NOS2基因DNA甲基化編輯調節NO濃度影響肌肉發育通路基因的表達

申 琦,王 凱,趙真堅,陳 棟,余 楊,崔晟頔,王俊戈,陳子旸,吳平先,唐國慶*

(1.四川農業大學動物科技學院 農業農村部畜禽生物組學重點實驗室,成都 611130;2.四川農業大學 畜禽遺傳資源發掘與創新利用四川省重點實驗室,成都 611130;3.四川農業大學動物科技學院 豬禽種業全國重點實驗室,成都 611130;4.新希望六和股份有限公司,北京 100102;5.國家生豬技術創新中心,重慶 402460)

DNA甲基化由DNA甲基轉移酶(Dnmts)家族催化,這些甲基轉移酶將甲基從S-腺苷甲硫氨酸(SAM)轉移到胞嘧啶殘基的第五個碳上,形成5 mC[1]。DNA甲基化是一種被廣泛研究的表觀遺傳修飾方式,與組蛋白修飾等方式一起,在沉默逆轉錄病毒元件[2],調節組織特異性基因表達,基因組印跡和X染色體失活等過程中至關重要[3]。曾有研究表明,DNA甲基化會影響骨骼肌從而影響運動[4],肥胖和糖尿病也與表觀遺傳學緊密相關[5-8]。DNA甲基化在哺乳動物發育中起著至關重要的作用,哺乳動物基因組通常高度甲基化,在人類胚胎干細胞中,DNA甲基化會在約80%的CpG中發生,其余未甲基化的CpG殘基富集在位于基因啟動子的CpG島(CGI)中[9]。近些年來,表觀遺傳學和甲基化測序技術的發展為畜禽重要經濟性狀研究提供基礎[10-12]。

一氧化氮(NO)由NOS亞型產生,這些亞型包含NOS1、NOS2和NOS3[13]。有研究表明,NOS2可治療肌肉萎縮綜合征,iNOS將L-精氨酸轉化為瓜氨酸,在此過程中釋放NO[14-16]。NOS也在血管疾病、卵巢功能[17]和糖尿病[18-19]中具有重要調控作用[20]。NO 是一種信使分子,在調節組織、細胞和器官的各種生物過程中發揮著至關重要的作用[21-23]。NO 能與 OxyMb 反應生成 MetMb 和硝酸鹽[24],肌紅蛋白存在DeoMb、OxyMb和MetMb三種狀態。肌肉中三種狀態肌紅蛋白相對含量決定了肉的色澤[25]。此外,有研究表明,NO 可抑制線粒體呼吸鏈[26],而線粒體是骨骼肌MyHC纖維類型的調節因子[27]。因此,本研究發現NOS2 基因可能會通過調節細胞內 NO 的濃度來影響肌紅蛋白和肌纖維組成,從而影響肌肉發育通路基因的表達。

1 材料與方法

1.1 細胞和載體

本試驗中使用的細胞株為豬腎細胞系PK-15細胞,使用的是MEM培養基,添加1%NEAA、1%丙酮酸鈉和10%胎牛血清(FBS),將細胞置于37 ℃,5% CO2培養箱培養;根據Addgene #71666設計質粒載體pdCas9-DNMT3A-EGFP(E4692),融合蛋白pCLenti-U6-gRNA1(NOS2)-gRNA2(NOS2)-CMV-mCherry(Y14117)由和元生物構建,其中2個gRNA位于NOS2啟動子上游(表1),通過T4 DNA連接酶合成,并克隆到表達載體。

表1 所有gRNA目標位點及序列

1.2 細胞轉染

將PK-15細胞進行消化后,計數后將每組細胞配成1.0×105個·mL-1后,每孔鋪500 μL細胞,于37 ℃,5% CO2培養箱中培養過夜;12～20 h后,觀察細胞的融合率達到60%～70%左右進行轉染;配制質粒和轉染試劑稀釋液,0.5 μg E4692+0.5 μg Y14117+2 μL lipo2000進行轉染。各組轉染試劑混勻,常溫孵育5 min;將稀釋好的質粒和轉染試劑混合均勻,以常溫孵育20 min;在轉染前加入400 μL optiMEM 至24孔板中,然后再添加質粒和轉染試劑轉染混合物,約4～6 h后換成完全培養基;轉染48 h后,熒光顯微鏡拍照;轉染結束后,倍比稀釋法挑選3組單克隆細胞。

1.3 甲基化檢測

使用BSP(bisulfite sequencing PCR)方法對NOS2啟動子區域前500 bp范圍DNA甲基化水平進行檢測,目標區域序列見圖1。使用細胞DNA提取試劑盒并嚴格遵照說明書操作步驟對細胞樣本進行DNA提取,提取后的DNA保存備用;用亞硫酸氫鹽對提取的DNA進行預處理,處理過后所有尚未發生甲基化的胞嘧啶被轉化為尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶則不變;設計引物進行PCR擴增(表2);目的產物純化后進行TA克隆;在使用酶切法鑒別陽性菌落后,挑取質粒進行測序;將測序得到的序列與原始序列進行比對,并計算發生甲基化位點的數量及甲基化程度。

圖1 DNA甲基化編輯的目標區域序列Fig.1 Sequences of regions targeted for DNA methylation editing

表2 甲基化檢測的引物信息

1.4 細胞增殖測定

使用CCK-8方法對細胞的增殖能力進行定量分析,具體步驟如下:細胞經過消化作用、重懸和計數后,鋪于96孔板上,細胞貼壁后,根據分組進行對應處理,在每個檢測時間點(0、24、48和72 h),棄上清,加入CCK-8:MEM完全培養基=1∶9混合液100 μL于每孔中,經過2 h后,用酶標儀檢測450 nm OD值。

1.5 細胞RNA提取

從培養皿中倒掉培養液,然后離心,棄去細胞上清,每孔加入1 mL Trizol,然后每孔加200 μL氯仿,劇烈震蕩15 s,然后于室溫靜置15 min;在4 ℃條件下,12 000 r·min-1離心15 min;從每管中吸取上清至新1.5 mL 離心管中,在其中添加同樣體積的異丙醇,混合均勻后在4 ℃沉淀10 min;4 ℃,12 000 r·min-1離心10 min后,棄掉上清液;4 ℃預冷的75%乙醇洗滌兩遍后棄去廢液,然后在室溫干燥;先添加30～40 μL RNase-free水,等待充分溶解后,用分光光度儀測定RNA的濃度與吸光值,檢測合格后于-80 ℃冰箱貯存備用。

1.6 總RNA反轉錄

使用反轉錄試劑盒(TaKaRa)進行總RNA反轉錄,主要步驟:1)遵照說明書進行gDNA Eraser反應混合液及RNA轉錄反應混合液的配置;2)將RNA反轉錄混合液先于42 ℃水浴中放置15 min,再于85 ℃水浴中放置5 s后立即置于冰上,獲得反轉錄產物(cDNA);3)反轉錄產物(cDNA)可立即用于qPCR檢測,或存于-80 ℃備用。

1.7 實時熒光定量PCR

引物使用Primer 5.0設計,交由和元生物合成,具體引物序列如表3所示。處理組中基因的表達量表示為相對表達量(2-△△Ct),其中△△Ct=△Ct1(處理組)-△Ct2(對照組),即:當2-△△Ct<1且P<0.05時,說明處理組中基因表達量顯著下調,而當2-△△Ct>1且P<0.05時,說明基因表達量顯著上調。

表3 實時熒光定量PCR引物序列

1.8 Western blot

細胞總蛋白抽提后測定蛋白濃度,然后進行SDS-PAGE凝膠電泳。在電泳完成前,預先準備一張PVDF膜和六張濾紙。將PVDF膜用甲醇活化5 min,再在緩沖液中平衡 15 min,隨后將轉膜用的夾子打開,將海綿、濾紙和膜組合形成海綿-濾紙-膠-膜-濾紙-海綿的結構,然后放在轉移槽中,在槽的一邊放置冰塊降溫,在300 mA轉移2 h。使用1×TBST制成5%脫脂牛奶封閉液,將膜移至封閉液中封閉1 h,接著遵照說明書配置一抗稀釋液,從封閉液中取出膜,在一抗中孵育過夜,在室溫下用TBST脫色搖床上洗10 min,反復3次,然后配置二抗稀釋液,將膜在二抗稀釋液中室溫孵育1～2 h后,于室溫下在TBST脫色搖床上洗10 min,重復3次,用發光液浸濕PVDF膜,然后放入成像儀中拍照成像。

1.9 細胞內NO的檢測

利用一氧化氮(NO)試劑盒檢測細胞中NO的含量,并嚴格遵照產品使用說明書執行,在細胞沉淀中添加500 μL PBS,混合均勻,使細胞懸浮于等滲緩沖液中;在冰水浴條件下,通過超聲波破碎儀對細胞懸液進行超聲破碎,重復5次,取破碎好的勻漿液進行下一步測定;根據說明書配置混合試劑(試劑一和試劑二等體積混合),混合均勻后備用;標準貯存液用雙蒸水1∶100稀釋成100 μmol·L-1的標準液, 提前計算好量后配好待用;每孔加入100 μL 的待測樣本(3重復孔)、空白對照,標準液(空白用蒸餾水,標準液為試劑一,各2個重復孔);每孔加入400 μL的混合試劑,混勻后,至37 ℃水浴準確反應1 h;每個測試管分別加入200 μL的試劑三和100 μL的試劑四;充分漩渦混勻30 s,室溫靜置40 min后,在3 000～4 000 r·min-1條件下離心10 min,取上清顯色;根據說明書溶解試劑五和試劑六,按照試劑五:試劑六:試劑七=2.5∶1∶1的比例配制顯色劑,每個測試管要加入600 μL顯色劑,提前計算好量后配好待用;每管分別加入500 μL上清和600 μL顯色劑,混合均勻后,在室溫下靜置10 min,并在550 nm的波長下,測定吸光度;根據公式計算NO含量:NO(μmol·L-1)= C標準×(A測定-A空白)/(A標準-A空白)。

1.10 統計分析

使用R v4.1.1軟件對本試驗的結果進行統計分析,每個試驗3次重復,結果表示為“平均數±標準差(Mean±SD)”,設置檢驗標準為P=0.05。

2 結 果

2.1 細胞轉染結果

在本試驗中,通過lipo2000將載體轉染到PK-15細胞中。使用0.5 μg 的pdCas9-DNMT3A-EGFP 和0.5 μg的pCLenti-U6-gRNA1(NOS2)-gRNA2(NOS2)-CMV-mCherry 以及2 μL的lipo2000 進行轉染。轉染結果如圖2所示(圖為100×放大結果)。

A.轉染前和轉染48 h白光組結果比較;B.轉染前和轉染48 h熒光染色結果比較A. Comparison of white light before transfection and 48 h after transfection;B. Comparison of fluorescence staining results before transfection and 48 h after transfection

轉染48 h后,利用倍比稀釋法挑選3組單克隆細胞(即處理組)進行后續試驗,3組單克隆細胞結果如圖3所示(圖為100×放大結果)。

圖3 轉染后挑選3組單克隆細胞結果(100×)Fig.3 The results of monoclonal cells in 3 groups after transfection (100×)

挑選的3組單克隆細胞檢測NOS2基因啟動子前500 bp范圍的DNA甲基化水平,結果發現,處理組的NOS2基因啟動子DNA甲基化水平比對照組降低,但差異不顯著(P>0.05),如圖4所示。gRNA1結合位點附近有2個CpG位點,在gRNA2結合位點附近有2個CpG位點。然后比較對照組和處理組中gRNA結合位點附近CpG位點的甲基化水平,結果發現,對照組的gRNA1結合位點的1個CpG位點平均甲基化為0.8,gRNA2結合位點的2個CpG位點平均甲基化為0.2,編輯過后的處理組中gRNA1結合位點的1個CpG位點平均甲基化為0.8,gRNA2結合位點的2個CpG位點平均甲基化為0.32。與對照組相比,gRNA2結合位點附近的CpG位點甲基化水平增加。

A.對照組和處理組NOS2啟動子甲基化檢測結果;B.對照組和處理組NOS2啟動子平均甲基化水平A. Results of the DNA methylation of NOS2 promoter in control group and treatment groups; B. Average methylation level of NOS2 promoter in control group and treatment groups

(續圖4 Continued)

2.2 細胞增殖檢測結果

在不同時間點對細胞增殖檢測后,結果發現:在0 h時,對照組的細胞增殖與處理組之間無明顯差異(P>0.05);在24 h時,與對照組相比,處理組的細胞增殖倍數顯著降低(P<0.05);在48 h時,與對照組相比,對照組的細胞增殖與處理組之間無明顯差異(P>0.05);在72 h時,與對照組相比,對照組的細胞增殖與處理組之間無明顯差異(P>0.05),結果如圖5所示。

圖5 NOS2甲基化編輯后不同時間點對照組和處理組的細胞中細胞增殖倍數的柱狀圖Fig.5 Histograms of cell proliferation in control group and treatment groups at different times after NOS2 methylation editing

2.3 相關基因的表達檢測結果

在PK-15細胞中對NOS2進行甲基化編輯后,檢測NOS2基因表達和iNOS蛋白表達結果發現,與對照組相比,處理組的NOS2基因相對表達量和iNOS蛋白質相對表達量均顯著下降(P<0.05),如圖6A和6B所示。

A.對照組和處理組細胞中NOS2基因表達水平;B. 對照組和處理組細胞中iNOS蛋白表達水平;C.對照組和處理組細胞中相關基因表達水平柱狀圖;D.對照組和處理組細胞中相關蛋白表達水平A. The histogram of NOS2 gene expression levels in control group and treatment groups; B. iNOS protein expression levels in control group and treatment groups;C. The histogram of related gene expression levels in control group and treatment groups; D. Related protein expression levels in control group and treatment groups

利用qPCR檢測NOS2的同源基因以及幾個與肌纖維相關基因的表達量發現:與對照組相比,NOS1基因的表達差異不顯著,NOS3基因的表達量顯著上調(P<0.05);MYHC-Ⅰ和MYHC-Ⅱa表達量上調,但差異不顯著(P>0.05),MYHC-Ⅱb和MYHC-Ⅱx基因的表達量顯著下調(P<0.05),Myoglobin表達量下降,但差異不顯著(P>0.05),如圖6C所示。

利用WB檢測NOS2的同源基因以及兩個與肌纖維相關基因編碼蛋白的相對表達量發現:與對照組相比,nNOS蛋白和eNOS蛋白相對表達量明顯上升,MYH6的蛋白相對表達量也明顯上升,而Myoglobin蛋白相對表達量明顯下降。該結果表明,隨著NOS2表達下降,肌纖維和肌紅蛋白相關基因及相應蛋白的表達也發生變化,如圖6D所示。

2.4 細胞中NO濃度檢測結果

通過測定對照組和處理組的細胞NO含量來檢測NOS2甲基化編輯對NO濃度的影響。結果顯示,對照組中NO濃度平均值為8.66 μmol·L-1, 處理組的NO濃度平均值為1.88 μmol·L-1,與對照組相比,處理組的NO含量顯著降低(P<0.05),如圖7所示。

圖7 對照組和處理組細胞中NO含量的小提琴圖Fig.7 The violin plot of NO concentration in control group and treatment groups

3 討 論

3.1 NOS2基因啟動子甲基化對其表達的影響

NOS2基因屬于一氧化氮合酶家族,一氧化氮合酶催化L-精氨酸產生NO和L-瓜氨酸[28],一氧化氮合酶家族有3種亞型,包括神經元一氧化氮合酶(nNOS)與誘導性一氧化氮合酶(iNOS)和內皮一氧化氮合酶(eNOS)[29],分別由NOS1、NOS2和NOS3編碼。本研究通過對NOS2基因進行甲基化編輯,結果發現NOS2基因啟動子前500 bp區域平均DNA甲基化水平降低,但差異不顯著,而gRNA2結合位點附近的CpG位點甲基化水平增加。此外,NOS2基因表達量和其iNOS蛋白質表達量顯著降低。通常位于啟動子區域的DNA甲基化會抑制基因的表達,而在本研究中NOS2基因啟動子前500 bp區域平均DNA甲基化水平降低但NOS2基因表達量下降,可能的原因是NOS2基因的表達活性可能受其啟動子區域某個或某些關鍵CpG位點的甲基化水平影響,在一項NOS2甲基化與帕金森綜合征的研究中,作者評估了NOS2基因3個CpG位點,其中一個CpG位點與帕金森綜合征顯著相關[30]。盡管本研究檢測了NOS2基因啟動子區域前500 bp的甲基化狀態,但gRNA2結合位點附近的CpG位點甲基化水平增加。因此,NOS2基因表達量降低可能是由一個或幾個關鍵CpG位點的甲基化引起的。

3.2 NOS2基因對肉品質的作用

Hattori等[31]研究表明,在脂多糖和細胞因子刺激的血管平滑肌細胞中,PI3K-Akt通路可以通過NF-kappa B(核因子kappa B)調控iNOS的表達。Silva和Garvin[32]在小鼠上的研究發現,ATP通過刺激PI3激酶和Akt來增強一氧化氮酶的活性,進而增加NO的產生。NO是一種信使分子,在許多組織、細胞和器官中的核心生物過程中為關鍵的調節分子[33]。Reisberg等[34]驗證了NO與綿羊血紅蛋白結合的動力學和平衡,并證實NO結合得更快,親和力比CO高1 500倍。有研究表明,肌紅蛋白也可以通過氧化、配體結合以及形成生物活性S-亞硝基肌紅蛋白的方式調節NO平衡[35]。因此,NOS2基因可能通過影響細胞內NO的濃度進而影響肌紅蛋白的形成[36]。本研究發現,隨著NOS2表達量的降低,細胞內NO含量顯著降低,這個結果表明了NOS2在內源性NO合成的作用,這也與前人研究結果一致。

對于肉品質的形成,肌纖維和肌紅蛋白都起著至關重要的作用。肌纖維是肌肉組織的基本結構單位,肌纖維數目和直徑決定了肌肉產量。肌纖維依據代謝特征和收縮特性可以分為4種類型,分別為Ⅰ型(慢速氧化型)、Ⅱa型(快速氧化型)、Ⅱb型(快速酵解型)和Ⅱx型(中間型),而在分子生物學中,根據肌球蛋白重鏈(myosin heavy chain,MYHC)亞型的不同,豬骨骼肌中含有MYHCⅠ、MYHCⅡa、MYHCⅡb和MYHCⅡx四種異構體,對應不同的編碼基因,特異性的存在于Ⅰ型、Ⅱa型、Ⅱb型和Ⅱx型肌纖維中[37]。不同肌纖維類型組成與豬肉品質密切相關,是影響肉質性狀表現的關鍵因素[38]。豬肌肉色素主要由肌紅蛋白、血紅蛋白以及微量有色代謝物組成。在放血充分的情況下,對肉色起主要作用的是肌紅蛋白。本研究結果顯示,隨著NOS2表達降低,MYHC-Ⅰ的表達水平增加,MYHC-Ⅱa表達水平下降,MYHC-Ⅱb和MYHC-Ⅱx的表達水平顯著下降,而Myoglobin基因表達量下降。這表明NOS2表達可能通過影響肌纖維相關基因和肌紅蛋白的表達從而影響豬肉色。

此外,本研究還注意到NOS2同家族的另外兩個基因NOS1和NOS3表達量的變化,結果顯示隨著NOS2表達降低,PK-15細胞中nNOS和eNOS蛋白均顯著上調,二者均屬于鈣離子依賴型NOS。相比于iNOS,nNOS和eNOS對NO的合成高度依賴于足夠的底物和輔因子的參與,而且nNOS和eNOS的調控更加復雜,涉及許多翻譯后調控,包括位點磷酸化[24]、蛋白質互作[39]以及亞細胞定位的調節[40]。因此,NOS表達的變化不總是和實際細胞NO合成水平一致。例如,在一項高鹽和低鹽飲食對NO合成影響的研究中,Welch和Wilcox[41]發現在腎遠直小管末端的致密斑中NO合成與nNOS的表達呈負相關。因此,NOS2表達對NOS1和NOS3表達的影響以及三者的相互調控還需進一步研究。

4 結 論

通過在PK-15細胞上對NOS2基因進行甲基化編輯,發現NOS2基因的異常表達能夠影響細胞中的NO的生成,同時影響MYHC-Ⅰ、MYHC-Ⅱa、MYHC-Ⅱb、MYHC-Ⅱx以及Myoglobin的表達,初步闡述了NOS2基因對豬肌肉發育相關基因表達的影響機制。