穩定表達PRRSV M蛋白的MARC-145ORF6細胞系的構建及其對PRRSV增殖的影響

荊 揚,王玉淼,李 洋,常 輝,馬志倩,李志偉,肖書奇*

(1.中國農業科學院蘭州獸醫研究所 蘭州大學動物醫學與生物安全學院 動物疫病防控全國重點實驗室,蘭州 730046;2.西北農林科技大學動物醫學院,楊凌 712100;3.塔里木大學動物科學與技術學院,阿拉爾 843300)

由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)感染所致的豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是除非洲豬瘟(African swine fever, ASF)外最重要的豬病毒性傳染病之一[1]。PRRSV是套式病毒目(Nidovirales),動脈炎病毒科(Arterivirus),動脈炎病毒屬(Arteriviridaefamily)的有包膜的單股正鏈RNA病毒[2]。根據基因組差異可將PRRSV分為基因Ⅰ型(歐洲型)和基因Ⅱ型(美洲型),我國主要流行基因Ⅱ型PRRSV[3]。PRRSV基因組長度約為15 000個核苷酸(nt),由5’端甲基化帽子結構、重疊的開放性閱讀框(open reading frame, ORF)和3′端多聚腺苷酸(Poly A)尾巴組成[4],編碼16種非結構蛋白和8種結構蛋白[5]。

PRRSV基質蛋白(membrane protein, M protein)是由ORF6基因編碼的非糖基化Ⅲ類膜蛋白,相對分子質量為18～19 ku[6]。Ⅰ型PRRSV和Ⅱ型PRRSV的M蛋白分別由173和174個氨基酸殘基組成,包含一個由16個氨基酸殘基組成的短N末端外結構域、三個跨膜結構域和一個由84個氨基酸殘基組成的C末端內結構域[7]。非糖基化M蛋白的氨基酸序列在PRRSV中保守性最高[8],其在歐洲型和美洲型毒株間的相似性為75.2%～81.6%[7]。M蛋白是PRRSV的主要結構蛋白,M蛋白可與PRRSV GP5蛋白通過二硫鍵形成異源二聚體,在PRRSV侵入宿主完成病毒組裝后出芽的過程中發揮重要的作用[9]。PRRSV進入細胞首先通過其M蛋白與硫酸乙酰肝素蛋白聚糖結合,隨后PRRSV GP5蛋白被唾液黏附素(CD169)識別,促使病毒吸附在細胞上[10]。PRRSV M蛋白免疫原性較強[11],其抗原表位也被表征[6,12-13]。

有研究發現刪除M蛋白后不能產生具有感染性的PRRSV病毒粒子[14],這表明M蛋白對于PRRSV完成生命周期發揮不可或缺的作用。深入探究M蛋白的生物學功能對于解析PRRSV致病機制,開發有效的PRRS防控產品等具有重要意義。體外高效表達M蛋白是探究M蛋白功能的重要手段,然而利用真核瞬時轉染方式表達M蛋白成功率較低且表達量不高,限制了對M蛋白生物學功能的進一步探究。因此,本研究利用慢病毒包裝系統成功構建了穩定表達PRRSV M蛋白的MARC-145ORF6細胞系,評估了過表達M蛋白對細胞系Ⅰ型干擾素相關基因的影響,進一步探究了其對PRRSV復制的影響,以期為進一步研究M蛋白的生物學功能提供重要的生物材料和研究基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞、質粒和病毒

非洲綠猴胚胎腎細胞(MARC-145)和人胚胎腎細胞(HEK293T)由本實驗室保存;MARC-145Flag細胞系為本實驗室前期通過慢病毒包裝系統構建(Flag標簽沉默,利用嘌呤霉素抗性基因篩選獲得);慢病毒表達載體Lenti-CMV-Puro-Flag、包裝質粒psPAX2和包膜質粒pMD2G均由本實驗室保存;PRRSV SD-YL1712毒株(MT708500.1)和仙臺病毒(Sendai virus, SeV)均由本實驗室保存;PRRSV SD-YL1712毒株全基因組感染性克隆質粒[15]由本實驗室構建并保存。

1.2 主要材料和試劑

PrimeSTAR? GXL DNA Polymerase和限制性核酸內切酶購自寶日醫生物技術(北京)有限公司;ClonExpress II One Step Cloning Kit購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司;DMEM高糖培養基、Opti-MEM培養基、聚乙烯亞胺轉染試劑(PEI)、TRIzolTMReagent和Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP購自賽默飛世爾科技公司;TransSerum? FQ Fetal Bovine Serum(FBS)購自北京全式金生物技術有限公司;Flag tag Mouse Monoclonal Antibody購自安諾倫(北京)生物科技有限公司;Fluorescein (FITC)-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)購自Jackson ImmunoResearch公司;亞細胞結構蛋白提取試劑盒購自生工股份有限公司;CCK-8購自Abmole公司。

1.3 引物設計和合成

根據PRRSV SD-YL1712全基因組感染性克隆質粒設計ORF6的特異性擴增引物(ORF6-F和ORF6-R)及鑒定引物(JD-ORF6-F和JD-ORF6-R)。內參基因actin、Ⅰ型干擾素及其調節基因的特異性擴增引物均由北京擎科生物科技股份有限公司西安分公司合成,如表1所示。

表1 引物序列

1.4 重組慢病毒質粒Lenti-CMV-Puro-Flag-ORF6的構建

以PRRSV SD-YL1712全基因組感染性克隆質粒為模板,使用表1中擴增引物ORF6-F和ORF6-R擴增ORF6基因片段。將慢病毒表達載體Lenti-CMV-Puro-Flag用限制性內切酶NheⅠ和XhoⅠ線性化。目的片段和酶切載體經同源重組酶連接,連接產物轉化到DH5α感受態細胞,之后將其涂布至含有氨芐抗性的LB固體平板培養基,挑取單克隆菌落進行PCR鑒定。將鑒定正確的陽性菌液送至北京擎科生物科技股份有限公司西安分公司進行測序。測序正確的菌液擴大培養,保菌并提取質粒,獲得重組慢病毒質粒Lenti-CMV-Puro-Flag-ORF6,置于-20 ℃保存。

1.5 重組慢病毒質粒Lenti-CMV-Puro-Flag-ORF6的包裝

將生長狀態良好的HEK293T細胞均勻鋪到6孔細胞培養板中,待細胞單層密度達到70%～80%,按照PEI轉染試劑說明書,將重組慢病毒質粒Lenti-CMV-Puro-Flag-ORF6與輔助質粒psPAX2和pMD2G按1 μg:1 μg:0.5 μg的比例共轉染至HEK293T細胞中,轉染12 h后更換維持液,繼續培養48 h后收集細胞上清,過濾后分裝,保存于-80 ℃。

1.6 慢病毒轉導及篩選表達M蛋白的MARC-145ORF6細胞系

將生長狀態良好的MARC-145細胞均勻鋪到6孔細胞培養板中,待細胞單層密度達到70%～80%,棄去六孔板中的培養基,加入1 mL重組慢病毒感染液,繼續培養,同時設置不轉接慢病毒感染液的陰性對照組。慢病毒感染4 h后棄去感染液,更換維持液。96 h后,將培養基更換成預篩選好的含有效濃度嘌呤霉素的細胞生長液以進行篩選;待陰性對照組細胞完全死亡終止篩選,此時獲得初篩陽性細胞。將初篩陽性細胞按約1個細胞·孔-1鋪到96孔細胞板中,用含有效嘌呤霉素的生長液培養14 d,選取96孔細胞板中生長狀態良好的細胞進行擴繁。按照上述方法對擴繁的細胞再進行兩次亞克隆純化篩選并擴大培養,收集細胞樣品提取總RNA,反轉錄成cDNA,利用表1引物JD-ORF6-F/R進行鑒定。

1.7 細胞活力和生長曲線測定

按照CCK8試劑盒說明書測定細胞增殖活力。將MARC-145ORF6細胞系、MARC-145Flag細胞系和MARC-145細胞每孔104個細胞均勻鋪至96孔板中,于12、24、36、48和60 h在每孔中加入10 μL CCK8溶液并于37 ℃的5% CO2培養箱反應2 h,使用酶標儀在450 nm波長下測定樣品的吸光度以評估細胞增殖情況。

將MARC-145細胞、MARC-145ORF6細胞系和MARC-145Flag細胞系按每孔104個細胞均勻鋪至12孔細胞培養板中,利用細胞計數儀,每12 h取3孔細胞消化后計數并取平均值,連續監測96 h,以時間為橫坐標,細胞數為縱坐標,繪制MARC-145細胞、MARC-145ORF6細胞系和MARC-145Flag細胞系的生長曲線,比較不同細胞系的生長速度。

1.8 MARC-145ORF6細胞系傳代穩定性的鑒定

分別利用RT-PCR、Western blot和IFA鑒定MARC-145ORF6細胞系ORF6基因和M蛋白的傳代穩定性。收集P1、P5、P10代次MARC-145ORF6細胞系、MARC-145Flag細胞系和MARC-145細胞的細胞樣品,首先提取總RNA,反轉錄得到cDNA。利用表1中鑒定引物JD-ORF6-F和JD-ORF6-R進行PCR擴增,RT-PCR試驗鑒定MARC-145ORF6細胞系ORF6基因的傳代穩定性。收集上述細胞樣品,加入RIPA進行裂解,5×Loading buffer處理后進行SDS-PAGE,恒壓濕法轉印至PVDF膜,PVDF膜置于5%脫脂奶粉中室溫封閉2 h,Flag單克隆抗體作為一抗室溫孵育2 h;HRP標記的Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody作為二抗室溫孵育1 h,用WesternBright ECL發光底物顯色,利用自動凝膠成像系統分析結果,Western blot鑒定MARC-145ORF6細胞系M蛋白的傳代穩定性。收集P3、P5、P10代次MARC-145ORF6細胞系、MARC-145Flag細胞系和MARC-145細胞的細胞樣品,將上述細胞分別按每孔1×105個細胞均勻鋪到96孔板,待細胞長滿后用4%多聚甲醛溶液固定15 min,0.25% Trition-X-100溶液破膜15 min,5%脫脂奶粉37 ℃封閉1 h,Flag單克隆抗體作為一抗37 ℃孵育1 h,Fluorescein (FITC)標記的AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)作為二抗37 ℃孵育1 h,DAPI染色5 min,最后置于熒光顯微鏡下觀察結果,IFA試驗鑒定MARC-145ORF6細胞系M蛋白的傳代穩定性。

1.9 檢測MARC-145ORF6細胞系中M蛋白的亞細胞定位

分別收集約1×106個MARC-145ORF6細胞、MARC-145Flag細胞和MARC-145細胞樣品,根據亞細胞結構蛋白抽提試劑盒說明書依次提取細胞質蛋白、細胞膜和細胞器膜蛋白及其核蛋白,將分離得到的各蛋白組分進行Western blot,方法如步驟“1.8”所示,分別利用Flag單克隆抗體、ATPase單克隆抗體、Tubulin單克隆抗體和Histone H3單克隆抗體作為一抗進行檢測。

1.10 穩定過表達M蛋白的MARC-145ORF6細胞系對Ⅰ型干擾素及調節基因的影響

將MARC-145Flag細胞與MARC-145ORF6細胞均勻鋪至24孔板中,待單層細胞密度達到80%左右,換成維持液,向孔里加入10 μL 仙臺病毒(Sendai virus, SeV),12 h后收集細胞樣品提取總RNA,反轉錄的cDNA作為模板,利用表1中的actin-F/R、mIFNβ-qF/qR、mIFIT1-qF/qR、mIFIT2-qF/qR、mISG15-qF/qR、mMX2-qF/qR和mOAS3-qF/qR引物進行RT-qPCR。

1.11 穩定過表達M蛋白的MARC-145ORF6細胞系對PRRSV增殖能力的影響

同時將生長狀態良好的MARC-145ORF6細胞系、MARC-145Flag細胞系和MARC-145細胞均勻鋪到12孔細胞板中,待單層細胞密度長至70%～80%時按MOI=1接毒PRRSV,2 h后棄去培養基,換成維持液繼續培養;收取感染后12 h(hours post infection,hpi)、24 hpi、36 hpi、48 hpi、60 hpi和72 hpi的細胞上清并保存于-80 ℃。將生長狀態良好的MARC-145細胞均勻鋪至96孔細胞板中,待單層細胞密度長至70%～80%時分別測定上述不同時間點收取上清的病毒滴度,按Karber法計算病毒樣品的TCID50并利用GraphPad Prism軟件進行數據處理并繪制多步生長曲線,比較PRRSV在三種細胞上生長曲線的異同。

2 結 果

2.1 Lenti-CMV-Puro-Flag-ORF6重組慢病毒質粒的構建和鑒定

擴增獲得ORF6基因片段(圖1A),將其連接至載體上,菌液PCR可見符合預期大小的條帶(圖1B)。陽性菌液測序結果經SnapGene軟件比對,顯示重組質粒無堿基突變,表明重組質粒均構建成功(圖1C)。重組質粒用NheⅠ和XhoⅠ限制性內切酶對質粒進行雙酶切鑒定(圖1D)。上述結果表明重組慢病毒質粒Lenti-CMV-Puro-Flag-ORF6構建成功。

A. ORF6 基因PCR擴增;B. Lenti-CMV-Puro-Flag-ORF6 重組質粒的PCR鑒定;C. Lenti-CMV-Puro-Flag-ORF6陽性菌液測序結果;D. Lenti-CMV-Puro-Flag-ORF6 重組質粒酶切鑒定A. PCR amplification of ORF6 gene; B. PCR identification of Lenti-CMV-Puro-Flag-ORF6 recombinant plasmids; C. Lenti-CMV-Puro-Flag-ORF6 positive bacterial sequencing results; D. Enzyme digestion identification of Lenti-CMV-Puro-Flag-ORF6 recombinant plasmid

A. MARC-145細胞、MARC-145ORF6細胞系、MARC-145Flag細胞系的活力測定;B. MARC-145細胞、MARC-145ORF6細胞系、MARC-145Flag細胞系的生長曲線。ns.P>0.05A. Determination of viability of MARC-145 cells, MARC-145ORF6 cell line, and MARC-145Flag cell line; B. Growth curves of MARC-145 cells, MARC-145ORF6 cell line, and MARC-145Flag cell line.ns.P>0.05

2.2 穩定過表達M蛋白對MARC-145細胞增殖的影響

CCK8試驗結果顯示,MARC-145ORF6細胞系與MARC-145細胞和MARC-145Flag細胞系的生長活力差異不顯著,MARC-145細胞和MARC-145Flag細胞系的生長活力差異不顯著(圖2A),表明M蛋白過表達的MARC-145ORF6細胞系細胞活力未受明顯影響。進一步繪制MARC-145細胞、MARC-145ORF6細胞系和MARC-145Flag細胞系的生長曲線并比較三者的生長速度,試驗結果表明三種細胞系生長速度無明顯差異(圖2B)。

2.3 MARC-145ORF6細胞系傳代穩定性的鑒定

RT-PCR結果顯示P1、P5、P10代次的MARC-145ORF6細胞系均可擴增出符合預期大小的單一條帶(圖3A),Western blot結果可見到大小約為18 ku的清晰條帶(圖3B),IFA結果顯示在倒置熒光顯微鏡下可以觀察到MARC-145Flag細胞系和MARC-145細胞沒有陽性熒光信號,P3、P5、P10代次的MARC-145ORF6細胞可觀察到明顯的陽性熒光信號(圖3C),以上結果表明MARC-145ORF6細胞系穩定表達ORF6基因和M蛋白。

A. RT-PCR檢測MARC-145ORF6細胞系P1、P5、P10代次中ORF6基因表達情況;B. Western blot檢測MARC-145ORF6細胞系P1、P5和P10代次中M蛋白表達情況;C. IFA檢測MARC-145ORF6細胞系P3、P5和P10代次中M蛋白表達情況;M.DNA相對分子質量標準;1. MARC-145細胞;2. MARC-145Flag細胞系;3～5. MARC-145ORF6細胞系P1、P5和P10代次A. The expression of ORF6 gene in P1, P5 and P10 generations of MARC-145ORF6 cell line was detected by RT-PCR; B. The expression of ORF6 gene in P1, P5 and P10 generations of MARC-145ORF6 cell line was detected by Western blot; C. IFA detected ORF6 gene expression in the P3, P5 and P10 passages of MARC-145ORF6 cell line; M. DNA relative molecular mass standard; 1. MARC-145 cells; 2. MARC-145Flag cell line; 3-5. P1, P5 and P10 generations of MARC-145ORF6 cell lines

2.4 MARC-145ORF6細胞系中M蛋白的亞細胞定位

分別對抽提的細胞質蛋白、細胞膜和細胞器膜蛋白及其核蛋白進行Western blot檢測,結果顯示M蛋白主要定位在MARC-145ORF6細胞系的膜蛋白上(圖4B)。

A. MARC-145ORF6細胞系細胞質蛋白中M蛋白的表達情況;B. MARC-145ORF6細胞系細胞膜和細胞器膜蛋白中M蛋白的表達情況;C. MARC-145ORF6細胞系核蛋白中M蛋白的表達情況A. Expression of M protein in cytoplasmic protein of MARC-145ORF6 cell line; B. Expression of M protein in membrane and organelle membrane proteins of MARC-145ORF6 cell line; C. Expression of M protein in nuclear protein of MARC-145ORF6 cell line

2.5 穩定過表達M蛋白對MARC-145ORF6細胞系Ⅰ型干擾素的影響

RT-qPCR結果顯示(圖5),MARC-145ORF6細胞系的IFNβ、IFIT1、IFIT2、ISG15、MX2和OAS3的mRNA水平均顯著低于MARC-145Flag細胞系,表明穩定過表達M蛋白顯著下調了MARC-145ORF6細胞系的Ⅰ型干擾素及其相關調節基因水平。

A.IFNβ的mRNA表達水平;B. IFIT1的mRNA表達水平;C. IFIT2的mRNA表達水平;D.ISG15的mRNA表達水平;E. MX2的mRNA表達水平;F. OAS3的mRNA表達水平;*.P<0.05,**.P<0.001,***.P<0.001A. mRNA expression level of IFNβ; B. mRNA expression level of IFIT1; C. mRNA expression level of IFIT2; D. mRNA expression level of ISG15; E. mRNA expression level of MX2; F. mRNA expression level of OAS3;*.P<0.05,**.P<0.001,***.P<0.001

2.6 穩定過表達M蛋白的MARC-145ORF6細胞系對PRRSV滴度的影響

多步生長曲線(圖6)結果顯示,PRRSV在MARC-145ORF6細胞系的病毒載量峰值為106.875TCID50·mL-1,出現在48 hpi;PRRSV在MARC-145Flag細胞系和MARC-145細胞上的病毒載量的峰值為106.5TCID50·mL-1,均出現在48 hpi;結果顯示相比于MARC-145Flag細胞系和MARC-145細胞,MARC-145ORF6細胞系各個時間點的病毒滴度均更高,表明過表達M蛋白的MARC-145ORF6細胞系對PRRSV的增殖有促進作用。

圖6 PRRSV在MARC-145細胞、MARC-145ORF6細胞系和MARC-145Flag細胞系上的多步生長曲線Fig.6 Multistep growth curves of PRRSV on MARC-145 cell line, MARC-145ORF6 cell line and MARC-145Flag cell line

3 討 論

PRRS是一種嚴重危害世界豬業經濟的傳染病,最早于1987年在美國發現[16],由于其傳播能力強、速度快以及流行范圍廣泛,在歐洲和美國迅速傳播開來[17]。目前PRRS的商用疫苗免疫效果欠佳[18],PRRSV對豬產生持續性感染導致病毒在豬群中長期存在,而且PRRS在養殖場中常繼發混合感染[19-21],使得豬的死亡率升高,這些問題都給PRRS的防控帶來了艱巨的任務,并且嚴重危害我國畜牧業的發展[22]。

本實驗室前期研究發現,構建高效表達PRRSV結構蛋白的真核質粒難度較大,其中表達PRRSV M蛋白的真核質粒在瞬時轉染后難以表達或表達量很低,不利于開展針對M蛋白的生物學功能的研究。因此,本研究利用慢病毒包裝系統,將編碼PRRSV M蛋白的ORF6基因高效整合至宿主細胞染色體上,以實現外源基因的穩定和持久表達,最終成功建立穩定表達PRRSV M蛋白的MARC-145ORF6細胞系,為進一步研究M蛋白的生物學功能提供了重要試驗材料。

天然免疫系統是機體抵抗外界病原體的第一道防線,干擾素是早期免疫應答的重要成員,病毒侵入機體激活干擾素基因進而可以發揮抗病毒作用。然而,PRRSV是一種免疫抑制性病原體,尤其可抑制Ⅰ型干擾素產生。目前已鑒定出6種PRRSV病毒蛋白作為干擾素拮抗劑,包括非結構蛋白nsp1α、nsp1β、nsp2、nsp4、nsp11以及結構蛋白N[23],但關于其他病毒蛋白是否發揮免疫抑制功能的研究較少,鑒定新的免疫抑制分子對于闡明PRRSV致病機制和研發新型PRRS疫苗具有重要意義。因此,本研究在獲得穩定表達PRRSV M蛋白細胞系的基礎上,著重關注了其是否影響了干擾素通路和病毒復制。隨后,本研究發現過表達PRRSV M蛋白可抑制MARC-145ORF6細胞系的Ⅰ型干擾素基因及其相關調控基因表達且促進PRRSV復制,表明編碼M蛋白的ORF6基因可能是PRRSV潛在的干擾素抑制基因,為進一步深入研究M蛋白的生物學功能和解析PRRSV免疫抑制機制提供了新的研究思路。

4 結 論

本研究應用慢病毒包裝系統結合嘌呤霉素篩選獲得穩定過表達PRRSV M蛋白的MARC-145ORF6細胞系,且PRRSV ORF6基因的插入對MARC-145細胞生長無顯著影響。進一步研究發現MARC-145ORF6細胞系的Ⅰ型干擾素水平顯著下調且促進PPRSV復制,表明ORF6可能是PRRSV潛在的免疫抑制基因,為深入解析PRRSV免疫抑制機制提供了新的研究思路。本研究構建的MARC-145ORF6細胞系為進一步研究PRRSV M蛋白的生物學功能提供了重要的生物材料。