奶牛生殖道微生物與繁殖及相關疾病的研究進展

沈文娟,楊 卓,張馨蕊,付 予,陶金忠

(寧夏大學動物科技學院,銀川 750021)

繁殖是物種延續的必要條件。動物的繁殖效率由受胎率、胚胎早期丟失率、流產率和胎兒早產等因素決定,同時受到生殖道特定微生物的影響[1]。近年來關于宿主與微生物關系的研究受到了重點關注。生物有機體體表和體內棲息著種類各異且數量繁多的微生物,其中動物的口腔、腸道、陰道以及皮膚是動物體的四大菌庫。當它們處于一定比例時,與宿主形成相互依存和相互制約的平衡體。近年來微生物研究者對生殖道微生物進行了大量研究,取得了豐碩的成果[2-3]。

生殖道微生物主要包括陰道、外宮頸口和子宮定植的微生物群,生殖道內微生物種類繁多,微生物群落的形成和穩定是其與宿主和環境相互適應的長期進化結果,三者之間處于一個協調和平衡的動態關系,且易受宿主激素水平、飼養方式和藥物使用等因素的影響[4]。共生的生殖道微生物可能會影響奶牛的繁殖能力,既可以與生殖道上皮細胞組成防御系統,也可通過代謝產物抑制病原菌生長[2]。菌群與環境和宿主間互相保持平衡并維持宿主生殖系統的正常生理功能,生殖道微生態的穩定和平衡關系影響各種生殖疾病的發生、發展和治療[5]。研究證明,與人類陰道微生物群相比,牛的子宮和陰道微生物群具有更高的多樣性[6]。生殖道內菌群的紊亂和失衡易引發陰道炎和子宮內膜炎等生殖道疾病[7]。因生殖道微生物與宿主的健康密切相關,其與宿主的健康和疾病之間的關系已迅速發展成了一個新的科學研究領域,這篇綜述將就奶牛生殖道微生物變化規律探討及其與生殖道疾病之間的關系。

1 奶牛生殖道微生物變化規律

1.1 陰道微生物

健康牛生殖道微生物菌群由需氧、兼性厭氧和專性厭氧微生物組成,但各類型菌群占比不同,對維持宿主陰道菌群定植具有重要作用[8]。Clemmons等[1]指出,奶牛陰道內的許多菌群與腸道細菌重疊,這可能是由于陰道口的空間位置與肛門非常接近,加之,肛門位于陰道口上部,動物排出的糞便經常沾染到外陰,導致大量腸道菌群可通過擴散遷移的方式進入陰道內。健康奶牛陰道中菌群主要包括乳桿菌屬(Lactobacillus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、腸桿菌屬(Enterobacter)和少量真菌[9],其中乳酸菌為主要優勢菌,多為兼性厭氧菌,能夠分解糖、蛋白質等物質產生乳酸,維持和保護生殖道內的弱酸性環境[10]。李炳志[10]對產后健康奶牛陰道細菌進行分離鑒定發現優勢菌為表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)和乳酸桿菌(Lactobacillussp.)。研究證明,乳酸菌是了解陰道狀況的關鍵,卷曲乳酸桿菌(Lactobacilluscrispatus)、惰性乳桿菌(Lactobacillusiners)可以作為區分陰道內菌群由正常到異常狀態變化的一個重要標志[11]。

1.2 子宮微生物

傳統觀念認為健康子宮是無菌的[12],尤其在妊娠階段,為胚胎發育場所提供必要的無菌環境。然而,已有研究在胎盤不同區域檢測到了細菌[13]。Onderdonk等[14]通過PCR在新生兒絨毛膜檢測到細菌與支原體存在,并發現葡萄球菌(Staphylococcus)和棒狀桿菌屬(Corynebacterium)以及與細菌性陰道病相關的物種;Moore等[15]驗證了子宮具有微生物組的假設,在母牛子宮內膜、羊水、宮頸腔等各組織中檢測出不同比例的微生物菌群,其中厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和變形菌門(Proteobacteria)為優勢菌。子宮內微生物可能是通過產后初期松弛的陰道和擴張的子宮頸進入,利用子宮內適宜的環境和溫度進行繁殖,也可能是子宮復舊完成時內部細菌未被完全清除,而陰道和子宮頸對子宮環境的保護可能有助于減少子宮腔內微生物的多樣性[1]。在正常情況下通過自身的防御機能凈化子宮,抵御病原微生物定植。奶牛的自然防御機制可以消除許多病原微生物,但消除的效率取決于細菌致病性和機體免疫狀態[16]。

2 奶牛不同生理階段生殖道微生物結構及豐度變化規律

2.1 發情周期奶牛生殖道微生物變化規律

Michael[17]研究靈長類動物提出卵巢分泌的類固醇激素可以影響短鏈脂肪酸的產生,調節陰道菌群結構。Otero等[18]使用傳統培養方法評估了發情周期中奶牛陰道微生物菌群的變化,結果發現卵泡期陰道乳桿菌及腸球菌(Enterococcussp.)的豐度顯著高于黃體期,說明乳桿菌和腸球菌在高P4階段豐度降低。Quereda等[19]對初次配種的奶牛卵泡期和黃體期陰道微生物區系進行了研究也印證了這一點,即卵泡期乳桿菌屬的相對豐度高于黃體期,且發現軟壁菌門(Tendericutes)、厚壁菌門和擬桿菌門占陰道微生物區系的75%,其次為變形菌門、放線菌門(Actinobacteria)和梭菌門(Fusobacteria)、Epsilonbacteraeota、髕骨菌(Patescibacteria)等。Cowley和Heiss[20]對發情周期不同階段小鼠陰道菌群的研究發現,卵泡期陰道微生物多樣性顯著增加,鏈球菌和乳酸菌(Lacticacidbacteria)豐度升高;劉暢等[21]研究不同生理時期肉牛陰道菌群結構差異發現,卵泡期細菌總數、乳桿菌屬豐度顯著高于黃體期,與Otero等[18]的報道結果一致,可能是發情周期階段孕激素(P4)和雌二醇(E2)等激素的周期性變化導致生殖道pH發生變化,進而影響陰道細菌豐度的變化。同時微生物的變化也引起其代謝產物的變化,如在發情期間機體E2升高,陰道乳酸菌等菌類豐度升高,其產生的脂肪酸使pH下降,同時脂肪酸作為誘導劑可促進奶牛發情[17],但具體機理還不清楚。

在發情周期,子宮微生物也發生了一定的變化規律,Ault等[22]研究健康奶牛子宮微生物時發現奶牛在人工授精前2 d細菌多樣性顯著下降,可能是為妊娠營造適宜環境。隨著發情的周期性變化,子宮內細菌群落多樣性也呈周期性變化。基于以上研究結果,提示發情周期不同階段,卵巢類固醇激素的周期性變化,導致陰道菌群存在周期性變化,卵泡期陰道產酸的乳桿菌屬豐度增加,陰道呈弱酸性環境,且微生物多樣性高于黃體期,而子宮微生物多樣性在卵泡期降低。

2.2 妊娠期奶牛生殖道微生物變化規律

妊娠期生殖道環境處于動態變化,菌群結構多變復雜[23]。整個繁殖周期,母體營養、激素、免疫系統和微生物等因素協同作用以維持母體生命活動和妊娠[24]。妊娠期間,P4水平升高[25]、宿主免疫調節能力發生變化[26-27]。Messman等[28]研究顯示,不同妊娠狀態和雌二醇濃度母牛陰道整體細菌群落特征無顯著差異,但在不同妊娠狀態下存在物種水平差異,妊娠母牛陰道存在較多的多殺性巴氏桿菌(P.multocida),未妊娠母牛陰道存在豐度較高的未分類巴斯德菌科(Pasteurellaceae)和未分類梭桿菌屬(Fusobacterium),這些差異可能改變陰道環境,從而影響生育能力和陰道健康。妊娠期間雌激素水平升高,陰道黏膜增厚,糖原沉積增加,糖原作為乳酸菌生產乳酸的主要碳水化合物,有助于陰道pH的保護[29],乳酸菌占據主要優勢,生殖道微生物發生顯著變化,整體微生物豐度和多樣性降低[23,30]。Genís等[31]在產犢前3周將乳酸菌菌株作為益生菌注入奶牛陰道和子宮中,奶牛分娩后患子宮炎的幾率較低,說明產乳酸菌可能對妊娠期奶牛生殖健康和繁殖能力有益。Moore等[15]研究顯示,妊娠母牛子宮內豐度最高的為厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門,且妊娠子宮各組織的門水平物種相似;Aagaard等[23]研究報道,健康孕婦妊娠期的物種多樣性和豐富度均下降,優勢種為乳酸桿菌、梭菌目(Clostridiales)、擬桿菌目(Bacteroidales)和放線菌目(Bacteroidales);Deng等[32]對TAI后不同妊娠階段奶牛陰道微生物測序分析,顯示不同妊娠階段陰道微生物群落多樣性存在顯著差異,妊娠中期和后期微生物多樣性降低。子宮細菌群落的發育組成影響繁殖能力,表明生殖道微生物群落多樣性與系統發育關系的變化可能與妊娠的建立存在密切相關性。綜上,妊娠后的陰道微生物區系相較于未妊娠具有更高的穩定性,奶牛在妊娠期子宮微生物豐度和多樣性降低,繁殖前細菌豐度的差異可能會影響生殖道環境,潛在的影響繁殖。

3 產后奶牛生殖道微生物變化規律

3.1 產后陰道微生物結構組成

產后陰道菌群的構建是一個動態演變的過程,隨產后時間的延長,陰道菌群的復雜度在不斷增加(表1)。不同品種、健康狀況和生理階段的牛其陰道微生物組成差異顯著,Nesengani等[33]比較發現,荷斯坦奶牛生殖道中放線桿菌屬相對豐度顯著高于海福特牛,費克藍姆氏菌屬(Facklamia)和睡眠嗜組織菌屬(Histotrophil)在海福特牛生殖道中的相對豐度則高于荷斯坦奶牛,而牛生殖道菌群結構變化的潛在機制以及與生殖的關系有待進一步研究。

表1 奶牛生殖道微生物優勢菌

3.2 產后正常子宮微生物結構及豐度變化

產后子宮內細菌群落隨時間高度動態變化。王國卿[38]認為,產后第7天牛子宮內總細菌豐度達到最高,此后逐漸減少,產后第36～46 天完成子宮復舊,子宮中細菌數降到最低(最低稀釋度1×10-7,最低稀釋度的菌落數小于30個)。產后子宮環境逐漸改變有利于厭氧菌如擬桿菌門和梭桿菌門的生長,這種變化可能是由于胎盤的血流停止,子宮中剩余血液、羊水和尿囊液等組成的惡露以及分娩結束后子宮形成的低氧環境為厭氧菌的生長創造理想條件[39]。通過對奶牛產后1～32 d進行跟蹤采樣,發現子宮內以大腸桿菌、鏈球菌、變形桿菌和梭狀芽胞桿菌為主[40],但也有研究報道在產后奶牛子宮中分離到了葡萄球菌、棒狀桿菌和假單胞桿菌(Pseudomonas)等[9],這些報道的結果不同可能與環境、飼養管理及個體差異有關。產后早期由于分娩時生殖道受環境或助產的污染,導致子宮內大腸桿菌、擬桿菌、表皮葡萄球菌檢出率增加,到第7天左右達到最高;之后隨著產后時間的延長,惡露排出、生殖道機能以及自身免疫系統的恢復,這些環境病原菌逐漸下降。人類研究表明,大多數女性分娩后生殖道菌群平衡出現紊亂,乳酸桿菌多樣性減少,厭氧菌如嗜胨菌屬(Peptoniphilus)、普氏菌屬(Prevotella)和厭氧球菌屬(Anaerococcus)增加[41]。生殖道細菌多樣性失衡會影響后續妊娠的建立和維持,尤其乳酸菌的豐度降低與疾病和生殖能力下降相關[42]。總之,奶牛產后早期子宮中微生物數量先升高,其中厭氧菌及條件病原菌比例增加,乳酸菌數量減少;之后逐漸轉變為產后晚期微生物數量減少,厭氧菌及條件病原菌比例下降,乳酸菌數量增加。

4 生殖道感染微生物菌群特征及疾病

4.1 奶牛陰道菌群失衡

生殖道微生物群落能夠影響生殖道健康,但生殖道內的菌群同時受到生殖道環境的影響。當受到內源性或外源性因素影響時菌群結構劇烈變化,陰道內微生物失衡,由正常生理性狀態轉變為病理性狀態[22]。研究發現,患細菌性生殖道疾病的奶牛陰道微生物群落菌群多樣性比健康奶牛更加豐富[43],其中厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門和梭桿菌門豐度顯著增加,并存在一些以往未發現的低豐度菌群,因此生殖道內微生物紊亂是陰道炎癥的關鍵因素。

奶牛陰道中定植的大腸桿菌、葡萄球菌、加德納氏菌等可能是作為條件性致病菌,當機體免疫機能低下時條件病原菌大量繁殖引起陰道炎,并伴有乳桿菌減少的菌群紊亂[44]。凌宗欣[45]對女性生殖道微生物的研究發現,生殖道感染是由乳桿菌為主的陰道正常菌群轉換為兼性厭氧菌為主的如加德納菌屬(Gardnerella)、奇異菌屬(Atopobium)、普氏菌屬等致病性微生物菌群。乳酸菌是健康奶牛的生殖道優勢菌,不孕癥奶牛生殖道乳酸菌豐度顯著降低,金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)成為優勢菌群[42,46],提示陰道菌群的結構失衡可能與子宮內膜炎的發生有關。Peng等[47]報道了產后第10天健康奶牛和子宮炎奶牛陰道優勢菌群為擬桿菌門、厚壁菌門和梭桿菌門,第40天主要菌群為擬桿菌門、厚壁菌門、軟壁菌門和變形菌門,且子宮炎奶牛梭桿菌門豐度顯著高于健康奶牛;Wang等[34]發現,健康和子宮炎奶牛陰道中均含有腸球菌屬(Enterococcus)、乳酸菌屬和小球菌屬(Micrococcus)的桿菌群,子宮炎奶牛陰道菌群豐度顯著增加,且以大腸桿菌為主。因此,患有細菌性陰道炎奶牛的陰道中未分離出特定病原菌,只是某些條件性致病菌如大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等豐度發生了變化[48],說明生殖道微生物菌群紊亂是造成炎癥的關鍵因素[49]。綜上所述,奶牛陰道感染后菌群結構比健康奶牛更為復雜,且無特定病原菌,陰道內病原微生物的大量定植及結構失衡是造成奶牛陰道疾病的關鍵因素。

4.2 子宮感染微生物菌群變化規律與疾病

奶牛分娩后因助產不當、胎衣不下、免疫機能低下、環境條件差及生殖道中病原微生物過度生長等因素導致子宮感染,引發奶牛子宮炎和子宮內膜炎。子宮炎是子宮壁的一種深度炎癥,通常發生在產后21 d內,子宮內膜炎和亞臨床子宮內膜炎發生在產后21 d或以上[50],可引起子宮組織和子宮內膜結構破壞[51],奶牛產后子宮感染常造成不發情、不排卵和黃體期延長,導致配種受胎率降低,嚴重者因繁殖能力喪失而淘汰,造成養殖業巨大的經濟損失[52]。當奶牛產后造成感染,而惡露有利于微生物繁殖,且產后奶牛大多處于免疫抑制,在眾多因素的作用下引起細菌性子宮內膜炎等繁殖性疾病[53]。基于16S rRNA擴增子測序的研究表明,與健康奶牛子宮微生物群結構相比,子宮炎奶牛子宮細菌群落物種多樣性更豐富,結構組成不均衡,子宮微生物群更加復雜[43,54]。

Chen等[55]發現,患子宮內膜炎患者生殖道微生物菌群因定植部位不同而不同,陰道以乳酸桿菌為絕對優勢菌群,而在宮腔、輸卵管中乳酸桿菌豐度下降,假單胞桿菌和鮑氏不動桿菌(Acinetobacterbaumannii)豐度逐漸增加,宮腔菌群的改變引起子宮內膜炎反應機制改變,釋放出的炎性物質促進了炎癥發生和發展[56]。基于細菌的培養發現,大腸桿菌、化膿隱秘桿菌(Arcanobacteriumpyogenes)、壞死梭桿菌(Fusobacteriumnecrophorum)和產黑素普雷沃氏菌(Prevotellamelaninogenicus)等病原菌在產后過度生長,導致子宮內膜炎或子宮積膿[57]。Takcs等[58]認為,子宮受到污染主要發生在產后10～21 d,以鏈球菌、大腸桿菌和棒狀桿菌最常見;彭宇[59]對產后10、20、30、40天奶牛樣本測序發現優勢菌群分別為葡萄球菌、產氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)、沙門氏菌(Salmonella)和葡萄球菌。Jeon等[39]研究發現,擬桿菌門在子宮內膜炎奶牛中豐度顯著高于健康奶牛,其次為梭桿菌屬,其他細菌如螺旋菌、絲狀菌(Filamentousbacteria)、卟啉單胞菌屬、普雷沃氏菌屬(Prevotella)等;劉超遜等[60]發現,引起水牛產后子宮內膜炎的主要致病菌為壞死梭桿菌、卟啉單胞菌屬(Porphyromonas)和解肝素擬桿菌(Bacteroidesheparinolyticus)。孫城濤等[61]報道,大腸桿菌同時存在于健康及患病奶牛中,但患病奶牛陰道內大腸桿菌豐度顯著高于健康奶牛,且顯著高于其他細菌總和,陰道條件性病原微生物的豐度增加和結構失衡可能是奶牛子宮內膜炎的患病原因。子宮疾病可能更依賴于特定細菌的過度生長和免疫系統的反應性,某些致病菌的過度生長可能會導致微生物整體多樣性增加,引發子宮感染性疾病[12,39]。子宮正常復舊期間和復舊完成后發情期間的奶牛子宮內細菌與患子宮內膜炎奶牛子宮內細菌種類有相似性。因此,正常情況下子宮內存在的條件致病菌可引起子宮內膜炎。同時,在產后子宮內膜炎中也發現了真菌如白色念珠菌感染[62]。另外,從未配種的青年母牛也會發生由大腸桿菌、假單胞桿菌引起的子宮內膜炎[63]。子宮內膜炎奶牛產后子宮內細菌多樣性均呈現先升高后降低的演替規律,子宮內膜炎奶牛陰道內乳酸菌顯著減少,大腸桿菌、鏈球菌等條件致病菌顯著增加[53]。綜上所述,奶牛產犢后早期健康奶牛和患子宮內膜炎奶牛存在一個共有的子宮微生物群,而后患子宮內膜炎奶牛微生物群迅速變化,導致與炎癥相關條件致病菌群大量繁殖,細菌多樣性增加,具有明顯的時間動態變化。

綜上所述,陰道菌群的變化是一個動態過程[64],生殖道微生物與奶牛的發情周期呈現一致性變化規律,妊娠期及產后期生殖道微生物的豐度和多樣性也呈規律性變化。生殖道微生物的紊亂導致疾病的發生,也影響奶牛的繁殖效率。鑒于細菌在維持生殖道穩態方面的關鍵作用,奶牛產后陰道和子宮微生物研究對解決子宮細菌污染、預防和治療產后子宮內膜炎具有重要意義。奶牛生殖道微生物多樣性復雜,且受品種、生理階段及個體差異的因素影響。