死率較低,盲腸病變明顯。隨著球蟲在雛雞體內的不斷發育,各試驗處理組中Ⅲ組雛雞的相對增重率、OPG、盲腸病變評分與Ⅱ組相比差異顯著(P<0.05),其中Ⅲ組雛雞的相對增重率均高于Ⅱ組,表明常山散可有效緩解病雞體重降低現象;OPG、盲腸病變評分均小于Ⅱ組,證明常山散能夠有效抑制球蟲的生長發育以及卵囊的排出,在一定程度上能減輕感染雛雞盲腸病變。

完整的球蟲發育史包括孢子生殖、裂殖生殖和配子生殖3個階段。本試驗中攻蟲前1天、攻蟲當天和攻蟲第2天試驗組中Ⅲ組ACI分別為198.83、190.23、165.49,說明在雛雞攻蟲前和球蟲感染雞后發育到子孢子、滋養體階段給藥,常山散具有良好的抗球蟲效果;攻蟲第3、4和5天試驗組中Ⅲ組ACI分別為150.53、155.00和146.18,說明球蟲感染雞后發育到裂殖體、裂殖子階段給藥,常山散的治療效果較差。張步彩等[35]研究發現,含有常山的中藥方劑可以顯著降低感染雛雞的OPG和盲腸病變評分,改善病雞的增重減輕現象,這與本研究的結果一致。

雛雞感染球蟲后,機體主要產生黏膜免疫和細胞免疫,同時也會引起體液免疫應答作為輔助,通過這些免疫途徑抵抗球蟲的入侵[36]。動物血液中的抗體水平是衡量機體體液免疫的一項重要指標,機體體液免疫主要通過成熟B淋巴細胞實現[37],B淋巴細胞產生抗體(IgG、IgM、IgA)參與體液免疫,成熟的B淋巴細胞主要存在于血液及淋巴結、脾臟等外周免疫器官中。本研究結果顯示,感染柔嫩艾美耳球蟲不同發育階段的雛雞在飼喂中藥常山散之后,雛雞血液中血清免疫球蛋白IgG、IgM、IgA含量顯著高于(P<0.05)陰性對照組,其中血清免疫球蛋白IgM升高的水平最為顯著。以上結果表明中藥常山散能夠提高感染柔嫩艾美耳球蟲雛雞機體血液中的抗體水平,提高機體的體液免疫應答,從而增強機體抵抗球蟲的能力。

脾臟和法氏囊是禽類最重要的免疫器官,其免疫功能的高低取決于免疫器官的發育狀態。動物免疫器官質量增加是由于其自身細胞生長發育和分裂增殖所致,質量增加表明機體的免疫機能提高,所以免疫器官的重量在一定范圍內可用于評價雛雞的免疫能力[32,38]。研究表明,中草藥可以提高禽類免疫器官的重量,促進免疫器官的發育以提高免疫器官指數[39]。王福傳等[40]研究發現在飼料中添加不同劑量的中草藥免疫增強劑可以顯著提高雛雞的免疫器官重量。本試驗結果顯示,與Ⅰ組相比,Ⅱ組和Ⅲ組的脾指數和法氏囊指數差異顯著(P<0.05)且呈上升趨勢,說明柔嫩艾美耳球蟲對免疫器官的發育有一定的影響,其中常山散推薦劑量組的各免疫器官指數均不同程度上顯著(P<0.05)高于感染對照組,說明常山散能夠在一定程度上抑制球蟲的發育繁殖,減少其對機體的損害,促進各免疫器官的生長發育,從而增強感染雛雞的免疫力。

4 結 論

對感染不同發育階段柔嫩艾美耳球蟲的雛雞在飼料中添加常山散后,在攻蟲前1天、攻蟲當天(子孢子階段)和第2天(滋養體階段)進行給藥,連續給藥4 d,常山散對球蟲生長發育具有顯著的抑制能力,抗球蟲效果良好。在攻蟲第3、4、5天給藥,即裂殖體、裂殖子階段,連續給藥4 d,常山散對球蟲的生長發育抑制能力降低,抗球蟲效果較差。但對于感染雛雞的免疫功能而言,中藥常山散的添加,提高了雞血液中免疫血球蛋白IgA、IgM、IgG的含量,提高了脾指數和法氏囊指數,整體上增強了病雞的免疫功能。