導入25%洛島紅雞血緣對河南斗雞相關指標的影響

蘇傳琛,焦靜婭,王永帥,羅朋娜,昌興海,黃艷群*

(1.河南農業大學動物科技學院,鄭州 450046;2.河南省長興農牧有限公司,開封 475131)

河南斗雞是我國珍貴的家禽品種資源,具有較高的食用和觀賞價值[1-2]。河南斗雞的原產地及中心產區為開封市,另外也有一些分布在洛陽、周口和鄭州等地。2009年河南斗雞被列入河南省畜禽遺傳資源保護名錄[3]。近年來圍繞河南斗雞種質資源,學者從河南斗雞的組織結構特征[4]、血液生化指標[5]、行為學[6]、染色體組型[7]、蛋品質[8]、肉用性能與肉質特性[9]、遺傳進化[10]等多方面開展了研究。國內由于長期將河南斗雞定義為觀賞品種且長期散養在民間,因此對其雜交配套利用研究較少。

相較其它品種,斗雞肌肉更強健、發達,Ren等[11]通過基因組結合轉錄組分析揭示了潛在影響斗雞肌肉發育的基因。Sun等[12]通過全基因組分析顯示這可能與ISPD基因外顯子2的Arg84Lys 錯義突變有關。Guo等[13]進一步的研究表明ISPD基因中Arg84Lys錯義突變可促進雞肌肉的良好發育,維持肌纖維穩定性。徐廷生等[14-15]的初步研究表明,將河南斗雞和艾維茵二者做雜交,其雜交一代雞肌肉豐滿、肉質鮮美。

實際上,全球范圍內已有一些成功利用斗雞進行肉雞改良的案例,如科尼什(cornish)是現代的一個肉用型品種,但事實上該雞種是通過用印度的一個品種(Red Aseels)與英國的黑胸斗雞雜交培育而成的[16]。日本也在斗雞資源的開發利用上做了不少研究,Iwamoto等[17]對日本本地斗雞與白洛克雞雜交后代的研究表明,雜交斗雞肌肉特性呈現了較顯著的性別差異,并且在日本用其本地斗雞與洛島紅雞培育的雜交斗雞已被作為一種品牌雞肉成功地進行商業化的推廣與應用[18]。

洛島紅雞育成于美國洛德島州,由紅色馬來斗雞、褐色來航雞和九斤黃雞雜交而成,體型中等,屬兼用型優質雞種,肉質鮮美并且抗病能力強,常被用作現代高產蛋雞的父系[19]。迄今為止,尚未見河南斗雞與洛島紅雞雜交的研究報道。

本試驗以河南斗雞及洛島紅雞(父本)與河南斗雞(母本)的回交后代為素材,研究導入25%洛島紅雞血緣對河南斗雞屠體指標、肌肉特性、血清生化指標及肌纖維發育和葡萄糖轉運相關基因表達的影響,為河南斗雞的新品系選育和配套利用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與設計

從河南省開封斗雞保種場選取同一批次飼養的120日齡純種河南斗雞及其雜交雞各10羽,公母各半,共分為4組,每組5個重復,每個重復1只雞。雜交斗雞為純種河南斗雞導入了25%的洛島紅雞血緣的后代,其雜交配套模式如圖1所示。

圖1 雜交模式圖Fig.1 Hybridization pattern diagram

試驗雞飼養于半開放式雞舍、立體籠養,飼養期間雞只的溫度、光照模式參照蛋雞進行管理,濕度控制在50%～55%,自由采食、飲水,日糧參照中國《NY/T 33—2004-雞飼養標準》中的蛋用雞飼料營養標準配制。試驗雞均嚴格執行基礎免疫程序。

1.2 樣品采集

對選取的試驗雞禁食12 h后采取頸動脈放血法進行屠宰,并測定相關屠體指標。采集血液,待血液凝固后放入高速冷凍離心機(德國,5424R),2 000 r·min-1離心15 min,分離血清,并保存在-20 ℃待測。采集左側部分胸肌與腿肌放入10%甲醛溶液固定以用于制作常規石蠟切片,剩余部分經液氮冷凍后轉到-80 ℃保存以用于后續RNA的提取;取右側全部胸肌與腿肌樣品,保存在4 ℃下用于后續肉品質測定。

1.3 指標測定

1.3.1 屠宰指標的測定 試驗雞屠宰指標的測定參照《NY/T 823—2020家禽生產性能名詞術語和度量統計方法》[20]。測定指標包括宰前活重、屠體重、全凈膛重、器官重、胸肌重和腿肌重,并計算屠宰率、全凈膛率、器官指數、胸肌率和腿肌率。

1.3.2 肌肉品質測定 各選取3個不同位點測定胸肌、腿肌pH;取胸肌和腿肌樣品,沿肌纖維方向修飾成長條形(1.5 cm×2.0 cm×3.5 cm)進行失水率、剪切力的測定。失水率的測定及計算參照Zhang等[21]方法;剪切力的測定參照國家農業部行業標準《NY/T 1180—2006肉嫩度的測定 剪切力測定法》[22]。

1.3.3 肌肉組織學特性 胸/腿肌采用常規方法制備石蠟切片(厚度約為2 μm),進行蘇木精-伊紅(H.E.)染色,將石蠟切片倒置于10×10全自動生物顯微鏡(Motic, BA600-4)進行掃描,使用Image-pro Plus(IPP)軟件進行圖像分析。每張切片讀取5個視野,每個視野選定20根肌纖維,取每根肌纖維長軸和短軸的平均值作為肌纖維直徑;每張切片另取5個視野,每個視野選定5個面積的肌纖維數量,從而計算肌纖維密度。

1.3.4 血清生化指標 通過全自動生化分析儀(HITA-CHI Automatic Aralyzer 7600,日本)檢測血清白蛋白(ALB)、球蛋白(GLO)、白蛋白與球蛋白比值(A/G)、膽固醇(CHO)、甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白(LDL-C)的含量。

1.3.5 樣品總RNA提取及cDNA合成 按照TRIZOL試劑說明書(南京諾唯贊)提取各組胸肌和腿肌的總RNA,采用超微量分光光度儀(美國 NanoDrop公司)檢測總RNA,OD260 nm/OD280 nm比值介于1.8～2.0之間為合格。以 RNA為模板,參照反轉錄試劑盒說明書(HiScript Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis Kit+gDNA wiper,南京諾唯贊)進行反轉錄,反應步驟分為兩步:第一步(除去基因組DNA)反應體系:RNase-free ddH2O 16 μL,4 × gDNA wiper Mix 4 μL,RNA 1 μg,在Eppendorf 5331PCR 儀(德國 Eppendorf 公司)中進行42 ℃ 2 min的反應;第二步:第一步反應液 16 μL,5 × HiScript III qRT SuperMix 4 μL,在Eppendorf 5331PCR 儀中進行37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s的反應,獲得樣品的cDNA保存在-20 ℃備用。

1.4 實時熒光定量PCR

利用Primer5.0設計引物,引物信息見表1,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以樣品cDNA為模板,采用實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR, qRT-PCR)(美國 Bio-Rad 公司)檢測目的基因的表達量。qRT-PCR采用SYBR Green染料法,反應體系為20 μL:2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL,上、下游引物各0.4 μL,cDNA模板2 μL,RNase-free ddH2O 7.2 μL,在熒光定量PCR儀器上進行擴增。qRT-PCR反應程序:95 ℃ 30 s; 95 ℃ 5 s, 60 ℃ 30 s,共39個循環。以β-actin為內參,每個體系均設置3個技術重復和4個生物學重復。數據采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量[23]。

表1 熒光定量PCR引物

1.5 數據統計與分析

數據經Excel 2016初步處理后,采用SPSS 23.0生物統計軟件進行雙因素方差分析,并用Duncan多重比較進行顯著性檢驗,分別進行同性別不同群體或同群體不同性別的比較分析。結果以“平均值±標準誤 (Mean±SEM)”表示。以P<0.05差異顯著,P<0.01差異極顯著為判斷標準。

2 結 果

2.1 雜交斗雞的配套模式

2.2 雜交斗雞和河南斗雞屠體指標的比較

研究表明(圖2),120日齡時純種河南斗雞的體重顯著高于雜交斗雞(P=0.005),且兩個群體公雞的體重均顯著高于母雞(P=0.001)。但兩個群體在全凈膛率、屠宰率、胸肌率、腿肌率、心臟指數和肝臟指數上均無顯著差異(P>0.05,表2)。

不同字母表示差異顯著 (P<0.05);無字母或含相同字母表示差異不顯著 (P>0.05)。CG.河南斗雞公雞;CM.河南斗雞母雞;ZG.雜交斗雞公雞;ZM.雜交斗雞母雞。n=5。下圖同Different letters indicate significant difference (P<0.05); No letter or the same letter indicates no significant difference (P>0.05). CG. Henan fighting rooster; CM. Henan fighting hen; ZG. Crossbred fighting rooster; ZM. Crossbred fighting hens. n=5. Behind figures follow the same rules

表2 雜交斗雞和河南斗雞的屠體相關指標比較

2.3 雜交雞和河南斗雞的肌肉特性相關指標

數據分析表明,在胸肌組織中(表3),肌纖維直徑呈現了顯著的群體效應和性別效應,以母雞的肌纖維直徑顯著高于公雞(P=0.013),純種斗雞的肌纖維直徑顯著高于雜交斗雞(P=0.014)。胸肌肌纖維密度指標的性別效應顯著(P=0.000),而其群體與性別間的互作效應不顯著(P=0.056)。公雞的胸肌肌纖維密度極顯著高于母雞(P=0.000)。雜交公雞的胸肌肌纖維密度極顯著高于純種公雞(P<0.01)。而失水率、剪切力及pH幾個指標在品種間及性別間均無顯著差異(P>0.05)。

表3 雜交斗雞和純種河南斗雞胸肌肌肉特性相關指標的比較

對腿肌的肌肉特性(表4)相關數據分析表明,剪切力指標的性別效應顯著(P=0.02),特別是純種公雞的剪切力顯著高于純種母雞(P<0.05)。腿肌的肌纖維密度呈現了顯著的群體效應(P=0.002),以雜交母雞的肌纖維密度顯著高于純種母雞(P<0.05),雜交公雞的肌纖維密度極顯著地高于純種公雞(P<0.01)。此外雜交公雞的腿肌肌纖維密度還顯著高于雜交母雞(P<0.05)。

2.4 實時熒光定量PCR結果

熒光定量結果顯示(圖3),胸肌組織Myosin heavy chain (MyHC)基因的表達(圖3A)呈現了顯著的性別效應(公雞>母雞,P=0.002),雜交公雞MyHC基因的表達也略高于純種公雞(P=0.057)。Myogenin(MyoG)(圖3B)、Myogenic differentiation 1(MyoD1)基因(圖3C)和Glucose Transporter 12 gene(GLUT12)基因(圖3E)的表達在兩個群體和性別間均無顯著差異(P>0.05)。而胸肌Glucose Transporter 4(GLUT4)基因的表達(圖3D)呈現了顯著的互作效應(P=0.000)。在同群體不同性別間(圖3D),胸肌GLUT4的表達水平在純種河南斗雞中以母雞顯著高于公雞(P<0.01),而其表達在雜交斗雞中則以公雞顯著高于母雞 (P<0.01)。在同性別不同群體中(圖3D),胸肌GLUT4基因的水平在公雞中以雜交公雞顯著高于純種公雞(P<0.01),而在母雞中則以純種母雞顯著高于雜交母雞(P<0.05)。MyHC基因在腿肌(圖4A)中的表達也呈現了顯著的性別效應(公雞>母雞,P=0.023),純種公雞和雜交母雞MyHC基因的表達量極顯著高于純種母雞(P<0.01)。而MyoG基因(圖4B)、MyoD1基因(圖4C)和GLUT12基因(圖4E)在腿肌中無顯著的表達差異(P>0.05)。腿肌GLUT4(圖4D)的表達也如在胸肌中一樣,呈現了顯著的群體和性別間的交互效應(P=0.006),其中雜交母雞腿肌GLUT4的表達極顯著地高于雜交公雞與純種母雞(P<0.01),而純種公雞腿肌GLUT4的表達卻略高于純種母雞和雜交公雞(P>0.05)。

圖3 目的基因在雜交斗雞和純種河南斗雞胸肌組織的表達量Fig.3 The expression level of target genes in pectoral muscles of hybrid chickens and Henan fighting chickens

圖4 目的基因在在雜交斗雞和純種河南斗雞腿肌組織的表達量Fig.4 The expression level of target genes in leg muscles of hybrid chickens and Henan fighting chickens

2.5 雜交雞和河南斗雞的血清生化指標

進行雜交斗雞和純種河南斗雞血清指標的分析發現(圖5),ALB在各組間差異不顯著(P>0.05,圖5A)。血清GLO水平呈現極顯著的群體間效應(雜交斗雞>河南斗雞,P=0.004), 特別是雜交公雞的血清GLO水平極顯著高于純種公雞(P<0.01,圖5B)。而血清A/G比值呈現了顯著的互作效應(P=0.013),其中純種公雞的血清A/G比值顯著高于雜交公雞(P<0.05,圖5C)。血清CHO水平(圖5D)呈現顯著的群體效應(雜交斗雞>河南斗雞,P=0.011)和性別效應(公雞>母雞,P=0.012),特別是雜交公雞的血清CHO水平極顯著高于雜交母雞和純種公雞(P<0.01)。血清TG水平也呈現了極顯著的性別效應(公雞>母雞,P=0.002,圖5E),純種公雞的血清TG水平顯著高于純種母雞(P<0.05),雜交公雞顯著高于雜交母雞(P<0.05)。血清LDL-C顯示了顯著的群體效應(雜交斗雞>河南斗雞,P=0.014,圖5F),特別是雜交公雞血清LDL-C顯著地高于純種公雞(P<0.05)。

圖5 雜交雞和河南斗雞血清生化指標比較Fig.5 Comparisons of serum biochemistry indexes between hybrid chickens and Henan fighting chickenss

3 討 論

河南斗雞作為珍貴的地方特色品種,為了防止其流失,養殖者極少直接將河南斗雞作為食用資源,這極大地限制了該資源的利用。通過雜交配套拓展其利用途徑十分必要。通過地方雞種和高產的洛島紅雞雜交不僅可以提高后代雞只的產蛋性能/繁殖性能;也是培育小型優質肉雞的有效模式,是實現后代雞只多用途的有效配套方式。

3.1 雜交雞和河南斗雞屠體指標

屠宰性能是衡量產肉性能經濟價值的重要指標,也是養殖者追求的經濟指標。屠宰率越高,表明畜禽的產肉能力越大。肉質性能良好的雞群表現為屠宰率在80%以上,全凈膛率在60%以上[24]。吳信生[25]對河南斗雞屠宰研究發現,河南斗雞屠宰率在90%左右,全凈膛率在65%左右。本試驗研究表明,引入25%的洛島紅血緣的雜交斗雞群體在屠宰相關指標上與純種河南斗雞上沒有顯著的差異,其胸肌率和腿肌率在兩個雞種間也沒有顯著差異,說明各組的產肉性能總體較好,雜交后維持了原品種的良好優勢。

3.2 雜交雞和河南斗雞肌肉品質特性

常規肉品質指標包括pH、剪切力、失水率等幾個重要指標。肌肉pH會影響到肉的質量。剪切力常用來反映肌肉嫩度的高低[26],剪切力越大,嫩度越差。而失水率是評價肌肉保水性的一項重要指標,失水率越大,保水性越差[27],該指標的高低可以直接影響到肉的嫩度、多汁性等特性。本研究發現,總體來說導入25%洛島紅血緣對河南斗雞pH、失水率和剪切力指標沒有顯著影響,但其腿肌剪切力在公母雞均呈現以純種斗雞高于雜交斗雞的趨勢,這與人們反映河南斗雞的肌肉更有嚼勁的說法相一致。

本研究發現,導入25%洛島紅血緣顯著影響了斗雞的肌纖維組織特性。胸肌肌纖維直徑(純種斗雞>雜交雞)和胸/腿肌肌纖維密度(純種斗雞<雜交雞)均在兩個群體間呈現了顯著差異,表明25%洛島紅血緣的導入進一步提升了河南斗雞的肉質指標。肌纖維特性指標在群體和性別間的顯著差異,除了反映了不同群體和性別在肉品質上的差異外,也應該與河南斗雞經過長期的戰斗力選育有關。肌肉是力量的主要源泉,而河南斗雞是我國著名的斗雞品種,具有戰斗雞的稱號,其打斗時通常是速戰速決。雞的胸肌富含白肌纖維,而腿肌則為混合型(含白肌纖維和紅肌纖維),而白肌纖維也稱為快肌,與肌肉的爆發力緊密相關,有研究表明,快肌纖維較慢肌纖維直徑大[28],密度小,快肌纖維含有較多的收縮蛋白,并且由較大的運動神經元支配,神經纖維較粗,傳導速度較快,力量較慢肌纖維強[29]。此外,還觀察到純種河南斗雞公雞的肌纖維密度僅僅略高于母雞,而導入25%洛島紅血緣后進一步加大了胸、腿肌的肌纖維密度指標在性別間的差異(雜交公雞>雜交母雞,P<0.01)。

3.3 目的基因的變化特性

肌纖維特性(肌纖維直徑和密度等)與肌肉品質密切相關[30-31],對肌纖維直徑/密度與肉品質關系的研究表明,肌纖維直徑越小,密度越大,肉品質越好[32-33]。針對觀察到純種斗雞和雜交斗雞在肌纖維特性上的顯著差異,本研究采用熒光定量PCR進一步檢測了與肌肉發育和葡萄糖轉運緊密相關基因的表達。MyHC基因家族又稱肌球蛋白重鏈基因家族,是肌肉收縮的主要功能蛋白,該基因已經成為肌肉纖維類型劃分的主要分子標記[34],MyHC基因具有4種異構體,即MyHCⅠ、MyHCⅡa、MyHCⅡb和MyHCⅡx[35],其中本試驗選用的雞MyHC基因又稱MyH1D,屬快速型肌纖維,MyHC基因的表達量與肉質呈正相關[36]。MyoG和MyoD1基因都是生肌調節因子(MRFs)家族的成員,主要參與調控肌肉生長發育[37-38]。

選擇性掃描分析發現,肉雞經過幾世代高強度的選擇,其MyHC基因家族中的MyH1A、MyH1B和MyH1D基因受到顯著影響[39]。本試驗通過熒光定量PCR發現,MyHC基因在雞胸肌和腿肌中的表達均以雄性高于雌性,而在雞胸肌中不同群體間MyHC基因的表達均無顯著差異。而MyoG及MyoD1基因的表達在群體和性別間均無顯著差異。骨骼肌是攝取和利用葡萄糖的主要部位,GLUT4在促進骨骼肌葡萄糖吸收、維持整個機體血糖動態平衡中發揮著核心調控作用[40-41],另有研究表明,GLUT12可以促進多種己糖的轉運[42]。在本試驗中,GLUT12基因表達無顯著差異,而雞GLUT4基因在腿肌和腿肌的表達均呈現了顯著的群體和性別的互作效應,且在胸肌和腿肌的表達模式完全不同。這顯示25%洛島紅血緣的導入在改變斗雞的肌纖維特性的同時,也進一步改變了葡萄糖攝取與利用模式,相關的機制有待進一步研究。

3.4 雜交雞和河南斗雞血清生化指標

血清生化指標是衡量動物健康狀況、氧化代謝、生理機能等的重要指標[43]。機體血清ALB水平能反映動物蛋白質合成代謝的情況[44]。血清GLO可以一定程度上反映機體內參與免疫反應的血清球蛋白水平,其含量的高低是評價機體免疫水平特別是體液免疫水平的重要指標[45]。A/G參數反映ALB/GLO的比值,該指標不僅能反映脾的功能狀況,而且能作為衡量機體免疫機能的一項指標,在雜交雞中A/G值減小,反映了機體特異性免疫應答水平的增強,提高了抗病能力[46]。本研究發現,25%洛島紅血緣的導入顯著提高了機體血清球蛋白水平,降低了公雞A/G比值,這與雜交可以提高動物機體免疫力、生活力相一致[19,47]。血清中CHO、TG和LDL-C的含量是反映機體中脂質代謝的關鍵指標[48],LDL-C是機體轉運脂質的脂蛋白顆粒,負責將肝合成的膽固醇轉運至血液[49],對促進機體脂類代謝的平衡具有重要意義。本研究發現,這3個指標均以雄性顯著高于雌性,表明25%洛島紅血緣的導入顯著提高了河南斗雞血清CHO和LDL-C的水平,特別是對雄性雞的影響更大,其相關調控的分子機制還有待進一步研究。

4 結 論

通過雜交斗雞與純種河南斗雞的比較表明,導入25%洛島紅雞血緣后對河南斗雞的多項屠宰指標無顯著影響,但是顯著提升了雞只的血脂水平,提高了公雞骨骼肌的肌纖維密度,顯著影響了GLUT4的表達模式。