脂噬對奶牛乳腺上皮細胞脂滴大小的調控研究

康方圓,劉鎮滔,吳奎顯,倪 晗,鐘 凱,李和平,楊國宇,韓立強*

(1.河南農業大學動物醫學院 農業部動物生化與營養重點實驗室,鄭州 450046;2.河南牧業經濟學院 河南省動物生長發育重點實驗室,鄭州 450046)

乳脂肪在乳中是以脂肪球的形式存在,研究發現脂肪球的粒徑范圍從200 nm到15 μm不等[1],并且脂肪球粒徑能夠影響乳品的營養價值和產品的下游加工[2]。乳脂肪球的粒徑主要受到乳腺上皮細胞內脂滴大小的影響[3],因此,研究奶牛乳腺上皮細胞脂滴大小的調控對于闡明奶牛乳腺對脂肪球粒徑的調控機制至關重要。

脂滴(lipid droplet,LD)是中性脂質的儲存細胞器,它由一個中性的脂質核心組成,主要含有甘油三酯(triglyceride,TAG)和膽固醇酯(cholesteryl ester,CE),外面包裹著單層磷脂和各種相關蛋白[4]。在不同的細胞類型和代謝狀態下,LD大小差異很大,受到多個復雜生物過程的調節,包括TAG合成、LD融合和自噬介導的LD降解等[5]。LD的合成和分解對于維持細胞能量和脂質穩態很重要。

自噬(autophagy)是一種細胞器的分解代謝途徑,對細胞中受損或功能障礙的成分、蛋白和細胞器等通過溶酶體降解[6]。自噬是一個動態的、多步驟的過程,涉及自噬體的形成、自噬體與溶酶體融合形成、自噬溶酶體的降解[7]。近年來,一種被稱為脂噬(lipophagy)的選擇性自噬作為脂滴的分解和代謝途徑受到了關注。大量自噬發生在對營養饑餓的反應中,而選擇性自噬則針對特定貨物進行降解。脂自噬是一種靶向脂滴的選擇性自噬,調節脂質儲存異常[8],例如在營養缺乏的情況下,游離脂肪酸在脂解酶的作用下從LD釋放出來,并用作能量底物[9]。與此同時,饑餓還會引起一個細胞反應——誘導自噬,LDs可以與自噬小體結合,使其中的游離脂肪酸釋放,這些脂肪酸還可以作為線粒體β型氧化的燃料[10]。脂噬被認為是一種選擇性降解細胞脂滴的自噬途徑,在模式動物的研究中發現,抑制脂自噬會增加脂滴的體積和數量[11],在小鼠中誘導脂自噬會減少脂滴的體積[12],然而脂噬對奶牛乳腺上皮細胞中的脂滴作用目前還未見報道。因此,本試驗通過建立饑餓誘導乳腺上皮細胞脂滴自噬的模型,觀察自噬對脂滴大小和數量的作用,為闡明奶牛乳腺上皮細胞脂滴的調控機制打下基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

奶牛原代乳腺上皮細胞(BMECs)為本實驗室凍存保存;亞油酸(linoleic acid)和Alexa FluorTM488 goat anti-rabbit lgG(H+L)購自thermo scientific公司;高糖培養基(DMEM)和磷酸鹽緩沖液(PBS)購自HyClone公司;優級胎牛血清購自四季青公司;牛胰島素與氫化可的松購自Sigma公司;牛催乳素購自ProsPec公司;胰蛋白酶和DPBS購自Gibco公司;多聚甲醛固定液購自Servicebio公司;異丙醇購自MACRON公司;飽和油紅O購自北京索萊寶公司;蘇木素染液購自鼎國公司;全蛋白提取試劑盒和蛋白定量試劑盒購自康為世紀;10% PAGE凝膠快速制備試劑盒購自百奧曼;Omni-ECLTM超靈敏化學發光檢測試劑盒購自雅酶公司;β-actin(66009-1-lg)、LC3B單克隆抗體(ab48394)購自abcam公司;P62/SQSTM1多克隆抗體(18420-1-AP)、HRP偶聯的羊抗兔IgG抗體和HRP偶聯的羊抗鼠IgG抗體購自Proteintech公司;抗熒光淬滅封片液購自碧云天公司;細胞爬片和24孔板購自NEST。

1.2 細胞培養

按照Han等[13]的方法分離和培養BMECs。從4～5歲的泌乳奶牛身上獲取150 mg的乳腺組織,并立即運至實驗室。用DPBS洗滌樣品,并用鑷子將樣品轉移到細胞培養皿中,溫度37 ℃、5% CO2和95%空氣。6 h后,加入5 mL基礎培養基培養。隨后,用0.25%胰蛋白酶富集上皮細胞,加入新鮮培養基培養貼壁細胞。同樣方法連續純化BMECs,取1×106個細胞·mL-1懸浮于凍存培養基中凍存。從-80 ℃冰箱取出凍存的細胞,在37 ℃水浴鍋中快速融化,1 100 r·min-1離心4.5 min,棄上清,加入泌乳培養基[14]重懸細胞,在5% CO2和37 ℃培養箱中培養,待細胞密度達90%且生長狀態良好時,用胰蛋白酶消化,加入等量的10% FBS中和,37 ℃、750 r·min-1離心4 min,使細胞懸浮,為后續試驗提供細胞基礎。

1.3 檢測饑餓誘導脂噬后脂滴大小和數量

收集細胞瓶中處于對數期的細胞,用胰酶消化后加入1 mL培養基制成細胞懸液,計數,調整細胞濃度為5×105個·mL-1,在24孔板中以每孔500 μL接種。將24孔板置于37 ℃、5% CO2培養箱中繼續培養;顯微鏡下觀察細胞,待細胞融合度達到80%時,加入100 μmoL·L-1的LA亞油酸作用24 h后,將處理后的細胞換至無血清的DMEM培養基分別饑餓誘導0、6、12、24、48 h,取出細胞板,用PBS洗滌3次,用4%多聚甲醛固定液固定20～30 min,丟棄固定液,用PBS洗滌3次。加入60%異丙醇5 min,棄掉,然后加入新配制的油紅O工作液(油紅O∶水,3∶2)20～30 min,丟棄染色液,PBS洗滌2～5次,直到沒有多余的染料溶液。加入蘇木精染色液,細胞核重新染色1～2 min,丟棄染色液,洗滌2～5次,取出細胞爬片,置于載玻片上。密封后,在光學顯微鏡油透鏡下拍照觀察脂肪滴。每組選取3張染色細胞爬片,每張爬片選取3張圖片,每張圖片隨機選取60個LD,使用Cell Sens軟件測量直徑。每幅圖像測量完成后,將圖像保存,并將測量結果輸出到Excel表格中,用于后續分析脂滴的平均大小和分布比例。每張染色拍照的細胞選擇3張圖片,每張圖片隨機選擇3個細胞,統計細胞周圍脂滴的數量,計算細胞內脂滴的平均數量[15]。

1.4 饑餓誘導下脂滴蛋白表達的檢測

饑餓誘導細胞不同時間后,收集細胞,使用康為世紀全蛋白提取試劑盒和蛋白定量試劑盒提取全蛋白,具體操作見說明書。定量完成后,SDS-PAGE凝膠電泳,隨后使用PVDF膜濕轉操作,室溫封閉2 h,過夜4 ℃孵育特異性一抗β-actin、LC3和P62(1∶500稀釋),回收一抗,洗膜5 min,5次,之后于室溫孵育二抗1.5 h(1∶5000稀釋),回收二抗,洗膜5 min,5次,最后用化學發光顯色儀檢測。

1.5 饑餓誘導下脂滴和自噬蛋白共定位

收集饑餓誘導24 h細胞,棄掉培養基,PBS清洗一遍,加500 μL多聚甲醛固定細胞,室溫30 min后棄去,PBS清洗;加入500 μL,0.1% Tritonx-100通透細胞,10 min后棄去,PBS洗3遍;10% FBS(PBS配置)封閉1 h,夾出爬片,正面朝上,放于干凈纏于封口膜的24孔板蓋子上,室溫孵育一抗;1 h后PBS清洗3遍,避光孵育二抗;1 h后PBS洗3遍,超純水清洗3遍;Nile Red 脂滴染色15 min,PBS洗3遍;用DAPI染核,10 min后,PBS清洗3遍,超純水清洗3遍;加入封片劑10 μL·片-1,過夜拍片。

1.6 透射電鏡觀察脂滴自噬

細胞饑餓處理24 h后,收集細胞樣品,倒掉所有培養基,加入1 mL新鮮的培養基,放入CO2培養箱,37 ℃,5 min;用細胞刮一次到底刮下來,收集到2 mL圓底EP管內,先加入100 μL固定液(2.5%戊二醛),預固定;2000 r·min-1,吸凈上清液,沿壁加入2 mL固定液。接下來按如下順序操作:2.5%戊二醛(4 h)→PBS漂洗(10 min×4次,每次需要吹打、離心800 r·min-1×3 min)→1%鋨酸(2 h)→PBS漂洗(10 min×4次,每次需要吹打、離心800 r·min-1×3 min)→50%乙醇(10 min吹打、離心800 r·min-1×3 min)→70%乙醇10 min吹打、離心800 r·min-1×3 min)→80%乙醇(10 min吹打、離心800 r·min-1×3 min)→95%乙醇(10 min吹打、離心800 r·min-1×3 min)→100%乙醇(10 min×2次,每次吹打、離心800 r·min-1×3 min)→100%丙酮(10 min×2次,每次需要吹打、離心800 r·min-1×3 min)→環氧樹脂812:丙酮(1∶1,2 h;2∶1,2 h)→環氧樹脂812(過夜)→聚合37 ℃,2 h→45 ℃,12 h→60 ℃,24 h→半薄切片定位、超薄切片→飽和醋酸雙氧鈾水溶液染色(20 min)→水洗→烘干→檸檬酸鉛溶液染色(5 min)→水洗→烘干→電鏡觀察拍照。

1.7 數據統計

使用SPSS 21統計分析數據,結果表示為“平均數±標準差”,Prism軟件作圖,所有數據至少3個重復,采用單因素方差分析和T檢驗進行顯著性分析,P<0.05被認為有顯著差異。

2 結 果

2.1 饑餓誘導脂噬對脂滴大小和數量的影響

饑餓誘導后通過油紅O對細胞脂滴染色(圖1A),并對脂滴直徑測量,統計分析,發現饑餓處理24 h后,脂滴的平均直徑從1.57 μm增加到2.12 μm(圖1B),每個細胞脂滴的平均數量顯著減少,從39減少到24(圖1C),經統計分析大脂滴的比例從4.82%增加到16.29%,小脂滴的比例從18.33%減少至5.37%(P<0.05,圖2)。

A.油紅O染脂滴;B.脂滴的平均尺寸;C.每個細胞脂滴的平均數量。* P<0.05,** P<0.01,*** P<0.001,**** P<0.000 1,下同A. Oil Red O stained lipid droplets; B. Average size of lipid droplets; C. Average number of lipid droplets per cell. *. P<0.05, **. P<0.01, ***. P<0.001, ****, P<0.000 1, the same as below

圖2 不同饑餓時間對脂滴分布比例的影響Fig.2 Effect of different starvation times on the proportion of lipid droplet distribution

2.2 LD和LC3蛋白的共定位

饑餓24 h后通過免疫熒光染色發現,自噬蛋白LC3定位在脂滴上,脂滴與LC3點狀共定位顯著增強,這一結果表明饑餓誘導下乳腺上皮細胞自噬被激活(圖3)。

紅色為脂滴,藍色為細胞核,綠色為LC3。標尺=20 μmLipid droplets are shown in red, nuclei in blue, and LC3 in green. Bar=20 μm

2.3 透射電鏡觀察脂滴自噬

通過透射電鏡觀察,饑餓0 h時,細胞核周圍有著尺寸大小不一的脂滴,很少有自噬體的存在,在饑餓處理24 h后,可以觀察到細胞核周圍存在較多的自噬溶酶體,并且自噬溶酶體包裹著脂滴,表明細胞發生脂噬(圖4)。

LD. 脂滴;AV. 自噬溶酶體。右列圖是左列圖方框內的局部放大LD. Lipid droplets; AV. Autolysosome. The image on the right is a partial enlargement of the square in image on the left

2.4 饑餓誘導對自噬蛋白表達的影響

在饑餓0、6、12、24和48 h后,Western blot檢測自噬蛋白LC3和P62蛋白的表達,發現饑餓24 h后,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值顯著增加,與0 h相比,饑餓24 h時LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值顯著增加1倍,P62蛋白表達下調26%(圖5)。

圖5 不同饑餓時間對自噬相關蛋白表達的影響(n=3)Fig.5 Effect of different starvation times on the expression of autophagy-related proteins (n=3)

3 討 論

在體外培養的乳腺上皮細胞中,無血清培養的環境下,脂滴生成數量很少。本團隊前期試驗發現,加入亞油酸刺激后,隨著LA濃度的增加會刺激脂滴蓄積,綜合細胞活力和脂滴蓄積的結果(數據未顯示),本研究選擇100 μmol·L-1的LA刺激細胞引起脂滴蓄積。

自噬的作用是降解細胞內的細胞器、細胞質和蛋白質[16]。在哺乳動物系統中,用于識別自噬的關鍵生物學標記是構成自噬體膜的微管相關蛋白1A/1B輕鏈 3 (LC3)。在自噬過程中,胞質LC3-Ⅰ與磷脂酰乙醇胺偶聯形成LC3-Ⅱ,然后LC3-Ⅱ被并入自噬體膜,另一個廣泛使用的自噬流標志物是自噬受體sequestosome 1 (p62/SQSTM1 ),它在物理結構上將自噬貨物與自噬膜連接起來[17]。研究發現,饑餓處理會誘導細胞自噬,在饑餓動物的肝切片中,脂滴上LC3陽性的表達增加[18]。本試驗通過免疫熒光發現自噬蛋白LC3B定位在了脂滴上,表明在饑餓誘導下,脂滴發生了自噬。脂噬作為一種選擇性自噬,主要針對脂滴自噬[19]。本試驗通過透射電鏡觀察,饑餓24 h后細胞內形成自噬溶酶體,并且自噬溶酶體中包裹有脂滴,這一結果表明饑餓誘導的自噬屬于脂噬。

饑餓處理奶牛乳腺上皮細胞后,蛋白免疫印跡發現,隨著饑餓誘導時間的增加,自噬蛋白LC3-Ⅱ 顯著增加,P62蛋白降解。進一步油紅O染色發現,饑餓處理后大脂滴比例顯著增多,小脂滴比例顯著減少,脂滴平均大小顯著增加,脂滴數量顯著減少,表明饑餓誘導的脂噬影響了奶牛乳腺上皮細胞中脂滴的大小和數量。其他研究也發現,脂噬廣泛參與了儲存在LD中的脂質的動員[20]。對自噬缺陷肝組織的油紅O染色顯示,與對照小鼠相比,脂滴的數量和大小顯著增加[21]。其他報道表明,自噬也可以通過在營養有限的條件下促進LD的合成來上游作用于脂肪分解[22]。有研究發現,與線粒體自噬相類似,LD的脂噬是由一種基于大小的機制啟動的,該機制依賴于LD達到一定的適度直徑[23-24]。脂噬對脂滴大小選擇性的具體機制還不清楚,可能與LD單層本身具有獨特的生物物理特性有關[25-27]。

乳脂肪是牛乳中的主要成分,在牛乳中主要以乳脂肪球的形式存在,脂滴是合成乳脂肪球的前體,本研究在體外乳腺細胞中發現脂噬對脂滴大小具有調控作用,那么脂噬是否能夠在體影響奶牛乳腺組織合成乳脂肪還有待進一步研究。

4 結 論

本研究發現,經饑餓處理后奶牛乳腺上皮細胞發生脂噬,引起脂滴平均直徑顯著增加,為深入研究奶牛乳腺上皮細胞脂滴大小調控機制提供了理論基礎。