裂解性噬菌體對肉仔雞感染腸炎沙門菌的治療效果

鄭 琳,魏炳棟*,滑 峰,陳 龍,丁 媛

(1.吉林省農業科學院 動物營養與飼料研究所,公主嶺 136100;2.吉林農業大學生命科學學院,長春 130118)

沙門菌屬于腸桿菌科、革蘭陰性兼性厭氧菌。目前,已經鑒定的沙門菌屬有6個亞種和超過25萬種的血清型,其中大多數血清型來自腸炎沙門菌,且血清型的數量每年都在增加[1]。在這些亞種中,除鼠傷寒(Typhimurium)和腸炎(Enteritidis)沙門菌在全球分布外,其余4種具有明顯的區域性[2]。家禽是沙門菌最易感的宿主,致病性沙門菌可引起雛雞大批死亡,成年雞產蛋率和生產性能下降,但是大多數患病雞以無癥狀腸道定植為特征,并不會引發全身性癥狀,這些隱性感染的沙門菌常以蛋、肉、糞便、污水為媒介,引起人類食源性感染。據世衛組織報道,每年全球有超過9 380萬人感染沙門菌,因此而死亡的人數達到15.5萬[3]。環丙沙星、左氧氟沙星等喹諾酮類及頭孢類抗生素是治療沙門菌感染的一線用藥。但是,隨著抗生素的大量使用或濫用,引起的多重耐藥愈發嚴重。Gong等[4]統計了我國東部地區從1962至2010年沙門菌的耐藥情況,1962—1968年耐藥率僅為9.4%,到70年代和80年代,耐藥率分別為64.6%和78.7%,到了1990至2010年,耐藥率已高達96.6%,尤其對頭孢羥唑、甲氧芐啶耐藥性尤為突出。2019年7月10日,農業農村部發布194號公告,自2020年7月1日起,飼料生產企業停止生產含有促生長類藥物飼料添加劑(中草藥除外)的商品飼料,我國飼料業正式邁入“無抗時代”。因此,研發安全、高效的抗生素替代品是保障動物源食品安全、提高養殖業水平,以及促進社會發展的必然需求。

噬菌體是一類能夠感染細菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的總稱。噬菌體也是目前自然界數量最為豐富、最具多樣性的微生物,據估算,噬菌體的總量可達1031～1032,每種細菌細胞則有大約10種噬菌體顆粒[5]。在多重耐藥菌日益嚴重的今天,噬菌體作為對抗細菌感染的利器,不僅應用于人類疾病中,而且還廣泛應用到動物、食品及飼料中病原菌的清除、細菌生物被膜的裂解等方面[6]。噬菌體在防控家禽腸炎沙門菌感染方面相關研究較多,但大多數研究集中于防控雞肉、雞蛋等的沙門菌感染,有關養殖環境中對雛雞沙門菌感染的防治研究相對較少。王曦等[7]通過糞菌移植結合噬菌體的療法,降低了雛雞沙門菌感染導致的死亡,減少了沙門菌在雛雞腸道內的定植,提高雛雞免疫水平。宋新慧等[8]研究發現,噬菌體可有效降低沙門菌感染雛雞的死亡率。Nabil等[9]和Wong等[10]研究也表明,噬菌體可有效降低雞腸道中沙門菌的定植,但有關噬菌體對沙門菌感染雛雞腸道免疫的相關研究甚少。本課題組經過大量前期試驗發現,噬菌體的給藥劑型對沙門菌感染仔雞的防控效果有顯著的差異,前人研究多以灌服方式給予治療,本研究以腸炎沙門菌為宿主菌,分離篩選具有高穩定性和裂解活性的噬菌體S13-21,建立肉仔雞腸炎沙門菌感染模型,采用腹腔注射方式探究噬菌體對雛雞感染腸炎沙門菌的治療作用,評估噬菌體在防控雛雞沙門菌感染中的應用潛力。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

裂解性噬菌體S13-21由吉林省農業科學院動物營養與飼料研究所分離并保藏;腸炎沙門菌購自國家獸醫微生物菌(毒)種保藏中心(菌種編號:CVCC 3378),由吉林省農業科學院動物營養與飼料研究所保藏;抗生素選用硫酸慶大霉素,購自九江禮淶科技集團有限公司。SS固體培養基購自青島海博生物技術有限公司,胰蛋白胨、酵母浸粉、氯化鈉、瓊脂粉、PBS磷酸鹽干粉購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 培養基配制

SS固體培養基:稱取本品63.53 g,溶解于1 000 mL蒸餾水中,加熱煮至沸,不必高壓蒸汽滅菌,冷卻至45～50 ℃倒成平板。

LB液體培養基:胰蛋白胨10 g,酵母浸粉5 g,NaCl 10 g,溶解于蒸餾水中,用5 mol·L-1NaOH調pH至7.0,用蒸餾水定容至1 L,121 ℃高壓滅菌20 min。

LB固體培養基:在LB液體培養基中加入占總體積1.5%的瓊脂粉,滅菌后冷卻至45～50 ℃倒成平板。

LB半固體培養基:在LB液體培養基中加入占總體積0.7%的瓊脂粉,滅菌后冷卻至45～50 ℃倒成平板。

PBS:用蒸餾水溶解,定容至2 L,4 ℃保存。

1.3 攻毒用沙門菌菌液配制

在無菌條件下將沙門菌劃線接種于SS固體培養基中,37 ℃培養24 h,挑取單一菌落接種于5 mL LB液體培養基中,37 ℃、180 r·min-1搖床培養至對數期(5 h)獲得新鮮菌液,將所得菌液以1%的接種量接種于200 mL LB液體培養基中,37 ℃、180 r·min-1搖床培養至對數期(5 h),將所得菌液離心后收集菌體,用PBS洗滌、濃縮菌體,充分震蕩混勻進行10倍梯度稀釋后用于菌落計數。將已知濃度的濃縮菌液稀釋至攻毒濃度(LD50)備用。

1.4 治療用噬菌體配制

挑取已純化好的噬菌斑于1 mL PBS中,4 ℃靜置1 h,12 000 r·min-1離心7 min,吸取上清液800 μL經0.22 μm濾膜過濾后加入5 mL LB中,每管加入100 μL宿主菌菌液,37 ℃、180 r·min-1搖床培養,觀察培養液澄清度,以宿主菌菌液為對照。將澄清培養液12 000 r·min-1離心7 min,經0.22 μm濾膜過濾后分裝于5 mL LB中,每管加入100 μL宿主菌菌液,800 μL噬菌體原液繼續擴增培養,觀察培養液澄清度,以宿主菌菌液為對照。將澄清培養液12 000 r·min-1離心7 min,經0.22 μm濾膜過濾后分裝于4 mL離心管中,4 ℃冰箱保存備用。配制200 mL LB液體培養基,加入1 mL宿主菌液,37 ℃、180 r·min-1搖床培養1.5 h,加入8 mL噬菌體原液,繼續培養至溶液澄清后8 000 r·min-1離心10 min,分裝于50 mL離心管中,4 ℃備用。經點滴法檢驗,無沙門菌生長。

1.5 試驗設計及飼養管理

選用1日齡AA肉仔雞72只,飼養至4日齡隨機分為4組,每組6個重復,每個重復3只雞,即空白對照組(C)、沙門菌感染組(S)、噬菌體治療組(S+P)和抗生素治療組(S+A)。各組飼喂基礎飼糧,試驗期12 d,治療期7 d,觀察期5 d?；A飼糧參照中華人民共和國農業行業標準《雞飼養標準》(NY/T 33—2004)配制,飼養試驗在吉林省農業科學院動物營養與飼料研究所試驗場進行,試驗動物自由采食,充足飲水。

1.6 試驗流程

于4日齡采用腹腔注射攻毒的方式對S組、S+P組和S+A組肉仔雞進行沙門菌感染,攻毒劑量為200 μL·只-1(1.0×109CFU·mL-1)。6 h后對S+P組和S+A組肉仔雞進行治療,按腹腔注射方式噬菌體劑量1 mL·只-1(1.0×1012PFU·mL-1),抗生素200 μL·只-1(硫酸慶大霉素,800 IU·只-1),連續治療7 d,間隔12 h,治療結束后第5天每組隨機選取6只肉仔雞經頸動脈放血致死,采集血液,分離血清,并對其進行無菌剖檢,采集肝、胸腺、脾、法氏囊及腸道組織和內容物樣本,用于后續指標檢測。

1.7 檢測指標與方法

1.7.1 存活率和終末體重 試驗期間,每日觀察雞只健康情況,記錄死亡數。試驗結束時,以重復為單位,進行空腹稱重。

存活率(%)=(每組肉仔雞總數-死亡數)/每組肉仔雞總數×100。

1.7.2 免疫器官重和器官指數 屠宰后,稱取胸腺、脾、法氏囊重量,并計算免疫器官指數,公式如下:

器官指數(%)=器官鮮重(g)/活重(g)×100。

1.7.3 腸道載菌量

1.7.3.1 引物設計與合成:根據已發表文獻中腸道微生物基因序列,由生工生物工程(上海)有限公司合成,其序列分別如下:

表1 腸道微生物擴增目的基因的引物序列

1.7.3.2 DNA模板制備:DNA采用糞便基因組DNA提取試劑盒(TIANamp Stool DNA Kit: TIANGEN)提取空腸、回腸和盲腸內容物,試驗操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.7.3.3 PCR擴增:PCR反應體系:ddH2O 10 μL,2×Green qPCRMix 12 μL,上、下游引物各1 μL,cDNA模板1 μL,總體積25 uL。

PCR反應程序:95 ℃預變性2 min;95 ℃變性15 s,55 ℃～68 ℃延伸20～60 s,進行35～45個循環;45 ℃降溫20 s;45 ℃～90 ℃熔解曲線。延伸和熔解曲線要選熒光定量。PCR延伸溫度可根據引物的Tm值和GC含量設定。取5 μL PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳進行成像。

1.7.3.4 標準曲線的制作及結果處理:使用試劑盒(E.Z.N.A. Cycle-Pure OMEGA,美國)純化PCR產物,試驗操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行,純化后的產物經上海宏石SLAN-96P PCR儀測定濃度。采用ΔΔCT法對試驗結果進行處理,計算公式如下:

A=CT(目的基因,待測樣本)-CT(內標基因,待測樣本);

B=CT(目的基因,對照樣本)-CT(內標基因,對照樣本);

K=A-B;

表達倍數=2-K。

將標準品按比例稀釋,將已知標準曲線濃度的lg為X軸,以Ct值為縱坐標,繪制標準曲線。再以待測樣品的Ct值從標準曲線上推算出樣品濃度的log值。

1.7.4 血清、肝及腸道噬菌體載量 準確稱取組織及腸道內容物樣品0.1 g,加入0.9 mL生理鹽水制成勻漿,吸取0.1 mL組織勻漿或血清,梯度稀釋,每個樣品稀釋梯度取100 μL加入250 μL宿主菌(對數期),37 ℃孵育20 min,采用雙層平板法測定噬菌體載量,每個樣品做3個平行。

1.7.5 血清及組織抗氧化指標 測定血清與肝、腸道組織勻漿中丙二醛(MDA)含量以及總超氧化歧化酶(T-SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性,試劑盒購自南京建成生物工程研究所,按說明書方法測定,并用考馬斯亮藍法定量組織勻漿中蛋白質含量。

1.7.6 血清及組織細胞因子和免疫球蛋白指標 采用酶聯免疫法(ELISA)測定血清與腸道組織勻漿中分泌型免疫球蛋白A(sIgA)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、干擾素γ(IFN-γ)及白細胞介素6(IL-6)含量,試劑盒購自北京華英生物,按照說明書操作。

1.8 統計分析

試驗數據先用Excel 2016初步處理后,用SPSS 22.0統計軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA),Duncan氏法進行多重比較。試驗結果以“平均值±標準差”表示,P<0.05為差異顯著,P<0.01為差異極顯著。

2 結 果

2.1 噬菌體對感染沙門菌肉仔雞存活率的影響

由圖1中可以看出,肉仔雞感染腸炎沙門菌死亡率很高,攻毒后第1天,S組存活率下降至77%,第2天下降至64%,第5天時存活率僅為59%;經噬菌體和抗生素治療后,存活率大幅提高,與S組相比,存活率提高25%以上,但是S+P組的存活率較S+A組低6%～12%。

C. 空白對照組;S. 沙門菌感染組;S+P. 噬菌體治療組;S+A. 抗生素治療組。下同C. Blank control group; S. Salmonella infection group; S+P. Phage treatment group; S+A. Antibiotic treatment group. The same as below

2.2 噬菌體對感染沙門菌肉仔雞體重的影響

由圖2可以看出,肉仔雞感染腸炎沙門菌對體重產生極顯著影響,S組體重極顯著低于C組、S+P組和S+A組(P<0.01),經噬菌體和抗生素治療后能夠一定程度上恢復生長,但是較C組體重低6%～7%,且S+P組與S+A組差異不顯著(P>0.05)。

“*”表示差異顯著(P<0.05),“**”表示差異極顯著(P<0.01)。下同"*" indicates significant difference (P<0.05), and "**" indicates extremely significant difference (P<0.01). The same as below

2.3 噬菌體對感染沙門菌肉仔雞免疫器官的影響

由表2可知,沙門菌攻毒后可使脾重量增加,與C組相比S組脾的重量差異不顯著(P>0.05),S+P組和S+A組均極顯著高于C組(P<0.01),但與S組差異不顯著(P>0.05);胸腺、法氏囊重及免疫器官指數各組間差異均不顯著(P>0.05)。

表2 噬菌體對感染沙門菌肉仔雞免疫器官的影響

2.4 噬菌體對感染沙門菌肉仔雞腸道菌群的影響

由表3可知,在空腸中,攻毒后可極顯著提高S組和S+A組總菌數(P<0.01),以及S組、S+P組和S+A組腸桿菌數(P<0.01),但是并未檢測出沙門菌,噬菌體和抗生素治療后,總菌落數和腸桿菌數與S組差異不顯著(P>0.05);在回腸中,攻毒后總菌數極顯著降低(P<0.01),沙門菌數極顯著升高(P<0.01),與S組相比,S+P組和S+A組極顯著的降低了沙門菌數量(P<0.01),并且抗生素的殺菌效果(減少3.26 lgCFU·kg-1)要極顯著強于噬菌體(減少2.25 lgCFU·kg-1)(P<0.01);在攻毒后極顯著地提高了盲腸中總菌落和沙門菌數量(P<0.01),但是與C組相比,S+A組的總菌落數極顯著降低(P<0.01),與S組相比,噬菌體和抗生素治療后能夠極顯著降低沙門菌數量(P<0.01),且S+P組與S+A組治療效果相似(P>0.05)。

表3 噬菌體對感染沙門菌肉仔雞腸道菌群的影響

2.5 噬菌體對感染沙門菌肉仔雞血清及組織噬菌體載量的影響

由圖3可知,在血清和肝中S+P和S+A組的噬菌體效價極顯著高于C組和S組(P<0.01),且S+P組噬菌體顯著高于S+A組(P<0.05);由圖4可知,在腸道中,S+P組噬菌體效價顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)高于其余三組,而且消化道后端的噬菌體效價高于前端。

圖3 噬菌體對感染沙門菌肉仔雞血清和肝中沙門菌噬菌體載量的影響Fig.3 Effects of phage on phage burden in blood and liver of chickens infected with Salmonella enteritidis

圖4 噬菌體對感染沙門菌肉仔雞腸道中沙門菌噬菌體載量的影響Fig.4 Effects of phage on phage burden in intestinal tract of chickens infected with Salmonella enteritidis

2.6 噬菌體對感染沙門菌肉仔雞抗氧化指標的影響

由表4可知,肉仔雞感染沙門菌對血清、肝及腸道抗氧化能力有極大的影響。在血清中,與C組相比,S組、S+P組和S+A組T-SOD和GSH-Px活性極顯著降低(P<0.01),且MDA含量極顯著升高(P<0.01);在肝中,S組和S+P組T-SOD和GSH-Px活性極顯著低于C組(P<0.01),且MDA含量極顯著高于C組(P<0.01),但是S+A組抗氧化指標與C組差異不顯著(P>0.05);在空腸中,S組T-SOD活性極顯著低于其他三組(P<0.01),而MDA含量極顯著高于其他組(P<0.01),且其余各組間差異不顯著(P>0.05),S組和S+P組GSH-Px活性極顯著低于C組(P<0.01),且S組極顯著低于S+A組(P<0.01),但是S+A組GSH-Px活性與C組和S+P組差異均不顯著(P>0.05);同樣,在回腸中S組、S+P組和S+A組T-SOD和GSH-Px活性極顯著低于C組(P<0.01),S組和S+P組MDA含量極顯著高于C組(P<0.01),而S+A組與C組差異不顯著(P>0.05),且S+P組和S+A組差異也不顯著(P>0.05)。

表4 噬菌體對感染沙門菌肉仔雞抗氧化指標的影響

2.7 噬菌體對感染沙門菌肉仔雞細胞因子和免疫球蛋白含量的影響

由表5可知,肉仔雞感染沙門菌對細胞因子和免疫球蛋白影響較大。在血清中,S組、S+P組和S+A組TNF-α、IFN-γ和IL-6細胞因子含量極顯著高于C組(P<0.01),治療后S+P組和S+A組的細胞因子含量極顯著低于S組(P<0.01),且S+P組極顯著高于S+A組(P<0.01);在空腸中,S組sIgA含量最低,且顯著低于S+P組(P<0.05),其余三組間差異不顯著(P>0.05),與C組相比,除S+A組IL-6含量差異不顯著(P>0.05)外,其余各組TNF-α、IFN-γ和IL-6細胞因子含量極顯著升高(P<0.01),且S+P組TNF-α和IFN-γ含量極顯著高于S+A組(P<0.01);同樣,在回腸中S組sIgA含量最低,且極顯著低于S+P組和S+A組(P<0.01),且S+P組極顯著高于C組(P<0.01),S+A組與C組差異不顯著(P>0.05),S組TNF-α、IFN-γ和IL-6細胞因子極顯著高于C組(P<0.01),治療后,與S組相比,S+A組TNF-α以及S+P組IFN-γ和IL-6含量極顯著降低(P<0.01),且S+P組和S+A組差異不顯著(P>0.05)。

表5 噬菌體對感染沙門菌肉仔雞細胞因子和免疫球蛋白含量的影響

3 討 論

3.1 噬菌體對感染沙門菌肉仔雞存活率和體重的影響

由于雛雞消化道和免疫功能尚未發育完全,因此雛雞是腸炎沙門菌的易感宿主,尤其對1～3日齡的雛雞毒力極高,死亡率也很高,對成年雞的感染大多以癥狀不明顯的隱性感染為主[11]。目前,已有大量的研究表明[12-15],肉仔雞感染沙門菌后,死亡率增加且生長性能大幅下降。在本研究中,攻毒后第1天,攻毒組存活率下降至77%,第2天下降至64%,第5天時存活率僅為59%,此后死亡率沒有大幅變化,這也進一步說明,腸炎沙門菌對1～5日齡雛雞毒力極大。目前,關于噬菌體治療沙門菌感染肉仔雞的效果大多為積極的結果。Tie等[16]研究表明,隨著噬菌體治療劑量的增加,肉仔雞存活率也明顯呈現出劑量依賴性,口服噬菌體效價1010PFU·mL-180 μL的存活率顯著高于攻毒組,說明噬菌體對沙門菌感染具有較好的治療作用,但是其存活率略低于呋喃唑酮組;在Berchieri等[17]的研究中,效價為1010PFU·mL-1的噬菌體組死亡率顯著低于攻毒組,但是稀釋100或10 000倍后,死亡率與攻毒組差異不顯著,說明噬菌體在體內發揮作用需要一定的效價保證;Toro等[18]研究指出,腸炎沙門菌攻毒后肉仔雞生長性能顯著降低,在整個試驗期都保持較低的體重,噬菌體治療后體重有不同程度恢復,18日齡時,噬菌體組體重較攻毒組提高15.3%。本研究中肉仔雞經噬菌體治療后,存活率大幅提高,與攻毒組相比,存活率提高25%以上。同樣,沙門菌感染極大地影響了肉仔雞的生長性能,攻毒組體重極顯著低于對照組、噬菌體組和抗生素組,經治療后能夠在一定程度上恢復生長,但是較對照組體重低6%～7%,且噬菌體治療組與抗生素組差異不顯著,這也說明了噬菌體對宿主菌感染有較強的治療作用,在生存率和恢復生長方面與抗生素作用相當。

3.2 噬菌體對感染沙門菌肉仔雞免疫器官的影響

家禽免疫器官指數是反映免疫器官生長發育狀況的重要指標,指數的高低在一定程度上可以反映出機體的免疫防御功能。脾是禽類最大的外周免疫器官,是淋巴細胞定居和對抗原刺激進行免疫應答的場所,含有樹突狀細胞、B淋巴細胞、巨噬細胞和漿細胞等,具有較強的吞噬和過濾作用;胸腺是家禽的中樞免疫器官,淋巴干細胞進入胸腺后在胸腺肽的誘導下,發育分化為成熟的T細胞,家禽性成熟后,胸腺逐漸退化;法氏囊是禽類特有的免疫器官,來自骨髓的干細胞在法氏囊囊素的誘導下分化為成熟的B細胞,家禽性成熟后,法氏囊逐漸退化[19]。本研究中,肉仔雞沙門菌感染后可導致脾重量增加,指數升高,但是對法氏囊和胸腺沒有顯著影響,經噬菌體和抗生素治療后,脾重量和指數改善不明顯,與攻毒組差異不顯著。目前已有研究表明,雛雞[20]、雛鴨[21]和小鼠[22]感染沙門菌可導致脾腫大,脾臟指數升高,這與本試驗研究結果相一致。

3.3 噬菌體對感染沙門菌肉仔雞腸道菌群的影響

腸道菌群包括黏膜菌群和腸腔菌群,黏膜菌群以乳酸菌和雙歧桿菌為主,腸腔菌群大多以大腸桿菌和腸球菌為優勢菌群,腸腔菌群黏附在腸黏膜上,形成了多層次的腸道微生物屏障[23]。機體在健康狀態下,腸道微生物的數量、種類和分布相對穩定,但是易受飼料、環境、病原體、免疫、應激等因素的影響,導致腸道菌群失調、功能紊亂,在臨床上表現為生長緩慢、腹瀉、免疫力低下等,給畜禽生產造成極大地損失。進入腸道的沙門菌在遠端空腸、回腸和大腸侵入腸黏膜,首先穿越腸上皮屏障,引發機體免疫反應,刺激吞噬細胞增殖,沙門菌在吞噬細胞內大量繁殖,誘導吞噬細胞凋亡或壞死,最后通過血液達到全身各個組織器官。本試驗中,肉仔雞感染腸炎沙門菌后,各腸段總菌數、腸桿菌數和沙門菌數極顯著增加,但是在空腸中并未檢出沙門菌,這可能是由于空腸中沙門菌定植量低。噬菌體治療沙門菌感染的效果受攻毒后給藥時間、噬菌體效價及療程等多方面的影響。沙門菌攻毒后噬菌體干預越早,治療效果就越好。Toro等[18]用沙門菌攻毒4 h后采用噬菌體雞尾酒療法,能夠極顯著降低肉雞小腸、盲腸和脾的沙門菌載量;同樣,在Atterbury等[24]的研究中,沙門菌攻毒24 h內采用噬菌體治療,能夠極顯著降低肉雞盲腸中沙門菌數量;Bardina等[25]對沙門菌感染后第4或5天雛雞采用噬菌體雞尾酒療法,每天按1010PFU·只-1口服兩次,連續治療2 d,結果表明,當沙門菌在腸道定植后再用噬菌體治療,腸道沙門菌數量并沒有顯著降低。在本研究中,攻毒6 h后就采用噬菌體干預,能夠極顯著降低回腸和盲腸中沙門菌數量,抗生素組的各腸段載菌量趨勢與噬菌體組基本一致,但是總菌數極顯著低于噬菌體組,且回腸沙門菌數極顯著低于噬菌體組,但是盲腸中沙門菌數與噬菌體組差異不顯著。這也進一步說明,噬菌體宿主專一性強,對其有較強的殺菌能力且作用與抗生素相當,而抗生素抗菌譜廣,對總菌落數有顯著影響,在殺滅有害菌的同時對其他菌也有影響。

3.4 噬菌體對感染沙門菌肉仔雞血清及組織噬菌體載量的影響

噬菌體效價濃度同樣也影響著治療效果。目前,大多數噬菌體治療成功的動物模型均采用了較高的噬菌體/致病菌比例(較高的感染復數MOI),效價濃度要高于致病菌濃度,盡管在理論上噬菌體的增殖是按照指數式增長(200n/20 min),因而可以使用較小劑量進行治療,但是足夠多的噬菌體是有效治療全身性細菌感染的保證[26]。Atterbury等[24]用濃度為3×103CFU·只-1腸炎沙門菌攻毒,1 h后用109PFU·只-1治療,能夠極顯著降低肉雞盲腸中沙門菌數量;同樣在Andreatti Filho等[27]、Waseh等[28]研究中,也得到了相類似的結果。本研究中,腸炎沙門菌攻毒濃度為109CFU·mL-1,噬菌體的效價為1012PFU·mL-1,與上述研究結果相一致。

為保證噬菌體治療效果,除了以致病菌為宿主分離篩選出具有高裂解活性的噬菌體外,給藥形式對其效果的發揮也起著關鍵作用。目前,常用的噬菌體給藥途徑一般為口服和非消化道途徑(皮下注射、肌肉注射等),隨著噬菌體治療細菌性感染應用的進一步廣泛,一些新型的給藥方式如局部表面、噴霧、口腔、介入等相繼出現[29]。口服給藥是噬菌體治療胃腸道細菌性感染的有效途徑,但是易受胃酸、膽汁酸、消化酶以及腸道菌群的影響而失活,治療效果不易控制[30]。注射方式操作簡單,治療效果好,是目前最常用的噬菌體給藥方式。Mcvay等[31]比較了肌肉注射、皮下注射和腹腔注射噬菌體對綠膿桿菌感染小鼠的保護作用,結果表明,與對照組(存活率6%)相比,這三種治療方式均能顯著提高小鼠的存活率,其中腹腔注射的存活率可達87%,而肌肉注射和皮下注射的存活率分別為28%和22%,其主要原因可能是由于腹腔注射方式給藥劑量更高,時間更早,更持久,能夠持續地傳遞到血液、脾和肝中。因此,本研究采用腹腔注射的方式,按劑量1 mL·只-1(1012PFU·mL-1),連續治療7 d,間隔12 h。

注射是噬菌體最有效的給藥方式之一,可通過血液循環到達包括神經中樞在內的所有器官與組織。注射噬菌體不僅有效,而且傳遞速度很快,有研究表明,噬菌體在1 h內(最短僅需要5 min)就可以達到體內循環[32]。與皮下注射和肌肉注射相比,腹腔注射噬菌體到達血液的時間更快,血液中噬菌體的滴度更高[33]。進入血液循環的噬菌體濃度很大程度上受給藥劑量的影響,呈現出很強的劑量依賴關系[34]。在早期的研究結果中[35],靜脈注射噬菌體2.5 min后,兔血液中實際噬菌體滴度比通過血液容積計算的理論噬菌體滴度低了100倍;同樣,小鼠靜脈注射噬菌體1～5 min和0.5 h后血液噬菌體理論滴度分別為0.4和0.068,但是實際滴度僅為0.02和0.003[36]。其主要原因在于,噬菌體進入體循環后,不僅受到血液容積的影響會被體液稀釋,還會被網狀內皮細胞捕獲或吞噬[37]。肝和脾是噬菌體聚集的主要場所,在數分鐘內就可達到,1～3 h就可達到滴度高峰[38],尤其是脾,是噬菌體存活最長的器官,甚至給藥多天后仍能檢測出噬菌體的存在。本研究中噬菌體治療采用腹腔注射,每天2次,連續7 d,在血液和肝中均能檢測出噬菌體,且噬菌體效價極顯著高于其他組,這與上述研究結果基本一致,但是肝中噬菌體效價低于血液,這可能是受采樣先后順序的影響。目前,關于噬菌體在消化道分布的研究集中在口服給藥方面,注射途徑的研究較少。Smith和Huggins[39]研究指出,口服噬菌體在腸淋巴結中聚集,而在血液和脾中滴度很低,這也表明腸淋巴結是導致不同給藥途徑噬菌體效率不同的原因;Bao等[40]研究指出,口服噬菌體僅有一小部分能夠在胃酸環境中存活并進入消化道,消化道中的噬菌體僅占原始噬菌體的1%,在消化道各腸段中,盲腸噬菌體效價最高(104～105PFU·mL-1),大部分噬菌體通過糞便排出。本研究中,噬菌體組血清、肝和腸道中的噬菌體效價極顯著高于其余三組(P<0.01),而且盲腸的噬菌體效價高于空腸和回腸,且消化道噬菌體效價遠高于血液和肝,這也進一步說明,通過腹腔注射噬菌體能夠達到腸道的不同部位,傳遞效率要優于口服途徑,受消化酶、胃酸、飼料等因素影響,消化道后端的噬菌體效價要高于前端。

3.5 噬菌體對感染沙門菌肉仔雞抗氧化指標的影響

機體抗氧化能力與健康程度密切相關。T-SOD和GSH-Px是特異性消除超氧自由基和過氧化物的抗氧化酶類,主要防御過氧化作用引起的組織損傷;MDA是脂質過氧化產物,其含量反映了機體脂質過氧化程度,間接反映細胞的損傷程度。沙門菌等病原微生物的感染會導致腸道中性粒細胞遷移至炎癥部位吞噬沙門菌,引起呼吸爆發,并產生大量的強氧化物質(ROS),破壞腸上皮細胞,引起腸黏膜屏障功能損傷[41]。腸道黏膜受損就會導致細菌位移,毒素等有害物質進入到血液循環,從而引起全身性的氧化應激反應,在臨床上往往表現為試驗動物肝、脾及各消化道SOD、GSH-Px等抗氧化酶活性降低,MDA含量上升的全身性癥狀[42]。在本研究中,采用腹腔注射的方式攻毒,劑量為200 μL·只-1(109CFU·mL-1),可導致肉仔雞血液、肝及腸道T-SOD和GSH-Px活性降低,MDA含量增加,說明試驗動物氧化還原狀態失衡,發生氧化應激,造成全身性癥狀。目前,關于噬菌體治療對機體抗氧化能力影響的研究報道較少,劉燕坤等[43]研究指出,噬菌體雞尾酒有升高斷奶仔豬血液CAT活性的趨勢,但是對其他抗氧化指標沒有顯著影響;楊瑞思等[44]采用噬菌體復合裂解酶制劑(200 mg·kg-1)能夠極顯著提高肉雞肝中抗氧化酶活性。本試驗中,經噬菌體治療后,血液、肝及腸道SOD和GSH-Px活性較攻毒組極顯著升高,但是仍極顯著低于對照組,同樣MDA含量較攻毒組降低,但也高于對照組,與抗生素組差異不顯著,與上述結果一致,這也進一步說明,噬菌體能夠通過清除病原菌而減緩機體氧化損傷。

3.6 噬菌體對感染沙門菌肉仔雞細胞因子和免疫球蛋白含量的影響

腸炎沙門菌在侵染機體的過程中,啟動先天免疫激活了中性粒細胞、巨噬細胞等,產生大量的TNF-α、IL-6及INF-γ等炎癥因子,造成腸絨毛融合和扁平化[45]。IFN-γ通過影響巨噬細胞激活的程度在控制持續性感染中起著核心作用[46]。在本研究中,通過檢測血液及腸道中TNF-α、IL-6及IFN-γ含量發現,沙門菌感染后細胞因子極顯著升高,這與趙景鵬等[13]、梁桂星[47]、石水琴[48]等研究結果一致。分泌性免疫球蛋白A(sIgA)主要存在于唾液、乳液、胃腸液和呼吸道分泌物等外分泌液中,在腸道黏膜免疫中通過維持腸道黏膜內環境穩態,干擾病原體和上皮細胞受體結合,免疫排異清除病原體和降低病原菌毒力,從而實現對機體的保護[49],此外,sIgA還能調控腸道微生物的組成,確保微生物與宿主的共生關系[50]。經過長期的進化,病原微生物能夠分泌出一種水解腸道黏膜sIgA的酶類,有助于微生物的定植。本研究中,沙門菌攻毒后空腸和回腸中sIgA含量較對照組極顯著降低,表明了腸道黏膜免疫能力的下降,這與Yang等[12]和Song等[51]研究結果相一致。目前,已有相關研究表明,噬菌體通過影響NF-κB途徑,對機體細胞因子的產生有較強的調控作用[52]。從動物應用的成功案例來看,噬菌體改善了與細菌感染相關的細胞因子的升高。Zimecki等[53]研究指出,噬菌體能夠顯著降低金黃色葡萄球菌感染小鼠血液中TNF及IL-6細胞因子的含量,顯著增加淋巴細胞系中性粒細胞和未成熟細胞的百分比,以及骨髓中骨髓細胞和未成熟中性粒細胞的百分比;同樣,在Kumari等[54]的研究中,肺炎克雷伯菌噬菌體能夠顯著降低燒傷小鼠血液及肺中IL-1b、TNF-α和IL-10細胞因子的含量,從而有效提高了存活率。本研究中,采用噬菌體治療后,血液、空腸及回腸中TNF-α、IFN-γ和IL-6細胞因子含量極顯著低于攻毒組,與上述結果相一致。目前,關于噬菌體對sIgA含量影響的研究很少,從現有研究結果來看,對沙門菌感染有治療作用的益生菌[12]、植物提取物[51]等均能誘導機體分泌sIgA。本研究中,與攻毒組相比噬菌體能夠顯著或極顯著提高空腸和回腸中sIgA含量,優于抗生素組(未達到差異顯著水平),說明在一定程度上能夠增強肉仔雞的腸道黏膜免疫力。

4 結 論

肉仔雞感染腸炎沙門菌可破壞腸道黏膜屏障,造成生長受阻、組織損傷及全身性炎癥反應,通過噬菌體治療可通過宿主專一性殺滅腸炎沙門菌,從而顯著提高機體抗氧化能力和腸道黏膜屏障,緩解氧化應激和炎癥反應,具有較強的保護作用,在一定程度上能夠恢復肉仔雞生長。