橙皮苷通過氧化磷酸化途徑緩解高脂飼喂誘導的小鼠肝氧化應激

王 鑫,聶 桐,李阿群,馬 雋,2*

(1.東北農業大學動物醫學學院,哈爾濱 150030;2.黑龍江省實驗動物與比較醫學重點實驗室,哈爾濱 150030)

高脂飲食極易誘導氧化應激的產生[1-2],氧化應激在許多慢性肝疾病如非酒精性脂肪肝(NAFLD)、病毒性肝炎、肝纖維化和肝硬化的發生發展中起著至關重要的作用[3-6]。在正常動物機體中,肝組織的氧化和抗氧化系統處于動態平衡狀態,當機體遭受各種有害刺激時,肝細胞內自由基產生和抗氧化反應之間穩態被打破,導致活性氧(ROS)水平升高,ROS過量會攻擊肝細胞蛋白、脂質和核酸,導致細胞功能障礙從而誘發細胞病理變化引起各種疾病[7-9]。

氧化磷酸化(OXPHOS)是一種酶機器,線粒體通過其內膜上的NADH-輔酶Q還原酶(線粒體電子傳遞鏈復合物Ⅰ)、琥珀酸-輔酶Q還原酶(線粒體電子傳遞鏈復合物Ⅱ)、細胞色素C還原酶(線粒體電子傳遞鏈復合物Ⅲ)、細胞色素C氧化酶(線粒體電子傳遞鏈復合物Ⅳ)和ATP合酶(線粒體電子傳遞鏈復合物Ⅴ)這5個多聚體酶復合物構成的電子傳遞鏈(ETC)轉移氫和電子,消耗氧氣(O2)并產生ATP以供機體能量代謝[10]。細胞內的ROS主要由ETC產生,在基礎水平上,ROS作為信號分子調節細胞增殖、分化等生物學過程,但當ROS超過細胞可承受范圍時,ROS就會誘導氧化應激[11]。

橙皮苷(hesperidin,HDN),是一種在柑橘類水果中含量很高的類黃酮[12-13],是天然酚類化合物,具有廣泛的生物活性,如抗炎、抗氧化、抗癌,降低膽固醇水平和血壓,抗肥胖活性[14]。相關研究表明,HDN可以上調谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、錳超氧化物歧化酶等抗氧化酶的表達發揮抗氧化作用[10,15],但其作用機制鮮有報道。

轉錄組分析可以提供大量信息,已經有許多研究使用轉錄組分析來篩選差異表達的基因以及藥物作用的相關機制[16-18]。在畜禽養殖過程中動物可能會由于受到飼料營養水平及環境條件改變等應激因素的刺激,在機體內產生過量的ROS,誘發氧化應激,從而使動物產能下降影響經濟效益。因此,本研究對C57BL/6小鼠進行高脂飲食飼喂從而誘導肝氧化應激,之后通過轉錄組分析探究HDN對肝氧化應激影響的作用途徑并進行驗證。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

HDN(含量≥ 98%)購自上海源葉生物科技有限公司(B20182);小鼠常規飼料和高脂飼料購自小黍有泰(北京)生物科技有限公司(D12450B、D12492);羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)購自默克化工技術(上海)有限公司(C5678);BCA蛋白定量/濃度測定試劑盒購自大連美侖生物技術有限公司(MA0082-2);總超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、總抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛(MDA)試劑盒、ATP含量測試試劑盒購自南京建成生物工程研究所(A001-1-2、A005-1-1、A015-2-1、A003-1-2、A095-1-1);RT cDNA第一鏈合成試劑盒、Real-Time PCR試劑盒(SYBR Green)購自杭州博日科技有限公司(R233-01、BSB33 M1);Cox6a2(1∶1 000,TD10096)、Ndufb8(1∶1 000,T58290)、Ndufb10(1∶1 000,PHQ9642)、Atp6v0d2(1∶1 000,MG502166)購于艾比瑪特生物醫藥有限公司;血液/細胞/組織DNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司(DP304)。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗動物分組及處理 18只體重20～23 g SPF級雄性C57BL/6小鼠購自遼寧長生生物技術股份有限公司,預飼1周后開始試驗。在試驗期間所有小鼠處于相同的環境。小鼠隨機分成3組(n=6),分別為control組、HFD組、HFD+HDN組。control組小鼠飼喂常規飼料(脂肪含量10%、碳水化合物含量70%、蛋白質含量20%)。HFD組小鼠飼喂高脂飼料(脂肪含量60%、碳水化合物含量20%、蛋白質含量20%)。HFD+HDN組在飼喂高脂飼料的同時每天灌胃給藥HDN 300 mg·kg-1(HDN溶于0.5% CMC-Na中)。

各組在相應條件下飼喂16周,試驗結束時腹腔注射3%戊巴比妥鈉(60 mg·kg-1)麻醉小鼠后進行眼球采血,采血完畢后脫頸處死,解剖后取肝組織。血液離心取血清進行ALT和AST活性檢測。肝組織液氮速凍后置于-80 ℃冰箱儲存,用于后續試劑盒檢測、RNA的提取以及實時熒光定量PCR(qRT-PCR)試驗。

1.2.2 肝功能和氧化應激標志物的測定 將血液于4 ℃、3 000 r·min-1離心10 min后取上清,使用全自動生化分析儀(深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司)檢測ALT和AST活性。

按照試劑盒說明書要求測定小鼠肝組織中MDA、T-SOD、T-AOC和GSH-Px水平。

1.2.3 總RNA提取、轉錄組文庫的建立、質檢及測序 采用TRIzol法分別提取樣品總RNA,通過Agilent 2100 bioanalyzer,檢測RNA完整性和濃度,將一部分RNA保存用于后續qRT-PCR試驗,將另一部分RNA交于北京諾禾致源科技股份有限公司構建文庫,基于邊合成邊測序(Sequencing by Synthesis, SBS)的原理進行測序從而獲得原始測序數據。去除原始測序數據中的低質量、未知堿基N含量過高以及接頭污染的序列以獲得高質量序列數據。

1.2.4 差異表達基因的篩選 將高質量序列數據與參考基因組序列進行比對,使用DESeq 2軟件(1.20.0)進行兩個比較組合之間的差異表達分析。使用Benjamini和Hochberg的方法來調整所得P值以控制錯誤發現率。以P≤0.05 &|log2(foldchange)|≥1為標準進行顯著差異表達基因的篩選。

1.2.5 差異表達基因的KEGG富集分析 用ClusterProfile軟件對HFD+HDN組與HFD組的差異表達基因集進行KEGG通路富集分析,以P<0.05作為顯著性富集的閾值,篩選出HDN影響最顯著的信號通路。

1.2.6 qRT-PCR驗證轉錄組結果 使用qRT-PCR對轉錄組測序結果進行驗證,使用RT cDNA第一鏈合成試劑盒和Real-Time PCR試劑盒對細胞的總RNA進行逆轉錄和熒光定量分析。用于定量的引物由生工生物技術(上海)股份有限公司設計,以β-actin作為內參對照基因。mRNA引物序列見表1。根據2-△△Ct法計算mRNA的相對表達量。

表1 mRNA 引物序列

1.2.7 肝組織蛋白提取及免疫蛋白印跡分析 肝組織稱重后,每50 mg加入1 mL RIPA裂解液,組織研磨儀充分研磨,研磨液置于冰上裂解,4 ℃,12 000 r·min-1離心15 min后取上清液,BCA試劑盒測定蛋白濃度,調整樣品終濃度,變性煮沸,冷卻后分裝,-80 ℃保存。SDS-聚丙酰胺凝膠電泳分離目的蛋白,將目的蛋白轉膜到NC膜上,封閉,一抗孵育,4 ℃過夜,二抗孵育,ECL發光液顯影,曝光得到相應的蛋白條帶。Image J軟件量化蛋白條帶。

1.2.8 mtDNA相對含量測定 將肝組織打碎,形成細胞懸液,10 000 r·min-1離心1 min后,倒盡上清,加入200 μL緩沖液GA搖蕩。根據組織線粒體DNA提取試劑盒說明書提取,并計算DNA的純度和濃度,選取mtDNA的Ctyb為目的基因,核基因28S為內參,mRNA引物序列見表1,進行qRT-PCR檢測,并計算各組Ct值,根據2-△△Ct法計算mtDNA相對含量。

1.2.9 肝組織ATP含量測定 使用ATP檢測試劑盒檢測肝組織ATP含量,按照說明書操作,稱取肝組織,制成10%的勻漿液,再置于沸水浴中煮10 min,混勻,3 500 r·min-1離心10 min,取上清液進行測定。

1.3 數據處理

使用GraphPad Prism 8.0進行數據差異性分析,數據采用單因素分析Tukey檢驗,均以“平均值±標準差(Mean±SD)”表示,P<0.05認為有統計學差異。

2 結 果

2.1 HDN改善高脂飼喂誘導的小鼠肝功能及氧化應激水平

根據肝功能檢測結果顯示,與control組相比,HFD組小鼠血清ALT和AST活性顯著升高(P<0.000 1);與HFD組相比,HFD+HDN組小鼠血清ALT和AST活性顯著降低(P<0.01,圖1A、1B)。根據氧化應激標志物的測定結果顯示,與control組相比,HFD組小鼠肝組織MDA含量顯著升高(P<0.001,圖1C),T-SOD、GSH-Px和T-AOC水平顯著降低(P<0.001,圖1D～1F);與HFD組相比,HFD+HDN組小鼠肝組織MDA含量顯著降低(P<0.01,圖1C),T-SOD、GSH-Px和T-AOC水平顯著升高(P<0.05,圖1D～1F)。這些結果表明,HDN能夠減輕高脂飼喂誘導的小鼠肝功能障礙和肝氧化應激。

2.2 轉錄組測序數據質量分析

本次轉錄組測序3組9個樣品共獲得58.55 Gb高質量序列數據用于后續分析,所有樣本的樣本測序數據質量匯總如表2所示,每個樣本平均產生數據約6.51 GB,高質量reads數目占比均在99%以上,Q 20和Q 30平均值分別為97.94%和94.20%,GC含量平均為47.89%,過濾后堿基數穩定,AT堿基與GC堿基數量基本相同,以上結果表明測序獲得的數據質量較高,數據可靠,滿足后續生物信息學分析的條件。

表2 樣本測序數據質量匯總

2.3 差異表達基因分析

根據差異基因柱狀圖(圖2A)和火山圖(圖2B、C)可以發現,HFD組與control組相比,一共有3 011個基因的表達出現顯著變化(P<0.05),其中1 536個基因呈上調表達(P<0.05),1 475個基因呈下調表達(P<0.05);HFD+HDN組與HFD組相比,共有1 294個基因的表達出現顯著變化(P<0.05),其中889個基因呈上調表達(P<0.05),405個基因呈下調表達(P<0.05)。

A.差異表達基因數量柱狀圖;B.HFD 組vs. control組基因表達分布的火山圖;C.HFD+HDN組 vs. HFD組基因表達分布的火山圖A. Histogram of the number of differentially expressed genes; B. Volcano map of HFD group vs. control group gene expression distribution; C. Volcano map of HFD+HDN group vs. HFD group gene expression distribution

A.富集顯著性排名前20的信號通路;B. OXPHOS途徑差異表達基因熱圖(紅色表示基因上調,藍色表示基因的下調)A. The top 20 signalling pathways in terms of enrichment significance; B. Heat map of differentially expressed genes in the oxidative phosphorylation pathway (red indicates up-regulation of genes, blue indicates down-regulation of genes)

2.4 KEGG信號通路富集分析

對HFD+HDN組與HFD組的差異基因集進行KEGG信號通路富集分析,富集顯著性排名前20的信號通路如圖3A所示。結果顯示,OXPHOS途徑最顯著上調(P<0.000 1)。在OXPHOS途徑顯著上調或下調的基因中(圖3B),復合物I中有21個基因顯著上調(mt-Nd41、Gm28438、Ndufv3、Ndufb7、Ndufa5,Ndufb10、Ndufa11、Gm10222、Ndufs5、Ndufa12、Ndufa6、Ndufb8、mt-Nd1、Ndufb4c、Ndufc2、Ndufb3、mt-Nd5、BC002163、Ndufb6、Ndufa13、Ndufa1,P<0.05);復合物III中有4個基因顯著上調(mt-Cytb、Uqcrq、Uqcrb、Uqcr10,P<0.05);復合物IV中8個基因顯著上調(Cox6a2、Cox8b、Gm11273、Cox6b1、Cox7a1、Gm28437、mt-Co1、Cox4i1,P<0.05),1個基因顯著下調(Cox6c2,P<0.05);復合物V中5個基因顯著上調(Gm10231、mt-Atp8、Atp5g2、Atp5o、Atp5e,P<0.05);1個基因顯著下調(Atp6v0d2,P<0.05)。

2.5 qRT-PCR驗證轉錄組結果

通過qRT-PCR進一步證實轉錄組分析觀察到的基因表達的變化,使用與上述轉錄組測序中相同的小鼠肝組織樣品。使用qRT-PCR對轉錄組結果進行驗證。從OXPHOS途徑中選取10個具有顯著差異的基因,進行mRNA水平分析。由圖4可知,HFD組與control組相比,Cox8b、Cox6a2、Gm10231、mt-Atp8、mt-Nd4 l、Gm11237、Ndufb8、Ndufb10的mRNA相對表達量顯著下調(P<0.05),Atp6v0d2、Cox6c2的mRNA的相對表達量顯著上調(P<0.05);HFD+HDN組與HFD組相比,Cox8b、Cox6a2、Gm10231、mt-Atp8、mt-Nd4 l、Gm11237、Ndufb8、Ndufb10的mRNA相對表達量顯著上調(P<0.05),Atp6v0d2、Cox6c2的mRNA的相對表達量顯著下調(P<0.05)。qRT-PCR分析表明,基因表達量與轉錄組測序結果在表達差異的方向和程度方面一致,驗證了轉錄組分析的可靠性。

圖4 RT-PCR驗證轉錄組結果Fig.4 RT-PCR validation of transcriptome results

2.6 免疫蛋白印跡驗證轉錄組結果

通過免疫蛋白印跡證實轉錄組結果。由圖5可知,HFD組與control組相比,Cox6a2、Ndufb8、Ndufb10蛋白表達量顯著降低(P<0.01),Atp6v0d2d蛋白表達量顯著升高(P<0.000 1);HFD+HDN組與HFD組相比,Cox6a2、Ndufb8、Ndufb10蛋白表達量顯著升高(P<0.05),Atp6v0d2d蛋白表達量表達量顯著降低(P<0.001)。蛋白表達量與轉錄組測序結果在表達差異的方向和程度方面一致,進一步驗證了轉錄組分析的可靠性。

A. Cox6a2、Ndufb8、Ndufb10、Atp6v0d2蛋白免疫印跡條帶;B. Cox6a2蛋白相對表達量;C. Ndufb8蛋白相對表達量;D. Ndufb10蛋白相對表達量;E. Atp6v0d2蛋白相對表達量A. Immunoblot of Cox6a2,Ndufb8,Ndufb10,Atp6v0d2; B. The protein expression of Cox6a2; C. The protein expression of Cox6a2; D. The protein expression of Ndufb8; E. The protein expression of Ndufb10; F. The protein expression of Atp6v0d2

2.7 線粒體數量變化

由圖6可知,通過蛋白免疫印跡檢測發現,HFD組與control組相比,線體體外膜蛋白TOMM20表達量明顯降低(P<0.000 1),HFD+HDN組與HFD組相比,TOMM20蛋白表達量明顯升高(P<0.05);通過qRT-PCR檢測發現,HFD組與control組相比,mtDNA 相對含量顯著降低(P<0.001);HFD+HDN組與HFD組相比,mtDNA相對含量顯著升高(P<0.05)。

A.TOMM20蛋白免疫印跡條帶;B.TOMM20蛋白相對表達量;C.mtDNA相對含量A.Immunoblot of TOMM20;B.The protein expression of TOMM20;C.Folf chenges of mtDNA

2.8 肝組織ATP含量變化

由圖7可知,HFD組與control組相比,ATP含量顯著降低(P<0.01),HFD+HDN組與HFD組相比,ATP含量顯著升高(P<0.05)。

圖7 肝組織ATP含量Fig.7 ATP content of liver

3 討 論

已有證據表明,高脂飲食會導致ROS水平增加,從而誘導氧化應激[19]。抑制肝氧化應激是慢性肝疾病預防和治療的關鍵[20-22]。因此,增強機體抗氧化防衛系統來保護細胞免受自由基侵害,緩解肝氧化應激是治療和預防慢性肝疾病的重要途徑。本研究基于轉錄組學,探究HDN對肝氧化應激影響的作用途徑并進行驗證。

很多研究已經表明,各種天然黃酮類化合物,如黃芩甙、漢黃芩素、楊梅素和白楊素可以通過提高抗氧化蛋白的表達和活性來改善肝氧化應激[23-27]。機體通過抗氧化系統(酶促和非酶促系統)來保護動物機體免受ROS的影響。酶系統包括SOD和GSH-Px等;非酶系統涵蓋了廣泛的分子,如谷胱甘肽(GSH),硫氧還蛋白、尿酸、維生素E等。這些非酶分子的總濃度稱為T-AOC[28]。SOD作為對抗氧化應激的第一道防線,將超氧陰離子自由基轉化為過氧化氫(H2O2)和O2。GSH-Px通過消耗GSH清除過量的H2O2。當自由基產生和抗氧化反應之間的平衡被打破時,自由基過度產生,就會導致脂質過氧化從而改變細胞膜完整性,引起組織損傷。MDA作為脂質過氧化反應的終產物,其含量反映氧化應激受損程度[29]。本研究顯示,HDN能顯著降低高脂飲食誘導的氧化應激模型小鼠血清中ALT和AST酶活性,改善肝功能,肝MDA含量顯著減少,抗氧化系統酶活性顯著升高(GSH-Px和T-SOD),T-AOC顯著升高,這與先前的研究一致[30],表明HDN可有效減輕高脂飲食誘導的小鼠的肝功能障礙和肝氧化應激。

線粒體調節細胞代謝,是ROS的重要來源,在線粒體OXPHOS過程中,O2作為ETC的終端電子受體,在參與OXPHOS反應生成ATP以維持機體能量代謝的同時,還會有部分O2被還原,形成ROS[23]。ROS過量會導致細胞功能障礙從而誘發細胞病理變化引起各種疾病。肝作為體內代謝的核心器官,有著豐富的線粒體,由于其代謝活性,使其對氧化應激特別敏感。先前有研究表明,與未患NAFLD的小鼠相比,患有NAFLD小鼠OXPHOS復合物活性均有所降低,ETC功能受損,ATP生成減少,ROS形成增加[31]。本研究使用轉錄組學中KEGG信號通路富集分析方法探索HDN減輕肝氧化應激的作用機制。結果顯示,HFD+HDN組和HFD組之間存在著大量差異表達的基因。線粒體OXPHOS通路是HDN干預后最顯著上調的信號通路,該通路是一條重要的能量代謝通路,參與OXPHOS的體系主要以復合物(I-V)形式分布于線粒體的內膜上,構成ETC,而ETC驅動ATP的產生。因此,OXPHOS通路所涉及的相關基因也也主要與這些復合物相關。本研究結果顯示,HFD組control組相比,復合物I中有21個基因顯著下調;復合物III中有4個基因顯著下調;復合物IV中8個基因顯著下調,1個基因顯著上調;復合物V中5個基因顯著下調;1個基因顯著上調。HDN干預后,與HFD組相比,這些基因上調、下調的程度明顯改善。之后從OXPHOS途徑差異表達基因的結果中,隨機選取10個關鍵基因進行qRT-PCR驗證,隨機選取4個關鍵基因對應編碼的蛋白進行蛋白免疫印跡分析,結果均與轉錄組學結果一致,表明分析結果準確可信。

線粒體是除細胞核外唯一具有自身遺傳信息的細胞器。線粒體基因組為小型環狀DNA,每個線粒體中含有多個拷貝的大約16.6 kb的環狀mtDNA,平均每個線粒體含有大約2～10個拷貝數的mtDNA,因此mtDNA的拷貝數與線粒體數量呈正比[32]。ETC驅動ATP的產生,然后用作幾乎所有細胞過程中的主要能量載體[33],線粒體數量減少、ETC損傷會使線粒體合成ATP的功能發生障礙,OXPHOS功能受損,在本研究中,經HDN干預后,TOMM20蛋白表達量顯著升高,mtDNA相對含量顯著升高(P<0.05),肝中ATP含量顯著升高,以上結果說表明與HFD組相比,HDN干預后使高脂飲食誘導的小鼠線粒體數量增多,OXPHOS水平升高。

綜上所述,本研究表明,HDN通過改變線粒體呼吸鏈復合物上相關基因的表達,調節線粒體OXPHOS途徑,從而減輕了高脂飼喂誘導的小鼠的肝氧化應激。

4 結 論

HDN通過調節線粒體OXPHOS途徑,減輕高脂飼喂誘導的小鼠的氧化應激。