H3亞型禽流感病毒熒光定量RT-PCR檢測方法的建立與應用

毛秋艷,周淑寧,劉 朔,彭 程,尹 馨,張雅馨,周婉婷,李金平,侯廣宇,蔣文明*,宋厚輝*,劉華雷,*

(1.浙江農林大學動物科技學院·動物醫學院,杭州 311300;2.青島農業大學動物醫學院,青島 266109;3.中國動物衛生與流行病學中心,青島 266032;4.內蒙古農業大學獸醫學院,呼和浩特 010018)

禽流感(avian influenza,AI)是由禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)引起的一種禽類烈性傳染病,主要感染野生鳥類和家禽,偶爾也會傳播給人類等哺乳動物宿主[1-2]。AIV屬于正黏病毒科、甲型流感病毒屬成員,核酸類型為單股負鏈分節段的RNA,病毒基因組內含8條片段,編碼10種病毒必需蛋白和一些輔助蛋白[3-4]。目前已知AIV可依據表面蛋白血凝素(hemagglutinin,HA)和神經氨酸酶(neuraminidase,NA)抗原性的不同劃分為16種HA亞型和9種NA亞型[5],此外在蝙蝠上有H17N10、H18N11亞型流感病毒的報道[6]。由于各亞型病毒對宿主的致病力不盡相同,又可將AIV分為兩類:高致病性禽流感病毒(highly pathogenic avian influenza virus, HPAIV)和低致病性禽流感病毒(low pathogenic avian influenza virus, LPAIV)[7],其中H3亞型AIV是野生鳥類和家禽中最常見的LPAIV之一[8],它可以長期存在于家禽體內而不易被發現,因常導致呼吸道癥狀、蛋雞產蛋率下降等問題而嚴重影響著我國養禽業的發展[9]。與此同時,該亞型毒株能與其他亞型AIV發生基因重排使得其致病性發生改變,進而增加了病毒突破物種傳播至人類的風險[10-11],對人類公共衛生構成極大的威脅。自2022年相繼出現兩起H3亞型AIV感染人類事件以來[12-13],世界衛生組織(WHO)于2023年4月再次報道了中國第三例人感染H3N8亞型AIV確診病例,患者因出現急性呼吸道感染而死亡[14],這一事件使得人們對禽流感存在的大流行潛力而感到擔憂。雖然當前流行的新型H3亞型AIV尚未獲得在人際間持續傳播的能力[15],但病毒不斷重組進化的特性可能會導致其在禽類與哺乳動物間的傳播特性發生改變[16],因此需要高度重視這些新型的禽流感病毒株對家禽養殖業和人類健康所帶來的風險和挑戰,強調了當前行之有效的檢測方法對病毒監測的重要性,以此達到預防控制禽流感疫病暴發和降低大流行發生風險的目的。

目前實驗室針對禽流感的檢測主要有以下3種方法:病毒分離與鑒定、病毒核酸檢測和血清學試驗[17-18],其中病毒核酸檢測中的熒光定量RT-PCR方法因具有省時特異、高效靈敏、自動化程度高等特點而被廣泛推薦應用于臨床檢測和監測工作中。本研究以近期在中國流行的H3亞型AIV的HA基因作為靶序列,設計一對特異性引物和熒光標記探針,建立一種針對H3亞型AIV的熒光定量RT-PCR檢測方法,為H3亞型AIV的臨床診斷及常規監測提供快速可靠的技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒株 A/Californa/04/2009(H1N1)、A/duck/Guangdong/G2037/2022(H3N2)、A/chicken/Jiangsu/NT0322/2023(H3N3)(簡稱CK/JS/NT0322/23)、A/duck/Hunan/K1354/2022(H3N6)、A/chicken/Jiangxi/P1027/2023(H3N8)、A/duck/Auhui/AG61/2011(H4N6)、A/duck/Anhui/A1105/2023(H5N1)、A/duck/Hunan/K1212/2022(H5N6)、A/duck/Guangdong/G1392/2022(H5N8)、A/duck/Guangdong/G1231/2022(H6N6)、A/chicken/Hebei/LF0317/2023(H7N9)、A/chicken/Yunnan/KM0224/2023(H9N2)、A/chicken/Jiangsu/J1284/2022(H10N3)病毒株均由中國動物衛生與流行病學中心國家禽流感專業實驗室保存;新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)LaSota株、傳染性支氣管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)、傳染性法氏囊病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)、禽腺病毒(fowl adenovirus,FADV)及鵝細小病毒(goose parvovirus,GPV)均由本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑及實驗動物 試劑:病毒DNA/RNA提取試劑盒購自濟凡生物科技(常州)有限公司;HiScript?High Fidelity One Step RT-PCR Kit和HiScript?II U+One Step qRT-PCR Probe Kit購自南京諾唯贊生物科技有限公司;DNA凝膠回收試劑盒購自湖南艾科瑞生物工程有限公司;pEASY-T5試劑盒、Trans1-T1感受態細胞和質粒提取試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司;限制性內切酶,購自NEB(北京)有限公司;DNase I 消化酶和T7體外轉錄試劑盒購自翌圣生物科技(上海)股份有限公司;RNeasy?Mini Kit購自QIAGEN公司。

實驗動物:10日齡SPF雞胚購自購自濟南斯帕法斯家禽有限公司;6周齡SPF雞購自北京梅里亞維通實驗動物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物和TaqMan探針的設計與合成 根據GenBank數據庫中公開的H3亞型AIV毒株的HA基因序列,利用DNAStar軟件進行同源性分析保守區域,通過Primer5.0軟件設計特異性引物和TaqMan探針,經BLAST驗證引物和探針與相對應的靶基因匹配性較好,引物和探針均由武漢賽維爾生物科技有限公司合成。同時設計一對常規RT-PCR擴增引物(H3-504F/H3-504R),由北京睿博興科生物技術有限公司合成,具體信息見表1。

表1 引物和TaqMan探針序列

1.2.2 病毒核酸的提取 參照病毒DNA/RNA提取試劑盒說明書抽提各亞型AIV、NDV、IBV、IBDV、FADV和GPV的病毒核酸;同時將H3N3亞型AIV病毒株CK/JS/NT0322/23(108.83EID50·0.1 mL-1)由106EID50·0.1 mL-110倍倍比稀釋至100EID50·0.1 mL-1,并提取各梯度核酸產物,然后置于-80 ℃保存備用。

1.2.3 cRNA陽性標準品的制備 使用HA基因全長通用引物對H3亞型AIV的HA基因進行RT-PCR擴增,產物經DNA凝膠回收試劑盒回收純化后,將其連接到pEASY-T5載體上,然后再轉化至Trans1-T1感受態細胞中。挑取單菌落后進行菌液PCR擴增,利用10 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳驗證目的片段是否連接成功,隨后按照質粒提取試劑盒說明書提取疑似陽性質粒,送至青島睿博興科生物技術有限公司進行序列測定,陽性質粒命名為pEASY-AIV-H3。通過限制性內切酶將pEASY-AIV-H3進行線性化,使用T7體外轉錄試劑盒對線性化質粒進行體外轉錄,待反應結束后,向產物中加入1 μL DNase I消化酶并混勻,37 ℃孵育15 min,以除去體系中的模板DNA;再加入2 μL 0.5 mol·L-1EDTA(pH=8.0),65 ℃孵育10 min終止反應。使用RNeasy?Mini Kit再次純化體外轉錄產物,最終得到含有H3亞型AIVHA基因的cRNA陽性標準品。然后利用全波長酶標儀測定cRNA標準品的濃度和純度,依據下列公式計算得出陽性標準品的拷貝數為1.27×1012copies·μL-1,用作下一步建立熒光定量RT-PCR的模板置于-80 ℃冰箱中保存備用。拷貝數(copies·μL-1)=[6.02×1023×樣品濃度(ng·μL-1)×10-9]/(RNA length×340)。

1.2.4 反應條件的優化 使用RNase-Free ddH2O先將上述pEASY-AIV-H3陽性標準品的濃度稀釋至1.0×1012copies·μL-1,再進行10倍倍比稀釋,以拷貝數濃度為1.0×108copies·μL-1的標準品為模板,采用HiScript?II U+One Step qRT-PCR Probe Kit說明書中推薦的擴增體系,對體系中的引物濃度(2、4、6、8、10 pmol·μL-1)和探針濃度(1、2、3、4、5、10 pmol·μL-1)配比、模板量(2、3 μL)、退火溫度(55、58、60 ℃)及延伸時間(30、45 s)等擴增條件進行優化,以確定最適反應條件。

1.2.5 標準曲線的建立 選取1.0×108～1.0×100copies·μL-1的cRNA陽性標準品和106～100EID50·0.1 mL-1的病毒核酸標準品作為繪制標準曲線的模板,體系配制完成后采用優化好的反應條件在熒光定量PCR儀上擴增,同一梯度的樣品進行三次平行重復,然后統計檢測結果并使用Excel軟件繪制相應的標準曲線。

1.2.6 特異性試驗 以H1、H3N2、H3N3、H3N6、H3N8、H4、H5、H6、H7、H9、H10亞型AIV及NDV、IBV、IBDV、FADV、GPV的核酸作為模板,RNase-Free ddH2O作為陰性對照,驗證建立的H3亞型AIV熒光定量RT-PCR檢測方法的特異性。

1.2.7 靈敏性試驗 將10倍梯度稀釋的cRNA標準品和病毒核酸標準品作為擴增模板,制備cRNA陽性標準品的空載體質粒和RNase-Free ddH2O為陰性對照,分別采用該檢測方法和常規RT-PCR檢測方法對這兩種標準品模板進行擴增,以檢測到S型曲線或目的條帶的標準品最低濃度為依據,對兩種檢測方法進行比較。常規RT-PCR反應程序:50 ℃反轉錄30 min;94 ℃預變性3 min;94 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸45 s,共35個循環;最后72 ℃ 孵育5 min。PCR產物使用10 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.9 動物攻毒試驗樣品檢測 分別將含有106EID50·0.1 mL-1的H3亞型AIV毒株(CK/JS/NT0322/23)病毒懸液、0.01 mol·L-1PBS溶液滴鼻接種于6周齡SPF雞,每組3只,接種劑量均為0.1 mL·只-1。在攻毒的第3天剖殺所有雞并采集肺、氣管喉頭、盲腸、脾、腎、胰腺、腦、法氏囊、心、肝及胸腺等11種臟器,共計33份攻毒組樣品和33份對照組樣品。將組織樣品經研磨勻漿、離心處理后,取0.1 mL上清液接種至10日齡SPF雞胚,48 h后收獲雞胚尿囊液并進行血凝試驗。同時使用病毒DNA/RNA提取試劑盒提取每份組織樣品的核酸,再分別使用H3亞型AIV熒光定量RT-PCR、常規RT-PCR方法對上述66份樣品進行檢測,最后將兩者的檢測結果與病毒分離鑒定結果進行比較并計算相應的符合率。

1.2.10 臨床樣品檢測 隨機挑選96份2023年本實驗室保存的從活禽市場中采集到的口咽部和泄殖腔拭子,提取拭子樣品的RNA,應用本研究建立的熒光RT-PCR方法進行檢測。同時采用雞胚培養法分離病毒,利用血凝試驗驗證并收集陽性雞胚的尿囊液,進一步抽提病毒核酸后擴增HA和NA基因片段,通過測序確定病毒亞型,比較該方法的準確性。

2 結 果

2.1 熒光定量RT-PCR反應條件的優化

通過對引物探針濃度配比、模板量、退火溫度及延伸時間的摸索和優化,最終確定本研究建立的熒光定量RT-PCR的反應體系為:2×One Step U+Mix 10.0 μL,Enzyme Mix 1.0 μL,H3-F(10 pmol·μL-1)0.4 μL,H3-R(10 pmol·μL-1)0.4 μL,H3-P(10 pmol·μL-1)0.2 μL,模板RNA 2.0 μL,最后用RNase-Free ddH2O補足至20.0 μL。反應程序:50 ℃逆轉錄15 min;95 ℃預變性30 s;95 ℃變性10 s,60 ℃延伸30 s,共40個循環。

2.2 標準曲線的建立

以10倍梯度稀釋的cRNA陽性標準品(1.0×108～1.0×100copies·μL-1)和病毒核酸標準品(106～100EID50·0.1 mL-1)為模板,通過熒光定量RT-PCR進行擴增,每個梯度重復3次,結果如圖1所示。使用cRNA標準品為模板時,本方法的標準曲線線性方程為y=-3.189 6x+ 41.555,擴增效率為105.83%,相關系數R2=0.998 2>0.99;使用病毒核酸標準品為模板時,本方法的標準曲線線性方程為y=-3.443 3x+ 41.025,擴增效率為95.17%,相關系數R2=0.999 5>0.99,說明這兩種標準品的Ct值與濃度之間均存在著良好的線性關系。

A.以cRNA陽性標準品為模板的標準曲線;B.以病毒核酸標準品為模板的標準曲線A. The standard curve of using cRNA positive standard as template; B. The standard curve of using viral nucleic acid standard as template

2.3 特異性試驗

特異性結果顯示,只有H3亞型AIV能在FAM熒光通道中出現典型的S型擴增曲線(圖2),而其他亞型AIV、NDV、IBV、IBDV、FADV及GPV的檢測結果均為陰性,表明本研究建立的檢測方法特異性良好。

1. H3N3 AIV;2. H3N8 AIV;3. H3N2 AIV;4. H3N6 AIV;5～13. H1、H4、H5N1、H5N6、H5N8、H6、H7、H9、H10 AIV; 14～19.NDV、IBV、IBDV、FADV、GPV、陰性對照1. H3N3 AIV; 2. H3N8 AIV; 3. H3N2 AIV; 4. H3N6 AIV; 5-13. H1, H4, H5N1, H5N6, H5N8, H6, H7, H9, H10 AIV; 14-19. NDV, IBV, IBDV, FADV, GPV, and Negative control

2.4 靈敏性試驗

將拷貝數濃度為1.0×108～1.0×100copies·μL-1的cRNA標準品及病毒滴度為106～100EID50·0.1 mL-1的核酸標準品分別利用熒光定量RT-PCR和常規RT-PCR進行檢測,試驗結果顯示,H3亞型AIV熒光定量RT-PCR檢測方法可檢測到的最低拷貝數濃度為1.0×102copies·μL-1(圖3A),最低病毒滴度為102EID50·0.1 mL-1(圖4A);而常規RT-PCR的最低拷貝數濃度和病毒滴度分別為1.0×103copies·μL-1和103EID50·0.1 mL-1(圖3B、圖4B),可見該方法的靈敏度是常規RT-PCR的10倍。

M. DNA相對分子質量標準;1～9. 1.0×108～1.0×100 copies·μL-1;10. 陰性對照;11.空載體質粒M. DNA marker; 1-9. 1.0×108-1.0×100 copies·μL-1; 10. Negative control; 11. Empty vector

M. DNA相對分子質量標準;1～7. 106 ～100 EID50·0.1 mL-1;8. 陰性對照M. DNA marker; 1-7. 106 -100 EID50·0.1 mL-1; 8. Negative control

2.5 重復性試驗

選取1.0×107、1.0×105和1.0×103copies·μL-1的cRNA標準品和106、104、102EID50·0.1 mL-1的病毒核酸分別進行組內和組間重復性試驗,組內重復性結果顯示(圖5),兩種標準品不同濃度模板的3次平行反應在FAM熒光通道下的擴增曲線均具有幾乎相同的擴增趨勢。經計算可得兩者的組內和組間Ct值變異系數均小于1.5%(表2),表明本研究建立的熒光定量RT-PCR檢測方法具有較好的重復性。

A. cRNA陽性標準品(1. 1.0×107 copies·μL-1;2. 1.0×105 copies·μL-1;3. 1.0×103 copies·μL-1;4. 陰性對照);B. 病毒核酸標準品(1. 106 EID50·0.1 mL-1;2. 104 EID50·0.1 mL-1;3. 102 EID50·0.1 mL-1;4. 陰性對照)A. cRNA positive standard (1. 1.0×107 copies·μL-1; 2. 1.0×105 copies·μL-1; 3. 1.0×103 copies·μL-1; 4. Negative control); B. Viral nucleic acid standard (1. 106 EID50·0.1 mL-1; 2. 104 EID50·0.1 mL-1; 3. 102 EID50·0.1 mL-1; 4. Negative control)

表2 熒光定量RT-PCR重復性試驗結果

2.6 動物攻毒試驗樣品檢測

對采集到的66份動物攻毒試驗組織樣品分別利用病毒分離鑒定、本研究建立的熒光定量RT-PCR和常規RT-PCR檢測方法進行檢測,結果(表3)顯示熒光定量RT-PCR和病毒分離鑒定的樣品陽性率均為36.36%(24/66),常規RT-PCR的陽性率為31.82%(21/66)。該檢測方法與病毒分離鑒定結果的符合率為100%,與常規RT-PCR的符合率為87.50%;而常規RT-PCR與病毒分離方法的符合率為84.00%,本方法相較于常規RT-PCR而言,其檢出率和靈敏性更高,適用于臨床檢測。

表3 動物攻毒試驗樣品檢測結果

2.7 臨床樣品檢測

利用所建立的檢測方法對2023年采集的96份臨床樣品進行檢測,結果(表4)顯示,檢出的H3亞型AIV陽性樣品數為4份,陽性率為4.17%,與病毒分離鑒定結果一致。

表4 臨床樣品檢測結果

3 討 論

禽流感不僅是嚴重危害家禽養殖業的傳染性疾病,也是一種重要的人畜共患病。自2000年以來,H3亞型AIV一直在我國的家禽和野生鳥類中持續傳播,尤其是在中國南方的家鴨中普遍存在,是水禽中最為流行的AIV亞型之一[19-20]。與此同時,該亞型宿主廣泛,除了感染家禽和野生鳥類之外,還可傳播至多種哺乳動物,如豬、馬、犬、貓、海豹及人類等[21]。我國在家禽中檢測到了多種H3 AIV的NA組合,包括了H3N1、H3N2、H3N3、H3N6、H3N7和H3N8[22],其中以H3N2和H3N8亞型的檢出率最高[23]。雖然H3亞型AIV是LPAIV,通常只引起輕微的呼吸道癥狀或無癥狀感染[24],死亡率較低,但由于病毒之間存在著頻繁的基因突變和重組現象,導致了近兩年H3亞型AIV新型重組體的出現[25-26],這些新型毒株不僅增加了對雞的致病性,還對人類健康構成了潛在的威脅。孫洪磊等[27]的研究結果表明,一種新型三源重排H3N8亞型AIV在我國多個省份的雞群中流行,呈現出高度適應的表現,引起雞群臨床發病,且具有感染人類的風險。2022年以來,新型H3N8 AIV已在河南、湖南、廣東引起3起人感染病例[14,28]。同時,水禽和陸生禽類界面復雜的流行病學和生態學可能促進了新型H3亞型重組病毒株在雞群中的出現[19,23]。因此,加強對國內家禽和野鳥中H3亞型AIV的快速診斷和監測必不可少,將有助于疾病的早期預警。

當前對于H3亞型AIV的診斷方法較多,其中以病毒分離鑒定和常規PCR檢測在臨床實際中運用最為廣泛,同時也存在一些不可避免的缺點,如耗費時間長、操作繁瑣、自動化程度低、檢出率不高等。為解決此類問題在臨床樣品檢測中所帶來的困擾,一種具備高度特異、靈敏特點的熒光定量RT-PCR檢測方法應運而生,該方法現多運用于人源、豬源、馬源的H3毒株的檢測[29-31],而適用于我國禽源H3亞型AIV的檢測應用較少。為此本研究設計了一對特異性引物和相應的TapMan探針,通過優化反應條件,開發了一種用于檢測H3亞型AIV的熒光定量RT-PCR方法。該方法可特異性檢測H3亞型禽流感病毒株,與其他病毒之間無交叉反應性;最低拷貝數濃度和病毒滴度檢測線分別為1.0×102copies·μL-1和102EID50·0.1 mL-1,靈敏度是常規RT-PCR的10倍;組內和組間的變異系數均小于1.5%,以上結果說明本研究建立的檢測方法具有良好的特異性、靈敏性和重復性。應用此方法對采集到的動物攻毒試驗組織樣品進行檢測,并與病毒分離鑒定和常規RT-PCR相比較,結果表明,熒光定量RT-PCR的結果與病毒分離鑒定一致,符合率為100%,而陽性檢出率要高于常規RT-PCR,兩者的符合率為87.50%。因此該方法更靈敏,檢測效率更高,同時可實現大量樣品的快速檢測,節省大量的時間,能夠滿足臨床快速診斷的實際需求。從動物攻毒試驗樣品檢測結果可以看出,本研究選取的試驗毒株具有較廣的組織嗜性,可在多個臟器中復制,對雞的損傷較大。以往的研究表明之前流行的H3亞型AIV主要存在于水禽中,而當前一些研究顯示現階段流行的毒株在雞群中的比例有所上升[22],且基因片段逐漸復雜多樣化,極大地增加了病毒感染哺乳動物或“溢出性”感染人類的風險[32-33],為此高效靈敏快捷的檢測手段對H3亞型AIV的早期預警和預防控制具有重要意義。

4 結 論

本研究建立了一種針對H3亞型AIV的熒光檢測方法,具有良好的特異性、靈敏性和重復性,同時可實現大量樣品的快速檢測,為禽流感流行病學調查和常規監測及防控提供一定的技術支撐。