豬圓環(huán)病毒3型Cap蛋白單克隆抗體的制備及阻斷ELISA檢測(cè)方法的建立

張寶戈,黃雅琴,蔡金雙,朱晨光,李玉峰

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物細(xì)菌學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南京 210095)

豬圓環(huán)病毒(porcine circovirus,PCV)是一種環(huán)狀、單股負(fù)鏈DNA病毒,屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬[1]。2016 年,Palinski等[2]在美國(guó)通過(guò)宏基因組分析,從患有 PNDS 的病死母豬和流產(chǎn)胎兒中首次發(fā)現(xiàn) PCV3。其后,美國(guó)、中國(guó)、巴西、意大利、韓國(guó)、泰國(guó)、西班牙、丹麥、德國(guó)、瑞典和波蘭等許多國(guó)家都出現(xiàn)了大量關(guān)于檢測(cè)出 PCV3 的報(bào)道,表明該病毒已快速在全球范圍內(nèi)傳播[3-5]。2017 年3月,廣東省報(bào)道了我國(guó)首例 PCV3 感染病例,此后,在我國(guó)多個(gè)省份均有關(guān)于PCV3的報(bào)道[6-8]。除了在豬體中檢測(cè)到PCV3外,在犬科動(dòng)物和其他哺乳動(dòng)物中也鑒定到PCV3的存在[9]。Cui等[10]提出PCV3起源于蝙蝠,鳥(niǎo)類(lèi)是蝙蝠圓環(huán)病毒傳播給豬的重要中間宿主,這種傳播方式增加了跨物種傳播的風(fēng)險(xiǎn),影響到公共衛(wèi)生安全。

PCV3的基因組總長(zhǎng)為2 000 bp,包含三個(gè)主要開(kāi)放閱讀框(open reading frames,ORF),分別為ORF1、ORF2和ORF3。對(duì)不同國(guó)家PCV3分離株的基因序列分析顯示,全基因組序列和衣殼蛋白(capsid protein,Cap蛋白)的核苷酸相似性分別為97.6%～99.8%和97.5%～100%,表明PCV3的序列高度保守[11]。進(jìn)一步分析Cap蛋白的氨基酸序列可知,全球流行的PCV3毒株主要分為PCV3a、PCV3b和PCV3c三種亞型[5,11-12],其中PCV3a的流行率正在不斷上升[13]。PCV3基因組中ORF2基因編碼的Cap蛋白N端與其它圓環(huán)病毒一樣,富含高度堿性的精氨酸殘基,是豬圓環(huán)病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白,能引發(fā)特異性免疫反應(yīng)。因此,Cap蛋白是研發(fā)檢測(cè)方法的首要候選因子。當(dāng)前檢測(cè)PCV3常用的方法主要包括PCR與ELISA,進(jìn)一步使用IHC、原位雜交以及病理觀(guān)察等加以佐證。已報(bào)道文獻(xiàn)中ELISA方法以間接ELISA方法為主,但是該方法特異性較差,容易發(fā)生交叉反應(yīng)。

本研究將PCV3的Cap蛋白基因進(jìn)行原核表達(dá),成功制備得到1株具有良好阻斷效果的2E6單克隆抗體。在此基礎(chǔ)上,建立了一種阻斷ELISA方法,該方法具有較高重復(fù)性和特異性,為PCV3檢測(cè)提供了一種有效的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料

SUMO-Cap重組質(zhì)粒、PCV3-Cap真核質(zhì)粒、PCV2-VLP以及PCV3桿狀病毒液由本實(shí)驗(yàn)室制備與保存,豬圓環(huán)病毒3型(PCV3)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、豬偽狂犬病病毒(PRV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬瘟病毒(CSFV)等陽(yáng)性血清以及豬陰性對(duì)照血清由本實(shí)驗(yàn)室保存。BALB/c小鼠和ICR小鼠訂購(gòu)于上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,羊抗鼠IgG-HRP購(gòu)自Cell Signaling Technology,TMB顯色液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 SUMO-Cap重組蛋白的表達(dá)與純化

將SUMO-Cap重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到Rosetta感受態(tài)細(xì)胞中,挑取單菌落搖菌至OD600nm值為0.4～0.6后,加入終濃度為1 mmol·L-1的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)。16 ℃,150 r·min-1搖菌24 h后,收集菌體超聲破碎并進(jìn)行SDS-PAGE鑒定,確定蛋白表達(dá)在沉淀后用尿素透析法純化,并將純化后的蛋白進(jìn)行Western blot鑒定。鑒定成功后,測(cè)定蛋白濃度,保存于-80 ℃。

1.3 單克隆抗體的制備、純化與鑒定

用純化后的SUMO-Cap重組蛋白100 μg·只-1免疫6～8周齡雌性BALB/c小鼠,3次免疫后再進(jìn)行一次沖擊免疫。取免疫后的小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0融合,進(jìn)行3次亞克隆,采用間接ELISA方法進(jìn)行篩選,獲得陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株,將細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)并制備腹水,將采集后的腹水送至南京鐘鼎生物技術(shù)有限公司進(jìn)行純化與HRP酶標(biāo)。用pCold-SUMO空載作為陰性對(duì)照,PCV2-VLP作為無(wú)關(guān)蛋白對(duì)照,進(jìn)行Western blot鑒定。將PCV3-Cap真核質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞,用制備的單抗作為一抗,進(jìn)行間接免疫熒光(IFA)檢測(cè),以此來(lái)鑒定單抗的特異性。

1.4 阻斷ELISA方法的建立與最佳反應(yīng)條件的優(yōu)化

根據(jù)方陣滴定法,以2、1.5、1.0、0.5、0.25 μg·mL-1蛋白濃度100 μL·孔-1進(jìn)行抗原包被;抗原包被條件分為37 ℃ 2 h、4 ℃ 12 h以及37 ℃ 2 h轉(zhuǎn)至4 ℃ 12 h三種方法;PBST洗3次,封閉液選擇1%BSA、2%BSA、5%脫脂乳、2%明膠,200 μL·孔-1在37 ℃下進(jìn)行封閉,封閉時(shí)間設(shè)置為1、2和3 h;PBST洗3次,陽(yáng)性血清和陰性血清按照1∶1、1∶5、1∶10、1∶50進(jìn)行稀釋,100 μL·孔-1加入后,在37 ℃下作用時(shí)間分為0.5、1、1.5、2、2.5 h;PBST洗3次,酶標(biāo)單抗按照1∶2 000、1∶2 500、1∶3 000、1∶3 500進(jìn)行稀釋,100 μL·孔-1加入后,在37 ℃下作用時(shí)間分為0.5、1、1.5、2 h;PBST洗3次,避光加入100 μL·孔-1的TMB,在37 ℃下作用時(shí)間分為5、10、15、20、25 min;顯色結(jié)束后,加入50 μL·孔-1終止液。酶標(biāo)儀測(cè)定OD450值,阻斷率(PI)=(陰性血清OD450nm值-被檢血清OD450nm值)/陰性血清OD450nm值×100%。

1.5 阻斷ELISA方法臨界值的確定

1.6 特異性試驗(yàn)

按照已經(jīng)優(yōu)化好條件的阻斷ELISA方法檢測(cè)豬圓環(huán)病毒3型(PCV3)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、偽狂犬病病毒(PRV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)和豬瘟病毒(CSFV)陽(yáng)性血清,重復(fù)3次取平均值后計(jì)算PI,以此評(píng)判該方法的特異性。

1.7 敏感性試驗(yàn)

將3份PCV3陽(yáng)性血清進(jìn)行連續(xù)倍比稀釋,用建立的阻斷ELISA方法進(jìn)行檢測(cè),以此評(píng)判該方法的敏感性。

1.8 重復(fù)性試驗(yàn)

使用同一批次包被的酶標(biāo)板檢測(cè)3份PCV3陽(yáng)性血清,重復(fù)3次,計(jì)算批內(nèi)變異系數(shù)。包被3批不同批次的酶標(biāo)板,檢測(cè)3份陽(yáng)性血清,重復(fù)3次取平均值,計(jì)算批間變異系數(shù)。綜合上述結(jié)果,評(píng)判該方法的重復(fù)性。

1.9 符合率試驗(yàn)

用本研究建立的阻斷ELISA方法與IPMA方法相對(duì)比,檢測(cè)150份豬血清樣品,根據(jù)公式計(jì)算Kappa值。當(dāng)0

2 結(jié) 果

2.1 目的蛋白的純化與鑒定

SDS-PAGE結(jié)果顯示,SUMO-Cap重組蛋白主要存在于包涵體中,經(jīng)包涵體純化后可得到純度較高的蛋白,相對(duì)分子質(zhì)量大小約為40 ku(圖1A),與預(yù)期結(jié)果一致。Western blot結(jié)果表明,純化后的重組蛋白可與PCV3豬源陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng)(圖1B)。

M. 180 ku 蛋白相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1. 誘導(dǎo)后pCold-SUMO空載對(duì)照;2. 誘導(dǎo)后SUMO-Cap全菌對(duì)照;3. 超聲破碎上清;4. 超聲破碎沉淀;5. 純化后SUMO-Cap重組蛋白;6. pCold-SUMO空載;7. 純化后SUMO-Cap重組蛋白 M. 180 ku protein marker; 1. pCold-SUMO empty vector control after induction; 2. SUMO-Cap whole bacteria after induction; 3. Supernatant of sonication.; 4. Precipitation Supernatant of sonication; 5. Purified SUMO-Cap recombinant protein; 6. Production for pCold-SUMO empty vector; 7. Purified SUMO-Cap recombinant protein

2.2 單克隆抗體的純化與鑒定

多次亞克隆篩選后得到雜交瘤細(xì)胞株2E6,制備腹水使用ProteinA/G的方法純化獲得抗體(圖2A)。Western blot結(jié)果表明,得到的單克隆抗體可與SUMO-Cap重組蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)(圖2B)。IFA結(jié)果顯示,2E6單克隆抗體與PCV3具有良好的反應(yīng)性(圖2C)。

A.抗體純化效果(M. 180 ku蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1. 純化后的2E6單抗);B.抗體Western blot鑒定(M.180 ku蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1. pCold-SUMO空載;2. 純化后SUMO-Cap重組蛋白;3. PCV2-VLP);C.2E6單抗IFA鑒定(400×)A.Purification of mAb (M. 180 ku protein marker; 1. Purified 2E6 mAb); B. Identification of mAb by Western blot (M.180 ku protein marker; 1. pCold-SUMO empty vector; 2. Purified SUMO-Cap recombinant protein; 3. PCV2-VLP); C. Identification of monoclonal antibody to 2E6 by IFA (400×)

2.3 阻斷ELISA最佳反應(yīng)條件的優(yōu)化

通過(guò)不斷優(yōu)化阻斷ELISA的反應(yīng)條件,確定了最佳條件如下:抗原包被濃度為0.5 μg·mL-1,包被條件為37 ℃ 2 h轉(zhuǎn)至4 ℃ 12 h;最佳封閉劑為5%脫脂乳,封閉條件為37 ℃ 3 h;血清稀釋度為1∶1,反應(yīng)條件為37 ℃ 2.5 h;酶標(biāo)單抗最佳稀釋度為1∶3 000,反應(yīng)條件為37 ℃ 1 h;TMB的最佳反應(yīng)條件為37 ℃ 15 min。

2.4 臨界值的確定

表1 阻斷ELISA臨界值的確定

2.5 特異性檢驗(yàn)

使用本試驗(yàn)中建立好的阻斷ELISA方法檢測(cè)PCV3、PCV2、PRV、PRRSV和CSFV抗體陽(yáng)性血清,結(jié)果如圖3所示,PCV3陽(yáng)性血清的PI值為83.12%,其他病原的陽(yáng)性血清PI值均小于28.30%,由此說(shuō)明該方法的特異性較好。

圖3 阻斷ELISA特異性檢驗(yàn)Fig.3 Results of the specificity test for blocking ELISA

2.6 敏感性檢驗(yàn)

將3份PCV3陽(yáng)性血清進(jìn)行倍比稀釋,按照已經(jīng)優(yōu)化好的阻斷ELISA方法進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果如圖4所示,檢測(cè)效價(jià)可達(dá)到1∶128。

圖4 阻斷ELISA敏感性檢驗(yàn)Fig.4 Results of the sensitivity test for blocking ELISA

2.7 重復(fù)性檢驗(yàn)

使用建立好的阻斷ELISA方法檢測(cè)3份PCV3陽(yáng)性血清,進(jìn)行批內(nèi)和批間重復(fù),結(jié)果如表2、3所示,批內(nèi)變異系數(shù)為0.46%～0.92%,批間變異系數(shù)為1.29%～4.11%,兩者的變異系數(shù)均小于10%,說(shuō)明該方法具有良好的重復(fù)性。

表2 阻斷ELISA的批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果

表3 阻斷ELISA的批間重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果

2.8 符合率檢驗(yàn)

2.8.1 IPMA法檢測(cè)PCV3陽(yáng)性血清 將PCV3桿狀病毒液感染Sf9細(xì)胞48 h后,待檢臨床豬血清作為一抗,二抗使用HRP標(biāo)記的羊抗豬酶標(biāo)二抗,用AEC法顯色。如圖5所示,不顯色說(shuō)明血清為陰性,顯紅色說(shuō)明血清為陽(yáng)性。

圖5 IPMA法檢測(cè)PCV3血清Fig.5 Detection of PCV3 serum by IPMA method

2.8.2 比對(duì)試驗(yàn) 使用本研究中優(yōu)化后的阻斷ELISA方法,與本實(shí)驗(yàn)室前期建立的IPMA方法同時(shí)檢測(cè)150份豬血清樣品,根據(jù)公式計(jì)算Kappa值,結(jié)果如表4所示,與IPMA方法比對(duì),計(jì)算得到的Kappa值為0.9。該阻斷ELISA方法與IPMA方法比對(duì)后的Kappa值大于0.75,說(shuō)明該方法具有良好的符合率。

表4 比對(duì)試驗(yàn)結(jié)果

3 討 論

當(dāng)豬體感染PCV3后,據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道主要損傷的是呼吸與消化系統(tǒng)[7,14]。與此同時(shí),會(huì)引起腸道微生物群的動(dòng)態(tài)變化,破壞了菌群的平衡,其次伴隨著滲出性皮炎等癥狀[15-16]。PCV3存在垂直傳播,會(huì)穿過(guò)胎盤(pán)屏障并且在胎兒的組織內(nèi)復(fù)制,產(chǎn)生較高的病毒載量,甚至導(dǎo)致懷孕母豬出現(xiàn)死胎與木乃伊胎[17-20]。PCV3持續(xù)性病毒血癥的出現(xiàn),增加了再次感染的可能性,雖然病毒可能在豬體內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間存在,但卻不會(huì)表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀[11,21-23]。不同階段的豬均可以檢出PCV3,在木乃伊胎兒中的比例最高,該病毒可能是導(dǎo)致繁殖失敗的原因之一[24-25]。研究表明,PCV3可感染多種動(dòng)物,不只局限于豬[9]。由于該病毒存在眾多的中間宿主,此特性也為其在種間傳播提供了可能,將對(duì)養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展造成了巨大的威脅。

在臨床檢測(cè)中,PCV3會(huì)出現(xiàn)病毒血癥,部分豬體在咽拭子與肛門(mén)拭子中也可檢出PCV3陽(yáng)性[26]。關(guān)于PCV3病毒載量的測(cè)定,淋巴結(jié)中的病毒載量明顯高于肺和其他組織[4]。該病毒具有廣泛的組織嗜性,使用免疫組織化學(xué)法(IHC),可在感染PCV3豬體的腎、肺以及淋巴結(jié)中觀(guān)察到病原的位置[27-28]。當(dāng)前檢測(cè)PCV3常用的方法有PCR、ELISA、IHC、原位雜交以及組織病理學(xué)觀(guān)察等[29-30]。

目前,尚無(wú)有效預(yù)防PCV3感染的相關(guān)疫苗以及治療藥物,這為防范PCV3的感染增加了難度[31]。加強(qiáng)豬場(chǎng)的日常管理與環(huán)境衛(wèi)生是預(yù)防PCV3的主要手段,做到盡早發(fā)現(xiàn)并快速阻止病毒的進(jìn)一步擴(kuò)散[32]。因此,實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)臨床中PCV3的流行情況,持續(xù)分析相關(guān)分子流行病學(xué)動(dòng)態(tài)變化是至關(guān)重要的。本研究中的重組蛋白有大規(guī)模可獲得性且操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn),將重組蛋白免疫BALB/c小鼠制備獲得了一株分泌阻斷效果良好抗體的雜交瘤細(xì)胞株2E6,以此制備腹水得到的單克隆抗體具有構(gòu)象表位,可識(shí)別具有空間結(jié)構(gòu)的PCV3病毒粒子,為后期對(duì)PCV3的深入研究提供了有利的條件。此外,市面上并沒(méi)有特異性較好的商品化阻斷ELISA抗體檢測(cè)試劑盒,本研究中建立的方法特異性較高,與PCV2、PRV、PRRSV、CSFV抗體陽(yáng)性血清均不發(fā)生反應(yīng);具有可重復(fù)性,批內(nèi)變異系數(shù)為0.46%～0.92%,批間變異系數(shù)為1.29%～4.11%,兩者的變異系數(shù)均小于10%;該方法與IPMA方法比對(duì)后的Kappa值均大于0.75,說(shuō)明該方法具有良好的符合率;能夠快速檢測(cè)出PCV3抗體的存在,可應(yīng)用于豬場(chǎng)的日常管理中。與此同時(shí),應(yīng)該盡快開(kāi)發(fā)出針對(duì)性強(qiáng)的疫苗,不斷提高對(duì)PCV3的防控,減少養(yǎng)殖過(guò)程中引發(fā)的經(jīng)濟(jì)損失。

4 結(jié) 論

本研究成功篩選到1株具有良好阻斷效果的豬圓環(huán)病毒3型Cap蛋白單克隆抗體,并在此基礎(chǔ)上建立了一種具有較高重復(fù)性和特異性的阻斷ELISA檢測(cè)方法,為臨床PCV3流行病學(xué)調(diào)查提供了技術(shù)支撐。