李 鐵,齊夢迪,張克英,王建萍,白世平,曾秋鳳,彭煥偉,玄 月,呂 莉,丁雪梅
(四川農業大學動物營養研究所 教育部動物抗病營養重點實驗室 動物抗病營養與飼料農業農村部重點實驗室動物抗病營養四川省重點實驗室,成都 611130)
蛋雞完整的生命周期包括三個階段,育雛期、育成期和產蛋期,其中育雛期和育成期是最細致的一個階段,維持此階段腸道健康對蛋雞的生長發育及后續生產具有重要作用。在飼料端“禁抗”的背景下,益生菌在畜牧生產中的應用引起了廣泛關注。枯草芽孢桿菌(BS)屬于革蘭陽性菌,它能夠產生內生芽孢,具有優異的抗逆性,能夠承受高壓、高溫并且易于儲存,可促進營養物質吸收、增強機體免疫性能及改善腸道環境[1-3]。屎腸球菌(EF)也是一種革蘭陽性菌,屬乳酸菌類,具有較強的黏附定植能力及耐藥性和抗菌性,可促進營養物質消化吸收,改善腸道微生態及提高機體免疫能力[4-5]。兩種及以上的復合菌攝入動物體內,可以豐富畜禽腸道菌群多樣性,促進腸道健康,不同的益生菌在宿主腸道內定植,可能產生不同益生元及有益物質,進而能提高畜禽生產性能[6]。目前,在肉雞上已有較多關于益生菌單獨或聯合添加的研究,但育雛育成期作為蛋雞腸道微生態環境構建和完善的關鍵階段,益生菌的使用對育雛育成期蛋雞的影響研究較少,且育雛育成期益生菌的使用對后續生產性能的影響也尚不清楚。因此,本試驗旨在研究飼糧添加BS和EF對蛋雞育雛育成期生長性能、血清生化和腸道健康的影響以及育雛育成期飼喂效果對后續生產性能的影響,以期為生產實踐提供參考。
枯草芽孢桿菌(BS)有效活菌數含量為3×1010CFU·g-1、屎腸球菌(EF)有效活菌數含量為2×109CFU·g-1,均購自濰坊某生物科技有限公司。
采用2×2因子完全隨機試驗設計,飼糧中BS添加量包括兩個水平(0或200 mg·kg-1),EF添加量包括兩個水平(0或200 mg·kg-1),共4個處理,每個處理6個重復,每個重復22只雞,共528只1日齡體重相近的羅曼粉蛋雞。試驗期30周,試驗育雛育成期1~20周進行試驗處理,產蛋期21~30周所有組飼喂基礎飼糧,不進行益生菌處理。
試驗在四川省雅安市四川農業大學教學科研基地進行。育雛期雛雞采用三層籠養模式,每兩個相鄰雞籠為1個重復,各重復位于不同的籠位,均勻分布于雞舍,育雛舍雞籠長寬為80 cm×50 cm,籠高40 cm。育成階段蛋雞轉移至育成舍,采用兩層籠養模式,育成舍雞籠長寬為90 cm×80 cm,籠高40 cm,每兩個相鄰雞籠為1個重復,產蛋期轉移至蛋雞舍,根據蛋雞舍管理流程進行,飼養期間自由飲水。飼養管理措施依據羅曼粉蛋雞飼養手冊(2018)進行。依據羅曼粉蛋雞飼養手冊(2018)將飼糧劃分為5個階段:育雛階段(1~8周)飼糧分為幼雛料(1~3周)和中雛料(4~8周);育成期(9~20周)分為育成前期料(9~17周)和開產前料(18~20周)。益生菌直接添加到1~20周基礎飼糧中,添加量根據公司推薦劑量添加。本試驗采用粉料,具體基礎飼糧組成及營養水平見表1。

表1 基礎飼糧組成及營養水平(風干基礎)
1.4.1 血清樣品 試驗20周結束時,每個重復選取1只接近平均體重的雞,靜脈采血10 mL,分裝于不抗凝的采血管中,3 500 r·min-1、15 min分離血清,將上層血清分裝入無菌EP管中,-20 ℃保存備測。
1.4.2 腸道樣品采集 將采血雞處死后,立即分離十二指腸、空腸、回腸腸段,十二指腸、空腸、回腸去除內容物稱重并測量自然長度。取十二指腸、空腸、回腸中部2 cm,用生理鹽水將腸道食糜沖洗干凈,置于4%多聚甲醛溶液中,進行腸組織切片制作及觀察。隨后用載玻片輕輕刮取空腸黏膜,置于EP管中,-80 ℃保存,待測。
1.5.1 生長性能 試驗期間,記錄雞只死淘情況并及時稱重。試驗20周結束時,提前斷食8 h,正常供水,以重復為單位稱重并記錄耗料量,計算1~20周蛋雞平均體重(BW)、平均體增重(BWG)、平均采食量(AFI)和料重比(F/G)
1.5.2 血清生化指標 使用自動生化分析儀(日立3100)測定蛋雞20周血清中總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)含量、堿性磷酸酶(ALP)、谷草轉氨酶(AST)和谷丙轉氨酶(ALT)的活性。
1.5.3 血清生長相關激素 采用酶免雞用ELISA試劑盒(由江蘇酶免實業有限公司提供)結合酶標分析儀(Rayto RT-6 100)測定蛋雞20周血清生長激素(GH)、生長激素受體(GHR)、胰島素樣生長因子-Ι(IGH-Ι)的水平。
1.5.4 腸道相對長度及重量 計算蛋雞20周的十二指腸、空腸、回腸的相對重量和長度。計算公式為:相對重量=絕對重量/活重(g·kg-1);相對長度=絕對長度/活體重(cm·kg-1)。
1.5.5 腸道形態 十二指腸、空腸和回腸切片進行腸組織切片制作及觀察(送檢四川揚克斯特科技有限公司)。將用10%中性甲醛溶液固定好的腸段用乙醇脫水,二甲苯透明,石蠟包埋進行切片,然后用蘇木精-伊紅(HE)染色,顯微成像系統進行拍照,采用Image Pro Plus 6.0對組織中10個完整絨毛高度(VH)及相對應的10個隱窩深度(CD)進行測量,統計出平均值并計算絨毛高度/隱窩深度(VH/CD)。
1.5.6 空腸黏膜屏障基因表達 測定空腸黏膜屏障ZO-1、Occludin和Claudin-1基因mRNA相對表達量,具體操作步驟及計算方法參照本課題組張琦等[7]的方法。反應程序為:95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 34 s,40個循環;95 ℃ 15 s,65 ℃ 1 min,95 ℃ 15 s。目的基因的 mRNA 相對表達量采用2-ΔΔCt計算。引物序列交予成都生工生物工程有限公司合成,引物設計見表2。

表2 相關基因與引物信息
1.5.7 生產性能 在21~30周產蛋期每天16:00揀蛋,記錄每個重復的產蛋個數、總蛋重、大小蛋、破蛋數、軟蛋數、臟蛋數、合格蛋數[ 除去沙殼蛋、軟蛋、破蛋、畸形蛋、臟蛋、大蛋(> 75 g)、 小 蛋(<40 g)]、合格蛋重以及死淘情況,記錄每周的耗料量。參照《家禽生產性能名詞術語和度量統計方法》(NY/T 823—2004)計算平均日采食量(ADFI)、產蛋率、合格蛋率、平均蛋重和料蛋比。計算公式如下:
產蛋率(%)=(產蛋數/雞只數)×100;
合格蛋率(%)=(合格蛋數/總產蛋數)×100;
平均蛋重(g)= 總蛋重/產蛋數;
料蛋比= 采食量/總蛋重;
平均日采食量(g·只-1)= 耗料量(g)/
實際飼養日蛋雞只數的累加只數。
數據采用EXCEL 2010初步整理,隨后采用SAS 9.0軟件GLM程序進行雙因素分析,模型主效應包括枯草芽孢桿菌和屎腸球菌及交互作用,當方差分析顯著時,采用Duncan’s方法進行多重比較檢驗。數據以平均值和SEM進行表示,P<0.05表示差異顯著。
由表3可知,添加BS和EF對蛋雞BW、BWG、AFI、F/G均無顯著影響(P>0.05)。BS和EF對蛋雞F/G存在極顯著交互作用,聯合添加顯著提高了F/G(P<0.01)。

表3 育雛育成期飼糧添加BS和EF對蛋雞生長性能的影響
由表4可知,添加BS有降低血清ALT含量的趨勢(P=0.067);添加EF對蛋雞血清生化無顯著性影響(P>0.05)。根據交互效應結果可知,聯合添加顯著降低了蛋雞血清TP、HDL-C、TC的含量(P<0.05)。

表4 育雛育成期飼糧添加BS和EF對蛋雞血清生化的影響
由表5可知,添加BS對蛋雞血清GH、GHR和IGF-Ⅰ無顯著影響(P>0.05);添加EF有提高血清GH的趨勢(P=0.078)。添加BS和EF對蛋雞生長激素無顯著交互作用(P>0.05)。

表5 育雛育成期飼糧添加BS和EF對蛋雞生長激素的影響
由表6可知,添加BS和EF均顯著提高了回腸的相對長度(P<0.05)。添加BS和EF對腸道相對長度和重量無顯著交互作用(P>0.05)。

表6 育雛育成期飼糧添加BS和EF對蛋雞腸道生長發育的影響
由表7可知,添加BS有提高空腸絨毛高度(P=0.051)和提高隱窩深(P=0.069)的趨勢;添加EF顯著提高了空腸絨毛高度(P<0.05),有提高空腸CD的趨勢(P=0.072)。添加BS和EF對蛋雞腸道形態無顯著交互作用(P>0.05)。
由表8可知,添加BS顯著提高了空腸黏膜Occludin基因的相對mRNA表達量(P<0.05),有提高Claudin-1基因相對mRNA表達量的趨勢(P=0.081);添加EF對空腸黏膜屏障基因相對mRNA表達無顯著影響(P>0.05)。添加BS和EF對腸道屏障基因表達無顯著交互作用(P>0.05)。

表8 育雛育成期飼糧添加BS和EF對蛋雞腸道屏障基因表達的影響
由表9可知,添加BS有提高21~30周平均蛋重的趨勢(P=0.077),而添加EF對蛋雞生產性能無顯著影響(P>0.05)。添加BS和EF對蛋雞21~30周生產性能無顯著交互作用(P>0.05)。

表9 育雛育成期飼糧添加BS和EF對蛋雞21~30周生產性能的影響
蛋雞開產前的體重對蛋雞產蛋期生產性能的發揮具有重要決定作用,目前益生菌對動物生長性能的影響研究較多,但結果不盡一致。孫玲玲等[8]研究發現,飼糧中添加BS顯著提高了五龍鵝雛鵝28 d BWG,降低了F/G;張雪等[9]研究發現,添加BS可顯著降低肉雞21~42 d和1~42 d F/G;袁文菊等[10]研究發現,飼糧中添加BS顯著降低了1日齡肉雞1~21 d和1~35 d的F/G。本研究發現,添加BS對蛋雞生長性能無顯著影響,但與其他組相比,添加BS組有較低的F/G,以及較高的BW和BWG。這與前人研究結果類似,說明BS可以促進的蛋雞的生長性能,原因可能是BS進入畜禽腸道后,在腸道進行定植,消耗腸道內多余的游離氧,改善腸道微生態,促進腸道有益菌增殖,減少有害菌定植,并且BS本體及其在腸道內的代謝產物可以產生與消化有關的酶類,例如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等,從而提高飼料轉化效率,提高生長性能。BS組在本試驗中相較于其他組,具有較高的開產前BW,差異不顯著,在開產后同樣具有較高的產蛋率,差異不顯著。說明開產前BW也會影響蛋雞開產后產蛋性能。前人關于EF在家禽生長性能的研究上得到了不同的結果,燕磊等[11]研究發現,EF對1~41 d肉雞BW、ADG、F/G及平均日采食量無顯著影響,但都有所提高。韓鵬敏等[12]在乳鴿上的研究發現,EF單獨添加可以提高乳鴿12~28 d平均日增重,BS和EF混合添加對平均日增重無顯著影響。彭眾等[13]發現,與對照組相比,添加EF或抗生素試驗組肉雞ADFI、ADG及FCR均無顯著差異。本研究發現飼糧中添加EF對蛋雞生長性能無顯著影響,與前人研究結果類似,EF對畜禽生長性能的影響結果不同可能與試驗動物差異、菌株差異以及添加量有關。本研究BS和EF聯合使用顯著增加了料肉比。李修宇[14]研究發現,在靈山土雞飼糧中添加2.56×105CFU·kg-1丁梭酸菌,其21 d平均體重相較于添加復合菌(2.56×105CFU·kg-1丁梭酸菌;6.44×106CFU·kg-1枯草芽孢桿菌)和空白對照組,提高了0.4%和0.3%,單獨添加的效果好于兩種菌聯用。同樣地,韋區[15]研究發現,在籠養模式下,與復合益生菌組相比,單獨添加益生菌提高了50 d三黃雞末體重2.57%。其原因可能是BS和EF均定植于后腸道,兩者聯用添加量導致某一段腸道內含有過多的活性菌從而導致腸道菌群結構失衡,并且大量活性菌繁殖,額外消耗了腸道部分營養物質,從而導致仔雞生長性能較差[16]。
血清生化指標可以反映動物新陳代謝的具體情況。血清中谷草轉氨酶(AST)和谷丙轉氨酶(ALT)可以反映出肝的損傷情況,當肝受到損傷時,血液中ALT和AST含量會顯著升高。本研究發現,飼糧添加BS有降低ALT的趨勢。史燕云等[17]在蛋雞上的研究表明,添加BS顯著降低了蛋雞血清堿性磷酸酶(ALP)和ALT活性。李安東等[18]研究發現,添加BS、丁酸梭菌及其組合與對照組相比可以顯著降低血清ALT、AST的含量。本研究與前人結果基本一致,其原因可能是,在本試驗中BS可以通過提高血清中TP的濃度,提高機體免疫水平,從而提高肝細胞的解毒功能,對肝組織起到了保護作用[19]。
血漿TG、TC、HDL和LDL的含量可以直觀反映出動物機體的脂代謝情況,本研究中,聯合添加顯著降低了血清TC的水平。Capcarova等[20]指出,在ISA棕雞飼糧中添加EF顯著降低了血清TC含量。Kurtoglu等[21]研究發現,與對照組相比,添加BS顯著降低了血清TC和蛋黃TC的水平。本研究與前人研究一致,說明益生菌兩者聯合具有促進機體脂質代謝的作用,益生菌可能抑制TC合成過程中的關鍵酶羥甲基戊二酸單酰輔酶A的活性來抑制TC沉積[22]。本研究發現,聯合添加益生菌,降低了血清HDL-C的含量。彭眾等[13]研究發現,飼糧中添加EF顯著提高了肉雞血清HDL-C,降低了LDL-C。任躍昌等[23]研究發現,添加BS顯著降低了蛋雞血清HDL-C。前人關于益生菌對血清HDL-C的影響得到了不同的結果,造成差異的原因可能與動物品種、微生態制劑及使用量不同有關,這也可能是本研究中兩種益生菌聯合添加生長性能較差的原因。
血漿TP和ALB的含量能夠反映機體對蛋白質的吸收和代謝水平及機體免疫情況。本研究發現,兩種益生菌聯合添加降低了血清TP的含量,而添加BS和EF對血清TP含量有一定程度提高,差異不顯著。丁浩等[24]研究發現,BS可以提高保育豬生長性能,并且顯著增加了血漿TP含量。申杰等[25]研究發現,EF可以顯著提高42 d肉仔雞血清TP、ALB和球蛋白含量。葉枝林[26]研究發現,飼糧添加EF著提高了42 d肉鴨血清TP和ALB水平。本研究與前人結果類似,提示飼糧中添加益生菌可以促進機體對蛋白質消化吸收的能力,改善機體營養水平及提高免疫力[27]。而本研究兩種益生菌聯用降低了血清TP含量,這說明兩者聯用可能降低機體對蛋白質的吸收情況及代謝水平,這可能也是本試驗中兩種菌聯合添加,其BW、BWG劣于不添加益生菌及兩種菌單獨添加的原因。
動物的生長受生長軸的調控,生長軸包含“下丘腦-垂體-靶器官”,生長激素釋放激素、生長激素、類胰島素生長因子都能影響動物的內分泌系統,從而影響動物生長。在本試驗中,飼糧中添加EF有提高血清GH的趨勢。王尚榮[28]研究發現,飼糧中添加BS、乳酸桿菌、雙歧桿菌、光合菌及復合菌都能顯著提高血清生長激素、胰島素、三碘甲狀腺原氨酸(T3)和甲狀腺素(T4)的含量。王寶維等[29]研究發現,飼糧添加BS和鋅能夠協同促進肉鵝15周的生長激素水平。前人結果與本研究基本一致,結合生長性能可以發現,蛋雞GH的作用較為復雜,動物實際的生長速度和體重發育情況并不與血清GH水平相對應。賀淹才等[30]在泰和雞上的研究發現,1和35 d泰和雞血清GH水平顯著高于同日齡的白羽肉雞,但兩者的體重差異正好相反??赡茉蚴怯捎谶^高的GH抑制了機體的生長,比如,生長速度緩慢的伴性侏儒雞血清GH顯著高于正常雞,而這種規律在蛋雞中也有所發現,趙茹茜等[31]研究發現,生長慢的蛋雞血清GH含量顯著高于生長快的肉雞。根據本研究不能得出益生菌促進蛋雞生長是否與血清GH含量有關的結論,益生菌與生長激素及生長性能之間的作用關系仍需進一步探討。
家禽對營養物質的消化吸收主要依靠小腸,小腸吸收面積越大對營養物質的利用越有利。小腸長度和體增重之間存在一定聯系,本研究發現,添加BS和EF可以顯著提高回腸長度。關于益生菌在蛋雞腸道長度重量方面的研究較少,張愛武等[32]研究發現,與對照組相比,飼糧添加BS有提高鵪鶉回腸和十二指腸長度的趨勢。本試驗結果與前人研究基本一致,其原因可能是益生菌到達腸道后,消耗腸道多余的氧氣,促進有益菌增殖,維持了腸道健康,從而提高了蛋雞腸道發育。
動物腸道形態的改變會影響對營養物質的消化吸收,從而影響動物表觀的生產性能,腸道的消化吸收能力與腸道絨毛高度、隱窩深度和絨隱比有關。本研究發現飼糧中添加BS和EF均提高了空腸VH。鐘光等[33]研究發現,飼糧中添加BS能顯著降低肉仔雞空腸CD。李雪媛[34]在0~16周的蛋雞上研究發現,BS可以顯著降低十二指腸CD,且VH/CD有升高趨勢,此外0~3周的混合添加對12周的空腸仍具有改善作用。本研究與前人研究基本一致,表明飼糧中添加益生菌對蛋雞腸道形態具有一定改善作用,這可能是由于益生菌在腸道中的代謝產物短鏈脂肪酸如:乙酸、丙酸和丁酸等,例如丁酸可以為腸道上皮提供營養,促進腸黏膜細胞分化,改善腸道形態[35]。
緊密連接蛋白的形成對防止細菌和抗原細胞旁擴散具有重要意義,一些重要的上皮細胞緊密連接蛋白,如ZO-1、Occludin和Claudin,有助于維持腸上皮屏障的完整性,對于腸黏膜損傷的修復和腸道健康至關重要[36]。本研究發現添加BS顯著提高了空腸黏膜Occludin基因的mRNA相對表達量,有提高Claudin-1基因的mRNA相對表達量的趨勢。陳志永等[37]研究發現,BS可以顯著提高66 d黃羽肉雞空腸緊密連接蛋白Nectin-1以及Occludin-7基因的mRNA相對表達量。潘雪[38]研究發現,BS顯著提高了35 d肉雞腸道ZO-1、Occludin基因的mRNA相對表達量。本研究與前人研究一致,說明BS可促進可調節腸道屏障功能,其原因可能是BS代謝產物可以通過激活過氧化物酶體增殖物激活受體來上調緊密連接蛋白表達,從而改善腸道屏障功能,降低腸道通透性,有利于維持腸道健康[39]。本研究中,添加EF對蛋雞空腸黏膜屏障基因mRNA相對表達量無顯著影響。崔百磊等[40]研究發現,EF對21 d仔豬空腸、回腸Occludin和ZO-1基因的mRNA相對表達量均無顯著影響。本研究與前人研究結果相似。但董正林[41]研究發現,飼糧添加微囊化糞腸球菌顯著增加 21、42 d肉雞回腸黏膜閉Occludin、Claudin-1 mRNA表達水平。焦宇洲等[42]研究發現,添加不同劑量的EF均對感染球蟲病肉雞腸道ZO-1基因的mRNA相對表達量無顯著影響,低劑量對腸道Occludin基因的mRNA相對表達量無影響,但高劑量可以促進Occludin的表達量。造成以上結果差異的原因可能與動物種類、菌株品種及添加劑量有關,兩種益生菌聯合添加對空腸黏膜屏障基因相對mRNA表達量無顯著影響可能與添加劑量過大,活菌數較多,從而影響了腸道微生態平衡有關。
在集約化養殖的背景下,產蛋雞產蛋率下降,蛋品質質量差,一直是蛋雞養殖業亟待解決的問題,本研究發現,育雛育成期添加BS有提高21~30周平均蛋重的趨勢,并且產蛋率相較于不添加益生菌、添加EF組和聯合添加組均有所提高,但差異不顯著。前人在研究BS對生產性能的影響上均取得了較好的效果,賀軍等[43]研究發現,BS對蛋雞生產性能的影響主要體現在產蛋率上升和平均蛋重增加上,飼糧中添加2×104、4×104、6×104CFU·g-1BS與對照組相比產蛋率分別提高了1.03%、2.42%、2.12%,差異顯著;平均蛋重分別提高了1.93、2.75、2.78 g,且差異顯著。趙姝嫻等[44]研究發現,飼糧添加BS與對照組相比,雞蛋重量顯著提高了1.6~3.8 g,料蛋比顯著降低,平均日采食量無顯著差異。本研究與前人研究一致,本研究中育雛育成期添加BS對產蛋期生產性能的提高,可能原因是本試驗BS育雛育成期添加,其菌體進入胃腸道后,改善了腸道菌群結構,提高了空腸屏障基因Occludin、Claudin-1基因相對mRNA表達量,進而促進了腸道健康,并且育雛期育成期添加BS的效果可以持續到產蛋期,對產蛋期腸道健康產生積極影響,另外本試驗BS在育成期結束時具有較高的BW,也可能是產蛋期具有較高生產性能的原因。本研究中添加EF和兩種菌聯合添加對蛋雞生產性能無顯著影響,可能原因是添加EF和兩種菌聯合添加對蛋雞育成期結束BW無顯著影響,此外對蛋雞空腸屏障功能改善較少,對蛋雞腸道健康無明顯促進,進而對蛋雞生產性能無顯著影響,本研究進一步說明開產前體重對蛋雞生產性能至關重要。
育雛育成期飼糧添加BS(6×106CFU·g-1)可以提高蛋雞生長性能,改善血清生化指標,促進腸道健康,育雛育成期飼喂效果可以持續到產蛋期并提高產蛋期生產性能,其效果優于EF和兩種益生菌聯用。