細菌外膜囊泡結構、分泌特性及致病機制

高遠集,劉 暢,陳 淼,陳松彪,張俊峰,李 靜,賈艷艷,廖成水,郭榮顯,丁 軻,余祖華*,尚 珂*

(1.河南科技大學動物科技學院/功能微生物與畜禽健康實驗室,洛陽 471003;2.洛陽市活載體生物材料與動物疫病防控重點實驗室,洛陽 471003;3.河南科技大學動物疫病與公共衛生重點實驗室,洛陽 471003;4.河南科技大學醫學技術與工程學院,洛陽 471003)

許多革蘭陰性菌對動物食品性安全和獸醫公共衛生造成了巨大危害,例如大腸埃希菌(Escherichiacoli,E.coli)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa,P.aeruginosa)、鼠傷寒沙門菌(SalmonellaTyphimurium,S.Typhimurium)、弗氏志賀菌(Shigellaflexneri,S.flexneri)、幽門螺旋桿菌(Helicobacterpylori,H.pylori)、溶血性曼氏桿菌(Mannheimiahaemolytica,M.haemolytica)[1],這些細菌均可以衍生一種外表為球形、脂質雙層包裹的納米顆粒,大小通常在20～250 nm[2],稱為外膜囊泡(outer membrane vesicles,OMVs)。革蘭陽性菌也可產生MVs,一般被稱為細胞質膜小泡(cytoplasmic membrane vesicles,CMVs),如炭疽桿菌(Bacillusanthraci,B.anthraci)、枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis,B.subtilis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus)[3-4]。本文主要對革蘭陰性菌進行討論。革蘭陰性菌衍生的OMVs通常源于外膜向外突出的泡狀物或內溶素引發的爆炸性細胞裂解,其中存在著與親本細菌相同的大部分成分(LPS、脂蛋白、PG、DNA、RNA等)[5]。最新研究表明,OMVs主要由基因毒性應激誘導釋放[6],且OMVs釋放量和組成會受壓力因素(如溫度、pH和抗生素)的影響[7-9]。到目前為止,已經證實革蘭陰性菌中存在六種分泌系統,稱為分泌系統I～VI(TSS1-6),而7型分泌系統僅存在分支桿菌(Mycobacterium)中[10]。最近,有研究學者認為OMVs是一個獨立的分泌系統,又稱為零型分泌系統(T0SS)[11],與其它分泌系統相比,還具有很多重要功能[12]:分泌脂質、疏水性及不溶性蛋白質,并使這些分子在水性介質中擴散。因此,T0SS能夠遠距離輸送多種化學物質,這些物質作為溶質包含在囊泡管腔內,也可以結合到雙層膜的中間,或者是與細胞壁結合,使囊泡內容物免受外部環境的影響。OMVs通過遞送毒素、脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、DNA和RNA以及一些小分子化合物和金屬離子等,大大增強了細菌的生存以及致病能力,使其在宿主定植和疾病發病機制中的作用越來越受到關注。因此,本文主要綜述OMVs結構、分泌特性及致病機制的最新研究進展,為深入研究細菌致病機制以及開發新的抗菌策略提供理論指導。

1 OMVs的衍生、結構和組成

1.1 OMVs的衍生

OMVs這一概念可以追溯到20世紀60年代,Bishop和Work[13]分析了在賴氨酸存在下,培養大腸桿菌突變體的上清液應無細胞存在,但這些突變體在賴氨酸限制條件下卻衍生出大量的物質,當時稱之為“細胞外脂糖肽”。且大部分細菌在各種生長條件下均可衍生OMVs,這表明OMVs的分泌可能是一個保守進化的過程[14]。

關于OMVs衍生機制,存在幾種假說。第一個假說是肽聚糖(peptidoglycan,PG)和外膜相互交聯。革蘭陰性菌細胞壁主要由外膜、內膜以及夾在兩膜中間的周質腔組成(圖1)。周質上方分布了一層薄PG,發揮著連接內外膜的作用。當細菌受到某些刺激后,脂蛋白(lipoprotein,LPP)發生變性水解,PG結構也發生了改變,引起PG-LPP之間交聯鍵的減少觸發了OMVs的形成[15-16]。第二個假設是周質蓄積的作用。當周質蛋白發生錯誤折疊或者PG片段在周質空間發生蓄積,便會對外膜產生膨壓,從而導致OMVs衍生。在銅綠假單胞菌中,Opr86基因的缺失導致了胞質絲氨酸蛋白酶的表達增加,細胞質中外膜蛋白(outer membrane protein,OMP)的錯誤折疊誘導了OMVs的生物發生[17-18]。第三個假設稱之為“雙層耦合模型”。在外膜LPS中,脂質A參與膜不對稱以及結構改變中起著非常重要的作用。如果脂質A發生了去酰基化,則會引起膜重塑,增加外膜曲率,引起OMVs的衍生。第四種假設,當vacJ和/或yrb基因沉默或缺失時,磷脂(phospholipid,PL)在外膜的外小葉中積累,導致外小葉不對稱擴張,并促進外膜出芽形成OMVs[19]。除了以上幾種假設,還提出了一種新的OMVs形成機制,即當細菌鞭毛被外膜鞘包圍,而OMVs通常存在于有鞘的鞭毛處,當鞭毛旋轉時,這些囊泡則被釋放[9]。另外,也有人認為OMVs的衍生主要是一種應激反應,如長鏈醇和EDTA螯合劑的毒性濃度、抗生素以及滲透壓和熱休克等物理應激導致細胞釋放OMVs[20]。因此,細菌OMVs的衍生是一種完全獨立的、普通的細胞膜應激反應。

1.2 結構和組成

雖說OMVs結構與細菌外膜結構密切相關,然而與親本菌株外膜組分相比,OMVs中的組分含量會有所增加或減少,這表明OMVs和外膜結構具有一定的差異[21-22]。除了經典的球狀結構外,在其他細菌中發現管狀和細長型結構[23-24]。通過對OMVs蛋白組進行分析,發現OMVs除固有蛋白成分外,還具有非親本菌株的蛋白質成分。可以通過進行密度梯度離心純化的方法對OMVs的組分進行分析[25],以下對蛋白質、脂質、核酸進行簡單總結。

1.2.1 蛋白質 革蘭陰性菌利用OMVs分泌蛋白質的途徑非常成熟,進一步證明了其屬于一種獨立分泌系統。例如,大腸桿菌和某些腸道細菌所表達的成孔細胞毒素蛋白,如細菌溶素A(ClyA)不通過傳統的六種分泌機制釋放到細胞外環境,而是由OMVs獨立分泌系統介導分泌[26]。通過SDS-PAGE、考馬斯亮藍染色或銀染色以及Western blot方法可以檢測OMVs中蛋白的存在[27]。目前已經鑒定出幾種最豐富OMP(OmpA、OmpC和OmpF),且利用生化分析也可檢測到OMVs中的周質蛋白,如堿性磷酸酶等一系列與宿主組織黏附和侵襲有關的毒力因子。

通過蛋白質組學,鑒定出OMVs中含有大約200多種蛋白質。其中最常見的,例如孔蛋白就是一種豐富的OMP,存在于大多數OMVs中,包括Omps、PorA、PorB和OprF等;鼠蛋白水解酶(Mlt和SLT)主要負責某些細胞壁糖肽的水解,尤其是對PG的作用。此外,OMVs中也存在胞質蛋白:EF-Tu、GroEL、DnaK和兩種核糖體蛋白(S1和L7/12)等,但細胞質蛋白如何在沒有裂解或伴隨內膜的情況下進入OMVs是一個難以攻克的問題。此外,嗜肺軍團菌(Legionellapneumophila,L.pneumophila)OMVs毒力蛋白含量和培養液中可溶部分的組成在數量和質量有一定差異[28],而關于這些毒力因子作為可溶性介質以及其在OMVs中的包裝及分布中的研究卻鮮有報道。

最新研究表明,OMVs的衍生與蛋白質組成可能是一個互作的過程[29]。鼠傷寒沙門菌大量釋放OMVs,排出親本菌株內有害的LPS和蛋白質,從而快速適應新環境[30];霍亂弧菌(Vibriocholerae,V.cholerae)在感染后也有類似的適應性[31]。在大腸桿菌中,周質蛋白酶/伴侶蛋白的degP基因負責去除未折疊和錯誤折疊蛋白,其缺失后會導致OMVs增加。此外,OMVs中蛋白質還有許多其他生理功能。例如,ABC轉運蛋白中的特定營養素(LamB、BtuB和FadL)、無機離子(FepA、FhuA和Fiu)和核苷(Tsx)在細菌群落中發揮轉運作用;OMVs中的TonB依賴性受體(BtuB、FhuA和FhuE)可感知營養物質,是細菌在缺乏營養下生存的替代機制[32];OMVs中的水解酶(MltA、SLT)通過細胞壁降解殺死競爭細菌,保證自身生存;OMVs中的OmpT可降解上皮細胞或巨噬細胞產生的陽離子抗菌肽。除了致病特異性毒素外,OMVs的外膜孔蛋白(OmpA和OmpF)具有刺激免疫活性并誘導白細胞遷移,OmpA通過增強巨噬細胞對LPS的攝取,從而加強對腦微血管內皮細胞的侵襲力[32]。

1.2.2 脂質 在大多數革蘭陰性菌中,外膜的外小葉主要由LPS組成,內膜的內小葉由PL組成,并且內外表面上脂質的不對稱分布(圖1)。因此,OMVs不僅包含這些外膜成分(PL、LPS),且保留了這些成分的不對稱性,但不同細菌OMVs的成分會有所差異。腸毒性大腸桿菌(enterotoxigenicEscherichiacoli,ETEC)OMVs中主要脂質成分是甘油磷脂(glycerophospholipid,GP)、磷脂酰乙醇胺(phosphatidyl ethanolamine,PE)、磷脂酰甘油和心磷脂(cardiolipin,CL),這與OMVs的曲度有關;腦膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitidis,N.meningitidis)OMVs主要包括磷脂酰甘油和PE[33];幽門螺旋桿菌OMVs主要脂質成分為CL,其中飽和脂肪酸的含量較高,使其結構更為堅固[34]。

系統發育樹上即使相隔較遠的物種中也發現了磷脂ABC轉運系統的同源蛋白,如多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida,P.multocida)、銅綠假單胞菌和鼠傷寒沙門菌等。這表明,OMVs的形成機制可能與PL轉運存在密切聯系[35-36]。為了觸發外膜中的囊泡形成,PL從內膜到外膜的傳輸應該明顯快于從外膜到內膜的傳輸,轉運的紊亂導致其在外膜中積聚,引發OMVs釋放。腸毒性大腸桿菌OMVs中含有高濃度的磷脂酰甘油、CL和PE。相比較之下,放線共生放線桿菌(Actinobacillusactinomycetemcomitans,A.actinomycetemcomitans)OMVs含有高濃度的CL和PE,而銅綠假單胞菌僅顯示出高濃度的磷脂酰甘油,來自流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae,H.influenzae)的OMVs主要包括PE。因此,OMVs中磷脂酰甘油和PE的聚積對于闡明OMVs生物發生機制至關重要。

1.2.3 核酸 OMVs中的DNA可通過以下兩種機制衍生:存在于周質中的DNA,可與其他周質組分一起被包裹,或者源于細胞外環境中的DNA(可能來源于裂解細菌)被運送至OMVs中[37]。獲取外源DNA是細菌快速適應新環境的主要途徑之一。共享遺傳物質可以賦予細菌更強的生存機制,如抗生素抗性酶、定植結構(如菌毛)或毒性特征(如蛋白酶和毒素)[38]。因此,細菌的生存因子如何與T0SS結合,是了解細菌DNA轉移的最佳辦法[39]。

由于OMVs中的DNA對DNase處理具有抗性,因此采用DNase處理是區分不同類型囊泡DNA最有效方法。利用此方法在副流感嗜血桿菌OMVs中首次發現質粒的存在。隨后,發現OMVs含有RNA和DNA。革蘭陰性細菌OMVs中的DNA主要以環狀質粒、線性質粒和染色體片段形式存在,而革蘭陽性細菌的CMVs卻并非如此。然而,DNA和RNA具體如何被整合和分類至囊泡中的詳細機制尚未闡明。盡管DNA存在于某些OMVs中,但OMVs在不同種屬之間的遺傳物質交換中所起的作用還有待研究。

OMVs的結構和組成是其功能的基礎,也是深入研究的著手點。許多細菌抗原和多種病原相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMP)的共存使OMVs成為對抗其親本菌株的優勢疫苗。OMVs通過以空間傳播的方式將PAMP的抗原和佐劑共同遞送到相同的抗原呈遞細胞,并誘導其成熟和抗原呈遞,從而引發抗原特異性免疫反應[40]。

2 分泌特性

革蘭陰性菌通過衍生含有生物活性蛋白的OMVs,來執行多種生理過程,與其他分泌機制不同,OMVs能夠使細菌分泌不溶性分子,并與可溶性物質結合,使酶以募集、隱藏和靶向的形式運輸至遠處的靶點(圖2)。例如,細菌通過OMVs傳遞信號,以實現細菌、環境和其它細菌群落之間的通信,維持周圍環境的穩態;OMVs參與生物膜的形成和毒力因子的傳遞,增加了細菌的致病力[41]。此外,OMVs幫助細菌在惡劣的環境中生存等[42]。下面將從四個方面對OMVs的分泌特性進行總結。

2.1 細菌生存因子的分泌

當細菌處于物理、化學或應激條件下時,會衍生更多的OMVs,這表明OMVs的衍生在細菌生存機制中起著重要作用。當細菌內部產生巨大壓力時,OMVs可通過增加產量來釋放這些壓力,例如在大腸桿菌中,乙醇和高溫引起的蛋白質錯誤折疊,可增加OMVs產量[43]。Sabra等[44]報道,通過增加銅綠假單胞菌的氧飽和度,也可增加OMVs產量。另外,當細菌受到合成抗生素類化合物、宿主上皮細胞以及先天免疫細胞產生的天然抗菌劑的攻擊時,細菌釋放的OMVs可以充當誘餌,吸收抗菌化合物,將耐藥基因瞬轉至鄰近細胞,促進非可逆性的基因橫向轉移,增加微生物群體的長期耐藥性;也可以介導其它細菌聚集,共同對抗宿主上皮細胞促進定植。例如,牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis,P.gingivalis)產生的小泡有可能誘導自身和與其他細菌聚集[45]。此外,在噬菌體感染的情況下,OMVs的產量會增加,提高自身的適應度和生存率[46],其干擾機制主要是在其遺傳物質插入或復制到細胞之前捕獲噬菌體顆粒,也可通過產生OMVs作為噬菌體的識別位點來進行自身保護。因此,噬菌體很可能與OMVs受體結合,而不是與細菌表面的受體結合。

2.2 毒力因子的分泌

大多數致病菌衍生的OMVs所分泌的生物分子,主要與侵襲、黏附、宿主細胞損傷、免疫調節以及增強毒力相關。牙齦卟啉單胞菌和放線桿菌OMVs可以提高細菌黏附宿主細胞的能力;在大腸桿菌、痢疾桿菌等細菌中,OMVs起著輸送毒素(ClyA和志賀毒素)作用。另外,OMVs內存在的OMP和LPS可激活宿主的非特異性免疫反應,導致炎癥反應過度刺激或感染性休克。通過對感染腦膜炎奈瑟菌患者的血漿進行電子顯微鏡觀察,腦膜炎球菌釋放大量OMVs,導致內毒素水平增高,從而引起致命性敗血癥。此外,沙門菌入侵宿主細胞后衍生含有LPS的OMVs以及其他修飾的表面抗原,從而避免免疫系統的識別。幽門螺旋桿菌OMVs由于缺少起定植作用的黏附因子(血型抗原結合黏附素和唾液酸結合黏附素),無法與宿主細胞相互作用[47]。這對治療幽門螺旋桿菌病提供了新思路,其它細菌OMVs是否缺乏某些黏附因子,還需待進一步研究。

2.3 DNA、RNA的分泌

通過對OMVs中總的DNA分析,被OMVs遠距離輸送的DNA主要來自親本菌株的特定基因、質粒以及噬菌體DNA。例如,大腸桿菌O157:H7菌株OMVs,可以將stx1和stx2等基因水平轉移到大腸桿菌JM109受體菌株中[48-49]。此外,OMVs內部的DNA轉移在抗微生物基因的傳播中也發揮著很重要作用。對碳青霉烯耐藥的鮑曼不動桿菌(Acinetobacterbaumannii,A.baumannii)OMVs攜帶blaOXA-24基因的質粒,該基因編碼負責耐藥的β-內酰胺酶。此外,OMVs可以作為細菌群落間水平基因轉移的載體,當攜帶抗性基因菌株衍生的OMVs存在時,孵育敏感菌株會攜帶該基因的質粒。OMVs的存在使DNA轉移不同于其它已知的方法,遺傳物質不會受到降解破壞,并會直接遠距離傳遞給受體細胞。

此外,從霍亂弧菌OMVs中檢測并分離出RNA分子,它們參與轉錄調節機制[50]。銅綠假單胞菌OMVs中的sRNA是一種新的病原-宿主互作機制,可調節氣管上皮細胞和小鼠肺部的免疫反應。此外,垢密螺旋體(Treponemadenticola,T.denticola)和放線共生放線桿菌可通過OMVs運輸msRNAs,這些msRNAs可能作為細菌信號分子,與牙周病原體和宿主之間的相互作用有關[51]。

2.4 參與細胞通訊和生物膜形成的分子分泌

許多革蘭陰性菌在生長過程中或由于環境應激而自然釋放OMVs,通過整合到生物膜中并提供必要的營養物質來促進生物膜的形成,以增強細菌適應性[52]。生物膜是附著在由胞外多糖、DNA、蛋白質和其他分子組成的基質表面上的微生物群落,這些分子一起形成了一個胞外聚合物基質[53]。細菌生物膜形成和維持的一個關鍵因素是群體感應(quorum sensing,QS)現象,該現象主要由細菌群落間的細胞通訊組成,通過釋放化學信號或自動誘導物,將信號轉導至各細菌內部,從而促進基因表達的變化。筆者認為,OMVs與細菌釋放出的自誘導物化學信號分子結合可介導多種功能,包括毒力因子的產生、宿主免疫反應的調節、對競爭微生物的細胞毒性和鐵的獲取參與,另外QS的大多數自動誘導物是疏水的,同時也存在于OMVs內部,這表明即使在水介質中,OMVs也參與了化學信號的傳播[48],但是目前鮮有關于OMVs與細菌釋放的化學信號如何結合的研究。此外,在幽門螺桿菌中,觀察到生物膜形成的能力與細胞-細胞連接的形成成正比,這也是由OMVs中存在的蛋白質介導的[54]。

3 OMVs在細菌致病中的作用

在致病力方面,有文獻指出致病菌通常比非致病菌釋放更多的OMVs,其原因很可能是致病菌可以調節OMVs分泌以增強其毒力[33]。例如,淋病奈瑟菌(Neisseriagonorrhoeae,N.gonorrhoeae)通過OMVs分泌PorB,被巨噬細胞吸收并將PorB輸送到線粒體,從而誘導細胞凋亡,影響先天免疫[55]。當OMVs介導細菌-宿主的相互作用時,會引起宿主產生非免疫原性反應、促炎性反應以及細胞毒性反應,從而對宿主產生致病力。例如,由致病性大腸桿菌攜帶的大型毒力質粒編碼的HIyF所衍生的OMVs可抑制細胞器自噬通量,促進非典型炎癥小體途徑的激活[56]。從某一方面來看,OMVs本身就是一種重要的細菌毒力因子[45],OMVs由于只可被致病性或非致病性生物體復制,所以不能單獨引起發病[57]。另外,OMVs中富含PAMP以及其具有將毒力因子直接引流到淋巴結的特性,被抗原呈遞細胞吸收后誘導了免疫刺激和炎癥的發生[58]。此外,OMVs還可作為遺傳信息載體和傳遞者來調控致病力[59]。

3.1 細菌-細菌相互作用

細菌本身就是“自私”的,為了自身防御,細菌與細菌之間也會進行競爭。OMVs對于那些具有相同肽聚糖結構的細菌來說,毒性作用非常明顯;OMVs攜帶的酶使細菌也能夠區分自身細胞和非自身細胞,從而實現對非相似細胞的靶向清除[60]。銅綠假單胞菌衍生了含有多種毒力因子(包括蛋白酶、溶血素、磷脂酶C、堿性磷酸酶、抗菌喹諾酮和噬菌體的專一水解酶)的OMVs,通過囊泡融合或附著,來影響其他細菌囊泡蛋白水解酶的遞送,殺死宿主細胞或其他細菌[61]。在黃色黏球菌(Myxococcusxanthus,M.xanthus)中,OMVs可能在裂解目標細胞中發揮作用,其含有蛋白酶、水解酶和具有抗菌活性的次級代謝產物。另外,革蘭陽性細菌衍生的CMVs附著在細胞壁表面并釋放PG水解酶,這些酶消化PG細胞壁并導致其裂解。銅綠假單胞菌OMVs含有PG水解酶,并與大腸桿菌和金黃色葡萄球菌膜融合,從而清除競爭細菌[62]。此外,OMVs在細菌互作過程中可能有助于清除共生菌群,從而使親本細菌能夠在特定的宿主部位定植。然而,還應考慮到,OMVs介導的病原體可直接從外部環境中,通過其他微生物裂解產物,來獲取營養來源和新的遺傳物質,這也是感染宿主炎癥的間接來源[63]。

3.2 細菌-宿主相互作用

致病細菌衍生的OMVs能夠將毒力因子傳遞給宿主細胞,并且所釋放的LPS、PG以及核酸,可以介導炎癥反應[64]。來自特定細菌的OMVs可以破壞黏膜和上皮屏障的完整性,促進活性物質轉移,有利于OMVs通過生物屏障[65]。此外,致病性和共生細菌衍生的OMVs可以通過多種機制進入宿主細胞,使其內容物能夠在宿主中得到定向釋放。另外,共生細菌釋放的OMVs還含有PAMP,其具有能夠調節宿主免疫,維持腸道內穩態并促進與宿主的共生[66-67]。以下將從以下三個方面討論OMVs如何與宿主相互作用。

3.2.1 OMVs與宿主受體的相互作用 細菌感染期間釋放的OMVs會影響免疫系統和感染結果,其結構大小、釋放的含量以及親本菌株的異質性都可能對受體細胞產生影響,導致炎癥和免疫反應或促進病原體進入受體細胞存活[68]。腸道細菌衍生的細胞外小泡(GBEVs)在細菌-細菌和細菌-宿主起著關鍵作用[69]。在腸道微環境中,GBEVs通過減少宿主先天免疫反應來促進腸道病原體定植及增殖,GBEVs可直接進入腸黏液層,被宿主細胞內吞后,與細胞膜受體或細胞內受體結合,如TLR4配體、TLR2配體等,從而調節宿主免疫應答[69]。而炎癥小體的激活依賴于通過Toll樣受體(TLR)信號傳導對傳感器的轉錄誘導。例如,卡他莫拉細菌(Moraxellacatarrhalis,M.catarrhalis)OMVs通過與TLR2的相互作用內化于人上皮細胞。雙歧桿菌(Bifidobacterium)衍生的OMVs可增強樹突狀細胞內部TLR2/1和TLR4細胞的應答。假單胞菌和結核分支桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,M.tuberculosis)等細菌OMVs也可與TLR4相互作用,激活炎癥反應[70]。最近有研究表明,非致病性大腸桿菌OMVs與TLR4結合以誘導IL-1β的表達,這取決于髓樣分化因子(MyD88),因其屬于TLR信號通路中的非常重要的接頭分子[71]。若將MyD88這個介導炎癥的“關鍵橋梁”作為一個新的研究靶點,將能更進一步解析疾病的發生機制。同時,OMVs與TLR4互作時是否需要其他TLR4輔助因子,還有待進一步研究探討。

3.2.2 OMVs輸送途徑 有五種不同的內吞途徑(圖3)可以將OMVs輸送至非吞噬性宿主細胞:大型胞飲作用、網格蛋白介導的內吞、小窩蛋白介導內吞、脂質筏介導的內吞和直接膜融合。

OMVs可以通過網格蛋白介導的內吞作用、脂筏介導的內吞、小窩蛋白的內吞,或通過巨噬細胞吞噬作用進入,這是從環境中吸收物質的更常見途徑OMVs can enter by clathrin-mediated endocytosis, lipid-raft-mediated endocytosis that may or may not be dependent on caveolin, or by macropinocytosis or phagocytosis which are more general pathways for uptake of material from the environment

第一種,通過大型胞飲作用引起的內吞。主要是由細胞膜下方肌動蛋白驅動,導致一個圓形褶皺突起,最終在頂部閉合,從而包圍一部分細胞外空間[73]。它通常在細胞內吞和免疫細胞抗原采樣中發揮作用,但也可被細菌[如沙門菌、產單核細胞李氏桿菌(Listeriamonocytogenes,L.monocytogenes)]或病毒(埃博拉病毒)利用進入細胞[74-75],該機制可在各種途徑中產生最大的內吞囊泡(>1 μm)[76]。

第二種,通過網格蛋白介導的內吞。簡單來說,可分為“銜接蛋白和網格蛋白的貨物招募;包被小凹的內陷、縊縮和液泡的芽殖;包被液泡的脫殼”幾個過程[77]。例如,霍亂毒素以及多種大腸桿菌菌株在內的許多游離的毒力效應物可以進入該途徑。

第三種,小窩蛋白(caveolin,CAV)介導的內吞。主要發生在富含膽固醇,鞘脂和小窩蛋白的物質中,盡管內化速度緩慢(比網格蛋白介導的低5倍),但它可以有效地將物質輸送到胞質溶膠中,這個種類型的內吞主要發生在流感病毒中。通常使用化學抑制劑對CAV所介導的內吞作用來進行檢測,如菲利平或甲基-β環糊精,去除或破壞富含膽固醇的膜結構域,抑制動力蛋白功能以防止囊泡內化,如大腸桿菌、鼠傷寒沙門菌、銅綠假單胞菌以及許多病毒,病原體可能更傾向于這種機制,因為與網格蛋白包被的凹陷不同,通過小窩內化的細菌被認為可以避免輸送到溶酶體以及隨后的降解[78]。例如,當大腸桿菌、沙眼衣原體(Chlamydiatrachomatis,C.trachomatis)通過該途徑進入宿主細胞時,它們能夠逃避檢測并在宿主細胞內持續存在。

第四種,脂質筏介導的內吞。其是富含膽固醇和鞘脂的質膜結構域,高度有序且比周圍的雙層更堅硬,可積累信號分子[79]。主要以富含膽固醇區域聚集引起膜的彎曲,繼而引起的內吞作用。例如,銅綠假單胞菌、牙齦假單胞菌和鮑曼桿菌等均是以此方式實現內吞作用。

第五種,直接膜融合引起內吞作用。OMVs能夠通過與宿主質膜的直接融合進入宿主細胞,如共生放線菌衍生的OMVs在孵育兩分鐘內將脂質追蹤染料賦予宿主細胞質膜[80]。同樣,在肺泡上皮細胞表面可以觀察到用熒光標記示蹤嗜肺軍團菌OMVs,表明它們是長時間黏附或融合的[81]。

3.2.3 OMVs介導炎癥激活和調節免疫反應 OMVs可能是影響病宿主炎癥反應的關鍵因素,細菌在宿主定植后,其衍生的OMVs可能被上皮細胞和巨噬細胞吸收,從而立即觸發宿主先天免疫反應。其在宿主細胞中具有免疫調節和觸發相關信號級聯的能力,這也是OMVs介導細菌-宿主相互作用的一個有力證據[82]。腸炎沙門菌的雙組分系統PhoP-PhoQ協調LPS分子的重塑,并同時上調OMVs的衍生。OMVs以劑量依賴的方式保護細菌,并且在沒有OMVs的情況下,細菌對補體介導的殺傷非常敏感[83]。利用此思路對其他細菌的雙組分系統中某一信號通路進行抑制,降低OMVs的含量,從而介導的炎癥反應,也是很好的研究方向。

LPS被認為是OMVs中最豐富且最有效的免疫刺激成分。例如,脂質A分子形成LPS超分子的兩親性堿基結構,它們是激活免疫系統的強效內毒素,其組分也是微生物相關分子模式和真核生物模式識別受體的免疫配體。而真核生物模式識別受體在與革蘭陰性菌相互作用時控制炎癥、細胞死亡和宿主免疫[84-85]。許多研究表明,TLR4受體復合物是如何感知LPS的,從而觸發大多數革蘭陰性細菌感染常見的促炎反應。高水平的LPS和TLR4激活可導致LPS毒性,并在膿毒性休克中發揮作用。對于研究OMVs刺激宿主產生的免疫反應,應首先確定LPS的作用。OMVs作為LPS遞送載體,具有增強細菌清除或通過激活炎癥反應引起宿主組織損傷的能力。LPS純化后與OMVs結合不僅刺激先天免疫反應的能力不同,而且在宿主組織中分布和清除的能力也可能不同。純化的LPS可能表現出更多的疏水性,更快地與適合的宿主膜結合。因此,OMVs得以深入滯留于吞噬細胞所在的組織,同樣也可能導致OMVs更容易被組織吞噬細胞識別和清除。

另外,OMVs是細菌RNA的理想遞送機制,可以保護其免受細胞外RNA酶的降解,在宿主體內充當遠距離運輸的載體,并將它們遞送到宿主細胞中[72]。在這些RNA中,有些可以發揮與miRNA類似的功能,直接沉默靶宿主基因。放線菌OMVs中攜帶的RNA可通過人巨噬細胞中的TLR-8和NF-κB信號通路激活促炎細胞因子TNF-α[86]。

大多數研究通常只探討OMVs對細菌感染的弊端,其實OMVs對細菌的感染是一把雙刃劍,當細菌激活炎癥小體后,這一途徑似乎會對細菌的感染產生反作用[17]。大腸桿菌OMVs遞送的LPS以鳥苷酸結合蛋白1(GBP1)依賴的方式激活非經典炎性體反應[87]。同樣,銅綠假單胞菌OMVs激活依賴于caspase-11途徑和caspase-5的非典型炎性反應。

4 小結與展望

OMVs作為革蘭陰性菌的一種獨立分泌系統,發揮了多種生物功能,如QS、耐藥基因轉移,毒素和毒力因子的遞送等。通過細菌-細菌和細菌-宿主之間相互作用,導致細菌性疾病更加難以防控,對養殖業每年造成不可估量的經濟損失,對全球的生物公共衛生以及動物性產品留下巨大隱患,從而威脅著人類健康。因此,非常需要開發新的治療藥劑和方法。經過總結,T0SS與傳統分泌系統相比,有很多優勢:OMVs可以保護易降解的生物分子;轉移一種以上能夠發揮協同或互補作用的酶,將其遞送到靶細胞上,即使其遠離定植位點。此外,這種分泌系統可以向其他細菌輸出定向毒素[11]。課題組前期研究發現野生型鼠傷寒沙門菌株外膜囊泡感染小鼠,可導致小鼠產生炎癥反應及全身敗血癥并且最終發生死亡;利用基因工程鼠傷寒沙門菌株衍生的外膜囊泡免疫小鼠和雛雞,可刺激動物機體產生良好的體液免疫應答反應[88]。所以,OMVs是一把雙刃劍。除了增強細菌對宿主的致病力外,研究學者可通過利用其免疫原性、主動靶向性等特點研發相應的疫苗、佐劑等進行疾病的防治。目前,首例基于OMVs的腦膜炎奈瑟菌疫苗已被批準用于臨床。利用重組DNA技術,以OMVs作為抗原或治療分子的載體,構建和生產含有異源蛋白或配體的OMVs使用基因工程細菌。相信隨著科學技術的發展,對于OMVs的研究層次將越來越深。

此外,雖然對OMVs的結構功能、分泌特性、致病機制以及應用方面的研究取得了很大進展,但尚有許多問題需要努力去探索和闡明。例如,該領域進展的障礙之一是缺乏分離和純化OMVs的標準化方法,以及缺乏對細菌OMVs上存在的個體標志物的明確鑒定,因為受生長條件的影響,OMVs的組成和大小可能會發生劇烈變化;需要可靠的方法來追溯OMVs的起源母細胞,追溯到其母源細胞是很重要的,因為體內OMVs不是來自同種細胞群,而是由許多不同類型的細胞釋放的。還需要去明確很多問題,起于源頭,為什么細菌會產生囊泡,產生囊泡的好處是否大于成本?哪些胞膜因子導致外膜裂變和OMVs釋放?什么信號和途徑調節OMVs的生物發生?如何實現LPS依賴于可溶性內容物的富集和排除?哪些過程在不同的革蘭陰性菌中是保守的?OMVs貨物的包裝選擇機制是什么?未來有望對這些基本問題的解決,提高對OMVs更為復雜和多方面實體的獨特能力的認識,更好地解決嚴重的細菌性疾病。