J亞群禽白血病病毒血液核酸篩查技術(shù)的建立

董欣怡,李錦群,陳欽璽,廖 明,曹偉勝

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,人獸共患病防控制劑國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室,農(nóng)業(yè)部獸用疫苗創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東省動(dòng)物源性人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣州 510642)

禽白血病(avian leukosis,AL)是由禽白血病病毒(avian leukosis virus,ALV)引起的一類禽腫瘤性疾病。目前ALV可分為A～K共11個(gè)亞群,其中,ALV-J流行最廣,可引起雞的髓細(xì)胞瘤、血管瘤、纖維肉瘤等,對(duì)養(yǎng)禽業(yè)危害巨大[1-6]。目前,尚無針對(duì)AL的疫苗或藥物,對(duì)種雞群進(jìn)行凈化是防控AL的主要措施[7-9]。

目前,病毒分離法是凈化檢測(cè)外源性ALV的金標(biāo)準(zhǔn),該方法主要通過將采集的血漿等臨床樣品接種細(xì)胞,培養(yǎng)7～9 d后用ALV p27抗原ELISA試劑盒進(jìn)行檢測(cè),該方法檢測(cè)周期長(zhǎng)且成本高[10-11]。此外,當(dāng)種雞場(chǎng)ALV流行率低時(shí),利用病毒分離法對(duì)雞逐一進(jìn)行檢測(cè),會(huì)造成耗材和人工的極大浪費(fèi)。核酸檢測(cè)法具有檢測(cè)周期短、特異性強(qiáng)、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)[12]。其中,實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法(quantitative real-time PCR)發(fā)展成熟,自動(dòng)化程度高,已被廣泛用于各類病原檢測(cè)工作中[13-14]。但在檢測(cè)大批量樣本時(shí),也存在成本偏高的缺點(diǎn)。

本研究結(jié)合核酸檢測(cè)技術(shù)和混樣檢測(cè)模式,建立了一套適用于ALV-J低流行率場(chǎng)景下的快速篩檢ALV-J感染雞的血液核酸篩查技術(shù)(ALV-J-B-qPCR),旨在加快種禽場(chǎng)外源性ALV的凈化進(jìn)程。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料

DF-1細(xì)胞、ALV-A GD13-1株、ALV-B CD08株、ALV-J SCAU-HN06株、ALV-K GDFX0601株、ALV-E HN1301株、馬立克病病毒(MDV)Md5株、禽流感病毒(AIV)G1-like株cDNA、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒(REV)SNV 株cDNA均由本實(shí)驗(yàn)室保存;雞抗凝血樣采集自廣東省3個(gè)正在進(jìn)行AL凈化的種雞場(chǎng);ALV p27抗原ELISA檢測(cè)試劑盒是哈爾濱國(guó)生生物科技股份有限公司產(chǎn)品;通用柱式基因組DNA提取試劑盒購自廣州攻逸生物科技有限公司;Hieff qPCR SYBR Green Master Mix購自翌圣生物科技(上海)股份有限公司。

1.2 引物序列

根據(jù)GenBank中ALV-Jpol及env基因序列,設(shè)計(jì)1對(duì)特異性檢測(cè)ALV-J的qPCR引物F1/R1,同時(shí)以引物H5/H7作為ALV-J的PCR檢測(cè)引物[28](表1)。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 本研究使用的引物

1.3 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的制備

以ALV-J SCAU-HN06株cDNA為模板,利用引物F1/R1對(duì)目的片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)程序:95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s,25個(gè)循環(huán);72 ℃ 8 min。膠回收目的條帶,連接至pMD-19T載體上,轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞,挑取單菌落,置于含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)后提取質(zhì)粒。將測(cè)序正確的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒命名為pMD19-T-J。

1.4 qPCR反應(yīng)條件的優(yōu)化及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

采用20 μL的反應(yīng)體系,分別對(duì)退火溫度(54、54.7、56.0、58.0、60、60.4、62.3、63.5、64 ℃)、引物終濃度(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 μmol·L-1)進(jìn)行優(yōu)化,得到最佳反應(yīng)條件。再以拷貝數(shù)為7.15×102～7.15×109copies·μL-1的10倍倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板進(jìn)行qPCR反應(yīng),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算其相關(guān)系數(shù)R2及其擴(kuò)增效率E。

1.5 qPCR的特異性、靈敏性和重復(fù)性試驗(yàn)

以ALV-A、ALV-B、ALV-K、ALV-E、REV、AIV、MDV等病毒的基因組DNA或cDNA為模板,以標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為陽性對(duì)照,去離子水為陰性對(duì)照,進(jìn)行qPCR反應(yīng),以分析所建立方法的特異性;以拷貝數(shù)為1×1010～1×100copies·μL-1的10倍倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板,分別進(jìn)行qPCR和普通PCR檢測(cè),比較兩種方法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的最低檢出限,以分析所建立方法的靈敏性;以1×104、1×105、1×106copies·μL-1的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板,進(jìn)行qPCR的批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)和批間重復(fù)性試驗(yàn)(批內(nèi)重復(fù):每個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒設(shè)置3個(gè)重復(fù)并同時(shí)擴(kuò)增;批間重復(fù):在不同時(shí)間段對(duì)以上試驗(yàn)進(jìn)行3次獨(dú)立的重復(fù)),并統(tǒng)計(jì)Ct值的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù),以分析所建立方法的重復(fù)性。

1.6 臨床樣本檢測(cè)

隨機(jī)抽取90份雞抗凝血,將離心的血漿接種DF-1細(xì)胞,維持培養(yǎng)9 d后收集細(xì)胞培養(yǎng)液,用p27抗原ELISA試劑盒進(jìn)行ALV檢測(cè),對(duì)陽性樣品的細(xì)胞沉淀用H5/H7引物進(jìn)行ALV-J特異性檢測(cè);提取上述90份細(xì)胞沉淀RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,以cDNA為模板,分別用建立的qPCR方法和普通PCR方法進(jìn)行ALV-J檢測(cè);分析比較以上3種方法的檢出率。

1.7 核酸篩查檢測(cè)模板的篩選

以15份經(jīng)病毒分離和亞群鑒定為ALV-J陽性的雞血液樣本和1份陰性雞血液樣本為材料(ALV陽性樣本為經(jīng)病毒分離后細(xì)胞培養(yǎng)上清ELISAS/P值高于0.2的樣本,反之為陰性樣本,下同),分別制備這16份樣本的抗凝血DNA、血細(xì)胞DNA、外周血淋巴細(xì)胞DNA、外周血淋巴細(xì)胞cDNA和血漿cDNA,進(jìn)行ALV-J特異性PCR檢測(cè),并綜合評(píng)估其檢測(cè)準(zhǔn)確度、操作復(fù)雜度和成本,選出最佳模板類型。

1.8 核酸篩查混樣方法的探索

選取22份經(jīng)病毒分離和亞群鑒定為ALV-J陽性的抗凝血樣本,提取其抗凝血DNA為模板,進(jìn)行qPCR檢測(cè),獲得血液原液檢測(cè)Ct值。同時(shí),將上述抗凝血樣本用于以下3種混樣方法的探索試驗(yàn)。

1.8.1 蒸餾水破裂紅細(xì)胞法提取混合血液DNA的混樣方法 雞紅細(xì)胞可在蒸餾水中破裂并釋放DNA,因此可用該方法粗提雞抗凝血DNA。以100 μL為ALV-J陽性抗凝血與蒸餾水混合的總體積,分別將占體積比為0.5%、1%、2%和4%的抗凝血與相應(yīng)體積的蒸餾水混合后劇烈震蕩,待紅細(xì)胞碎屑沉降后吸取1 μL上清作為模板,進(jìn)行qPCR檢測(cè)。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果確定最佳的血液-蒸餾水體積比并設(shè)計(jì)后續(xù)試驗(yàn)。

1.8.2 血液混樣總體積為200 μL的混樣方法 以200 μL作為混合總體積,分別將22份ALV-J陽性抗凝血按1∶2、1∶5、1∶8和1∶11體積比與陰性抗凝血充分震蕩混勻(即陽性血樣的3倍稀釋、6倍稀釋、9倍稀釋和12倍稀釋),再從中吸取10 μL混合血液,提取其DNA作為模板,進(jìn)行qPCR檢測(cè),分析不同混合比例對(duì)檢測(cè)準(zhǔn)確度的影響。

1.8.3 血液混樣總體積為10 μL的混樣方法 以10 μL作為混合總體積,分別將22份ALV-J陽性抗凝血按1∶2、1∶5、1∶8和1∶11體積比與陰性抗凝血充分震蕩混勻(即陽性血樣的3倍稀釋、6倍稀釋、9倍稀釋和12倍稀釋),提取其DNA作為模板,進(jìn)行qPCR檢測(cè),分析不同混合比例對(duì)檢測(cè)準(zhǔn)確度的影響。

1.9 ALV-J血液核酸篩查技術(shù)的建立

根據(jù)上述qPCR方法,確定的最佳檢測(cè)模板和最佳混樣方法,組合建立了ALV-J血液核酸篩查技術(shù),并命名為ALV-J-B-qPCR。

1.10 臨床ALV-J血液核酸篩查模擬試驗(yàn)

選取17份ALV-J陽性血樣和383份陰性血樣進(jìn)行隨機(jī)排列,模擬流行率為4%～5%的臨床檢測(cè)場(chǎng)景,以k=5的混樣規(guī)模分80個(gè)混合樣本組,提取DNA進(jìn)行第一輪qPCR檢測(cè),對(duì)檢測(cè)為反應(yīng)性的混合樣本組進(jìn)行第二輪單個(gè)樣品的DNA提取和qPCR檢測(cè);同樣,選取6份ALV-J陽性血樣和394份陰性血樣進(jìn)行隨機(jī)排列,以k=10的混樣規(guī)模,進(jìn)行預(yù)期流行率為1%～2%的臨床血液核酸篩查模擬試驗(yàn)。

1.11 統(tǒng)計(jì)分析方法

運(yùn)用Prism 9、SPSS 21.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析。P>0.05 表示差異不顯著,P<0.05表示差異顯著。*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001,ns.P>0.05。

2 結(jié) 果

2.1 qPCR標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

以ALV-J cDNA為模板,采用引物F1/R1進(jìn)行PCR擴(kuò)增,電泳結(jié)果顯示條帶大小約204 bp(圖1a),與預(yù)期大小一致。將目的片段連接至pMD19-T并轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞,挑取單克隆菌落并提取重組質(zhì)粒。測(cè)序結(jié)果顯示,標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pMD19-T-J構(gòu)建成功。

A. 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒PCR擴(kuò)增(M. DL2000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1～2.標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒;3.陰性對(duì)照);b.標(biāo)準(zhǔn)曲線a. Standard plasmid PCR amplification (M. DL2000 DNA marker; 1-2. Standard plasmid; 3. Negative control); b. Standard curve

2.2 qPCR反應(yīng)條件優(yōu)化和標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

qPCR反應(yīng)條件的優(yōu)化結(jié)果顯示,最佳退火溫度為58 ℃,最佳引物終濃度為0.2 μmol·L-1。最終確定20 μL qPCR反應(yīng)體系:上下游引物(10 μmol·L-1)各0.4 μL,qPCR預(yù)混液10 μL,DNA模板1 μL,去離子水8.2 μL;反應(yīng)程序:95 ℃ 5 min;95 ℃ 10 s、58 ℃ 30 s,39個(gè)循環(huán)。將拷貝數(shù)為7.15×109～7.15×102copies·μL-1共8個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進(jìn)行qPCR擴(kuò)增,并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果顯示,標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y= -3.329 8x+ 41.071,R2= 0.999 5,擴(kuò)增效率E=100%(圖1b)。

2.3 qPCR的靈敏性、特異性、重復(fù)性

結(jié)果顯示,所建立的qPCR方法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的最低檢測(cè)限為1×102copies·μL-1,而普通PCR的最低檢測(cè)限為1×103copies·μL-1(圖2),表明所建立的qPCR方法的靈敏性高于普通PCR,為普通PCR的10倍;分別以ALV-A、ALV-B、ALV-K、ALV-E、REV、AIV的cDNA和MDV 的DNA作為檢測(cè)模板,以ALV-J標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為陽性對(duì)照,去離子水為陰性對(duì)照,進(jìn)行qPCR擴(kuò)增,結(jié)果顯示,僅ALV-J標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒出現(xiàn)特異性擴(kuò)增,表明該方法的特異性良好(圖3);利用1×104、1×105和1×106copies·μL-13個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分別進(jìn)行批內(nèi)和批間的qPCR重復(fù)性試驗(yàn),結(jié)果顯示,批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)為0.122%～0.505%,批間重復(fù)性試驗(yàn)變異系數(shù)為0.279%～0.745%,兩組變異系數(shù)均小于1%,表明建立的qPCR方法具有良好的重復(fù)性(表2)。

圖3 qPCR特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Specificity test result of the qPCR

表2 qPCR重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

表3 1%～2%預(yù)期流行率下的ALV-J-B-qPCR法與病毒分離法的檢測(cè)結(jié)果

表4 4%～5%預(yù)期流行率下的ALV-J-B-qPCR法與病毒分離法的檢測(cè)結(jié)果

2.4 臨床樣品檢測(cè)

隨機(jī)抽取90份雞抗凝血,分離血漿并接種至DF-1細(xì)胞,培養(yǎng)9 d后通過ALV p27抗原ELISA共檢出11份陽性,陽性DF-1細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)PCR鑒定表明均存在ALV-J感染,表明p27 ELISA方法的ALV-J檢出率為12.2%(11/90);以上述90份DF-1細(xì)胞cDNA為模板,分別利用普通PCR和所建立的qPCR進(jìn)行ALV-J檢測(cè),結(jié)果顯示,普通PCR ALV-J檢出率為12.2%(11/90),qPCR的ALV-J檢出率為15.6%(14/90),且所有被p27 ELISA和普通PCR檢出的樣本,均可被qPCR方法檢出,表明所建立的qPCR方法比PCR方法和p27 ELISA方法靈敏性高。

2.5 核酸篩查模板篩選

結(jié)果顯示,5種檢測(cè)模板中,外周血淋巴細(xì)胞cDNA的ALV-J陽性檢出率為46.67%(7/15),血漿cDNA的ALV-J陽性檢出率為13.33%(2/15),抗凝血DNA、血細(xì)胞DNA和外周血淋巴細(xì)胞DNA 3種模板的ALV-J陽性檢出率為100%(15/15),其中,外周血淋巴細(xì)胞DNA需要從抗凝血中分離淋巴細(xì)胞,需額外購買試劑盒,成本高且操作復(fù)雜,而血細(xì)胞DNA的制備需要先離心抗凝血,比直接采用抗凝血操作復(fù)雜,因此選定檢測(cè)準(zhǔn)確度高、成本低、操作復(fù)雜度低要求的抗凝血DNA作為后續(xù)試驗(yàn)的檢測(cè)模板。

2.6 核酸篩查混樣方法的探索

2.6.1 蒸餾水破裂紅細(xì)胞法提取混合血液DNA的混樣方法 以22份ALV-J陽性的抗凝血為材料,分別將占體積比為0.5%、1%、2%和4%的抗凝血與相應(yīng)體積的蒸餾水混合并劇烈震蕩后吸取上清DNA進(jìn)行qPCR檢測(cè),結(jié)果顯示,血液占比為0.5%、1%、2%和4%的4個(gè)組的平均Ct值均介于31～32,且組間差異均不顯著(P>0.05)(圖4),顯著低于DNA試劑盒提取的原血樣組DNA的平均Ct值26.44,靈敏性差。

圖中未做顯著性標(biāo)記表示各組數(shù)據(jù)間的差異性均不顯著No significant marks were made in the figure, indicating that the differences between the groups of data were not significant

2.6.2 血液混樣總體積為200 μL的混樣方法 以200 μL作為混合總體積,分別將22份ALV-J陽性抗凝血與陰性抗凝血3、6、9和12倍稀釋后吸取10 μL,提取其DNA作為模板進(jìn)行qPCR檢測(cè),結(jié)果顯示,3、6、9和12倍稀釋組的平均Ct值分別為27.96、29.18、29.27和28.74,相比原血樣組的核酸檢測(cè)平均Ct值26.44分別增加了1.52、2.74和2.83、2.30,且單個(gè)樣本檢測(cè)結(jié)果均呈反應(yīng)性。其中,3倍稀釋組與原血樣組的平均Ct值無顯著差異(P>0.05),6、9和12倍稀釋組與原血樣組的Ct值差異均顯著(P<0.05)。值得注意的是,3、6、9和12倍稀釋組的平均Ct值隨著稀釋倍數(shù)的增加先上升后下降,12倍稀釋組的平均Ct值低于6和9倍稀釋組(圖5a)。

A. 總體積為200 μL的混樣方法;b. 總體積為10 μL的混樣方法。**.P<0.01,***.P<0.001,ns.P>0.05a. Scheme with a mixed samples volume of 200 μL; b. Scheme with a mixed samples volume of 10 μL. **.P<0.01, ***.P<0.001, ns.P>0.05

2.6.3 血液混樣總體積為10 μL的混樣方法 以10 μL作為混合總體積,分別將22份ALV-J陽性抗凝血與陰性抗凝血3、6、9和12倍稀釋后提取其總DNA進(jìn)行qPCR檢測(cè),結(jié)果顯示,3、6、9和12倍組的平均Ct值分別為27.98、29.13、29.71、29.85,相比原血樣組的核酸檢測(cè)平均Ct值26.44分別增加了1.54、2.69、2.73、3.41,但有1份血樣在12倍稀釋組中未出現(xiàn)反應(yīng)性。其中,3倍稀釋組與原血樣組的平均Ct值無顯著差異(P>0.05),6、9和12倍稀釋組與原血樣組的Ct值差異均顯著(P<0.05)(圖5b)。相對(duì)混樣總體積為200 μL的混樣方法,混樣總體積為10 μL的方法中3、6、9和12倍稀釋組的平均Ct值隨著稀釋倍數(shù)的增加逐漸升高,其結(jié)果更合理準(zhǔn)確,因此采納混樣總體積為10 μL(混樣規(guī)模<12)的混樣方法。

2.7 臨床ALV-J血液核酸篩查模擬試驗(yàn)

選取17份ALV-J陽性抗凝血和383份陰性抗凝血隨機(jī)排列,以模擬流行率為4%～5%的臨床檢測(cè)場(chǎng)景,以k=5的混樣規(guī)模分為80個(gè)混合樣本組,提取其抗凝血DNA進(jìn)行第一輪qPCR檢測(cè),結(jié)果顯示,共有20個(gè)混合樣本組呈反應(yīng)性。進(jìn)一步提取這20個(gè)混合樣本組對(duì)應(yīng)的100份抗凝血DNA進(jìn)行第二輪qPCR檢測(cè),共檢出25份反應(yīng)性樣本。ALV-J-B-qPCR總檢出率為6.25%,比病毒分離法高2%。兩輪qPCR共檢測(cè)樣本180份,僅占樣品總數(shù)的45%。同樣,選取6份ALV-J陽性抗凝血和394份陰性抗凝血進(jìn)行隨機(jī)排列,以模擬流行率為1%～2%的臨床檢測(cè)場(chǎng)景,以k=10的混樣規(guī)模分為40個(gè)混合樣本組,結(jié)果顯示,第一輪qPCR檢測(cè)共有8組混合樣本組呈反應(yīng)性,第二輪qPCR檢測(cè)共檢出9份反應(yīng)性樣本,ALV-J-B-qPCR總檢出率為2.25%,比病毒分離法高0.75%。兩輪qPCR共檢測(cè)樣本120份,僅占樣品總數(shù)的30%。

對(duì)2種預(yù)期流行率下ALV-J-B-qPCR和病毒分離法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行卡方檢驗(yàn)和Kappa一致性檢驗(yàn),結(jié)果顯示,在1%～2%、4%～5%預(yù)期流行率下,卡方檢驗(yàn)結(jié)果的χ2值分別為0.611、1.608,并且P值均大于0.05,說明2種方法差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;Kappa一致性檢驗(yàn)結(jié)果的Kappa值分別為0.796、0.799,并且P值均小于0.05,說明2種方法具有顯著的一致性,且結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3、4)。

以上結(jié)果表明,ALV-J-B-qPCR具有良好的可行性。

3 討 論

目前的混樣核酸檢測(cè)策略,都會(huì)不可避免地稀釋病毒核酸,當(dāng)病毒核酸低于檢測(cè)限時(shí),就會(huì)發(fā)生漏檢。因此,應(yīng)合理設(shè)置混樣規(guī)模,盡量減少假陰性風(fēng)險(xiǎn)。此外,還要合理選擇混樣類型和靈敏的檢測(cè)方法,以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性[29-30]。新型冠狀病毒流行期間,檢測(cè)工作中通過多樣本混檢,可大大提高特定區(qū)域內(nèi)大規(guī)模人群篩查和控制COVID-19疫情的能力[31]。孫微超等[32]評(píng)價(jià)了6混樣和48混樣在血液篩查工作中的適用性,發(fā)現(xiàn)兩種混樣方法的檢測(cè)結(jié)果具備良好的一致性,48混樣可大幅提高檢測(cè)效率,但漏檢風(fēng)險(xiǎn)略高。

隨著國(guó)家對(duì)家禽種業(yè)重視程度的提高,我國(guó)許多規(guī)模化種禽場(chǎng)紛紛加大對(duì)外源性ALV的凈化力度,其外源性ALV流行率已降至較低水平,此時(shí)使用病毒分離法逐個(gè)檢測(cè)和淘汰陽性雞,檢測(cè)樣本量大而淘汰病雞數(shù)量少,且同時(shí)具有檢測(cè)周期長(zhǎng)的不足[33]。此外,病毒分離法所需的ELISA檢測(cè)試劑盒價(jià)格昂貴,會(huì)增加凈化成本。以qPCR為代表的核酸檢測(cè)方法能大幅度縮短檢測(cè)周期,其高靈敏性也能保障檢測(cè)的準(zhǔn)確性。同時(shí),凈化后期的雞群ALV流行率低,符合混樣檢測(cè)的應(yīng)用場(chǎng)景,可大幅減少檢測(cè)數(shù)量,達(dá)到節(jié)約成本的目的。因此,本研究首次嘗試建立針對(duì)ALV-J的血液核酸篩查方法。

本研究首先建立了ALV-J SYBR Green Ⅰ熒光定量檢測(cè)方法。結(jié)果表明,該方法具有良好的靈敏性、特異性和重復(fù)性,可作為后續(xù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)。

適宜的檢測(cè)模板對(duì)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性具有重要影響[34]。在檢測(cè)模板的選擇中,本研究對(duì)5種檢測(cè)模板進(jìn)行評(píng)估,發(fā)現(xiàn)抗凝血DNA最符合準(zhǔn)確度高,操作復(fù)雜度低、成本低的要求,因此以雞抗凝血DNA為最終的檢測(cè)模板。

在混樣方法的探索中,蒸餾水破裂雞紅細(xì)胞法提取的DNA模板用于核酸檢測(cè)的靈敏性差,因此不予采用。在混樣總體積為200 μL的混樣方法中,出現(xiàn)了陽性樣本稀釋倍數(shù)增加但平均Ct值反而降低的情況,分析原因,可能是由于抗凝血質(zhì)地不均一,多個(gè)血樣難以完全混勻,或混合血液產(chǎn)生凝集反應(yīng),造成血液性質(zhì)改變[35],導(dǎo)致用于提取核酸的10 μL混合血樣不能代表組內(nèi)的平均水平。相比之下,混樣總體積為10 μL的混樣方法中,隨稀釋倍數(shù)的增加,核酸檢測(cè)的平均Ct也逐漸增加,更合理準(zhǔn)確,因此采用混合總體積為10 μL的混樣方法,但該方法在12倍稀釋組中有1例ALV-J樣本未檢出反應(yīng)性,因此實(shí)際應(yīng)用中應(yīng)盡量將混樣規(guī)模控制在12以下。

在2種預(yù)期流行率的臨床篩查模擬試驗(yàn)中,ALV-J-B-qPCR的檢出率均比病毒分離法高,且被病毒分離法檢出的樣本均可被ALV-J-B-qPCR檢出,說明ALV-J-B-qPCR靈敏性更高。此外,預(yù)期流行率為1%～2%的模擬試驗(yàn)的總檢測(cè)量較預(yù)期流行率為4%～5%的模擬試驗(yàn)更少,可印證本方法更適合流行率低的應(yīng)用場(chǎng)景。Kappa檢驗(yàn)可評(píng)估兩種檢測(cè)方法的一致性,卡方檢驗(yàn)重在評(píng)估兩種方法之間的差異性[36]。通過卡方檢驗(yàn)和Kappa檢驗(yàn)評(píng)估ALV-J-B-qPCR和病毒分離法的檢測(cè)差異性和一致性,結(jié)果表明2種方法具有顯著的一致性。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)合qPCR方法和混樣檢測(cè)模式,首次建立了ALV-J血液核酸篩查技術(shù)。該技術(shù)存在以下幾點(diǎn)優(yōu)勢(shì):無需病毒分離過程,可大幅縮短檢測(cè)周期;避免使用價(jià)格昂貴的ELISA檢測(cè)試劑盒,且能大幅降低檢測(cè)總量,節(jié)約成本;靈敏性高,有利于在大規(guī)模雞群中精準(zhǔn)篩檢出ALV-J感染雞。該技術(shù)尤其適用于低ALV-J流行率場(chǎng)景下雞群的快速篩檢,為規(guī)模化種雞場(chǎng)加快ALV凈化進(jìn)程提供了新的思路和方法。