表達外源基因SPAM1重組CAV-2溶瘤病毒的構建與拯救

高 龍,常心怡,李 程,趙曉亞,李汶潔,范浩謙,馬靜云

(華南農業大學動物科學學院,廣州 510642)

目前,腫瘤已經是僅次于心血管疾病的第二大人類主要疾病死亡原因,根據世衛組織的數據顯示,2020年約有近2 000萬例的新發患者和近1 000萬例的死亡患者[1]。癌癥同時也是犬貓死亡的主要原因之一,10歲以上的老年犬有50%是因腫瘤相關疾病死亡,中國目前已有超過6 000萬只家養犬,而腫瘤相關疾病的治療方案除了傳統的手術治療外目前尚無其他系統有效的療法面世[2]。腫瘤相關的傳統治療方式亟待革新與突破,目前腫瘤的治療已經不限于手術、化療和放射性治療等傳統療法,包括CRISPR/Cas9基因編輯技術[3-4]、溶瘤病毒、腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)治療、質子療法、嵌合抗原受體T細胞(CAR-T)療法等新型治療手段均在快速發展。其中溶瘤病毒、嵌合抗原受體T細胞(CAR-T)、腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)治療等免疫療法,是目前發展較為迅速且十分具有發展前景的治療方式。

溶瘤病毒是指使用天然的或通過基因工程改造后的病毒,可以通過腫瘤特異性受體或抗病毒通路缺失等靶向腫瘤細胞,并在腫瘤細胞內進行復制,通過誘導細胞凋亡、細胞焦亡和壞死性死亡等多種機制誘導腫瘤細胞死亡[5]。溶瘤病毒當前已有4款藥物獲批上市:Latima公司研發的Rigvir;三維生物研發的安柯瑞;Amgen公司研發的T-Vec;Daiichi Sankyo公司研發的Delytact (teserpaturev/G47Δ)。與此同時全球還有眾多的溶瘤病毒產品處于臨床試驗中,主要有皰疹病毒科、腺病毒科、痘病毒科、細小病毒科、副黏病毒科等[6],各種溶瘤病毒產品的作用方式和其作用機制各不相同。但溶瘤病毒行業整體呈現快速發展的趨勢。

腺病毒是溶瘤病毒臨床試驗中最主要的病毒載體之一,但很多患者具有預存抗體對人腺病毒具有一定程度的耐受,因此對其作用效果產生了影響[7],而犬腺病毒-2型(canine adenovirus type 2,CAV-2)則具備解決該問題的潛能,因為CAV-2在人體內幾乎不存在預存抗體,并且可以實現在腫瘤細胞中復制且不引起患者機體致病[8-9],具有一定的安全性,使其在溶瘤病毒領域具備了潛在的應用前景。CAV-2基因組全長約為32 kb,其可以插入7 kb以上的外源基因片段,易于純化[10],有利于使用CAV-2攜帶治療基因進入腫瘤細胞進而獲得更好的抗瘤效果。

腫瘤微環境通過透明質酸的合成和降解發生重塑[11-12]。透明質酸維持實體瘤高內壓的腫瘤微環境,為腫瘤細胞的增殖和遷移提供有利條件[13],構筑腫瘤免疫逃逸的物理屏障,嚴重阻礙了抗腫瘤藥物的瘤內遞送與治療。透明質酸酶可以降解透明質酸,生殖簇中編碼的精子黏附因子(SPAM1)是基因組編碼的6種透明質酸酶中結構和功能最優的[14]。在腫瘤細胞中表達SPAM1蛋白可以降解透明質酸從而增強抗瘤藥物的瘤內彌散以及Th1型免疫細胞的瘤內浸潤、重塑腫瘤微環境破壞腫瘤免疫逃逸物理屏障系統性增強抗瘤效應[15-16]。

本研究以CAV-2病毒作為載體,構建缺失E3區域并插入外源基因SPAM1序列的P15A-CAV-2-mCMV-SPAM1-SV40 polyA感染性克隆質粒,并拯救重組病毒,以獲得能夠穩定表達外源基因SPAM1的重組病毒CAV-2-DelE3-SPAM1。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質粒與細胞 GBdir-pir116-gyrA462、GBred-A462-CAV-2、GB08-red工程菌均來自實驗室前期構建與保存。R6K-amp-mCMV-eGFP-SV40 polyA-kmccd質粒來自實驗室前期構建與保存。MDCK-E1A細胞系來自本實驗室保存。

1.1.2 試劑NheI、AscI、EcoR V、NcoI內切酶購自NEB。質粒大提試劑盒購自天根。膠回收試劑盒、PCR擴增酶、病毒總核酸提取試劑盒、DNAmarke購自諾唯贊。Lipo3000轉染試劑購自賽默飛。所有引物由上海生工合成。TBST,脫脂奶粉購自康為世紀。CAV、SPAM1多克隆抗體購自AbcamIgG二抗- DyLight 594IgG二抗-iFluor 488購自艾美捷。CCK8試劑,3D細胞微球制備板(SpheroXTM96Ukit)購自碧云天。

1.2 方法

1.2.1 引物設計與合成 在本研究中用到的PCR擴增引物及熒光定量擴增引物以及用于敲除反向篩選基因的段引物如表1所示。

表1 引物信息

1.2.2 R6K-amp-mCMV-eGFP-SV40 polyA-kmccdB中間載體構建及鑒定NheI酶切使質粒R6K-amp-mCMV-eGFP-SV40 polyA-kmccdB線性化,并回收線性片段。使用引物F2、R2擴增SPAM1目的基因片段b并回收擴增片段。在GBdir-pir116-gyrA462工程菌中進行同源重組構建攜帶外源基因的重組質粒R6K-amp-mCMV-SPAM1-SV40 polyA-kmccdB。以F1、R1為引物進行外源基因測序并使用NcoI對中間載體進行酶切驗證。

PCR反應體系20 μL:2 × Phanta? Flash Master Mix(Dye Plus) 10 μL,上、下游引物各1 μL,質粒模板1 μL,ddH2O 7 μL。PCR反應條件:98 ℃預變性30 s;98 ℃變性10 s,55 ℃退火5 s,72 ℃延伸30s,共30個循環;72 ℃徹底延伸1 min,使用1.0%瓊脂糖凝膠進行檢測。

1.2.3 感染性克隆的構建及鑒定AscI酶切R6K-amp-mCMV-SPAM1-SV40 polyA-kmccdB重組質粒,回收酶切后的質粒片段,在GBred-A462-CAV-2中進行同源重組。使用F3、R3進行檢測并使用EcoR Vd對P15A-CAV-2-mCMV-SPAM1-SV40 polyA-kmccdB質粒進行酶切驗證。

再利用合成引物del kmccdB-mCMV進行反向篩選表達盒的敲除,并使用F3、R3進行測序驗證P15A-CAV-2-mCMV-SPAM1-SV40 polyA感染性克隆構建。

PCR反應體系20 μL:2 × Phanta? Flash Master Mix(Dye Plus) 10 μL,上、下游引物各1 μL,質粒模板1 μL,ddH2O 7 μL。PCR反應條件:98 ℃預變性30 s;98 ℃變性10 s,55 ℃退火5 s,72 ℃延伸30 s,共30個循環;72 ℃徹底延伸1 min,使用1.0%瓊脂糖凝膠進行檢測。

1.2.4 病毒拯救及鑒定 提取P15A-CAV-2-mCMV-SPAM1-SV40 polyA質粒,用AscI酶切并回收CAV-2-mCMV-SPAM1-SV40 polyA線性片段,使用Lipo3000轉染MDCK-E1A細胞系。回收P1～P15代病毒樣品并提取病毒核酸,使用F2、R2、F3、R3進行PCR檢測。

PCR反應體系20 μL:2 × ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL,上、下游引物各0.5 μL,質粒模板1 μL,ddH2O 8 μL。PCR反應條件:95 ℃預變性30 s;95 ℃變性10 s,60 ℃退火30 s,共40個循環;溶解曲線95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s,95 ℃ 15 s。

1.2.5 重組病毒株生長曲線測定 以MOI=0.1接種CAV、CAV-2-DelE3-SPAM1于12孔板中,并于6、12、24、30、36、42、48、54、60、66、72 h收樣,使用病毒總核酸提取試劑盒提取病毒核酸,使用F5、R5檢測病毒拷貝數,繪制病毒一步生長曲線圖。

1.2.6 外源蛋白表達間接免疫熒光(IFA)鑒定 將重組病毒CAV-2-DelE3-SPAM1按照 MOI=0.1接種 MDCK-E1A細胞,接種后48 h收獲病毒上清繼續傳代。取P15代重組病毒CAV-2-DelE3-SPAM1,以MOI=1接種6孔板培養的 MDCK-E1A,感染24 h后收獲細胞樣品。使用1 mL 4%的多聚甲醛4 ℃固定30 min,PBS浸洗3次,加入1 mL 0.1%Triton X-100常溫作用15 min,PBS洗滌3次,之后加入1 mL 5%脫脂奶粉封閉液,封閉1 h,PBS洗滌3次后,加入CAV-2、SPAM1多克隆抗體4 ℃過夜。PBS洗滌3次后加入熒光二抗孵育1 h后再用PBS洗滌3次加入適量的DAPI覆蓋后于倒置熒光顯微鏡觀察。

1.2.7 重組溶瘤病毒CAV-2-DelE3-SPAM1 2D與3D體外溶瘤效應觀察 將重組病毒CAV-2-DelE3-SPAM1、野生型毒株CAV-2 按MOI=10接種 A72犬癌細胞系,接種后48 h顯微鏡下觀察野生毒株與重組毒株的2 D殺傷效應。

在3D細胞球制備板(SpheroXTM96Ukit)中每孔加入100 μL抗黏附包被液,置于37 ℃培養箱中靜置過夜。棄去抗黏附包被液后以每孔5 000個A72細胞的密度進行細胞接種。待A72細胞形成球體后棄去培養液,按照 MOI=10接種重組病毒CAV-2-DelE3-SPAM1、野生型毒株CAV-2,在培養箱中繼續培養,并于48 h顯微鏡下觀察A72 3 D細胞球殺傷情況。

1.2.8 重組溶瘤病毒CAV-2-DelE3-SPAM1 CCK8細胞殺傷檢測 在96孔板中每孔鋪5 000個A72細胞,置于37 ℃細胞培養箱中培養至細胞密度為90%。棄去培養液后使用PBS洗滌,使用不同的MOI(MOI=0.1、1、10)將重組病毒CAV-2-DelE3-SPAM1、野生型毒株CAV-2接種感染A72細胞,不加病毒的細胞孔作為對照組,不接種細胞的空白孔作為空白組。接毒后繼續培養48 h,棄去培養液每孔加入含10% CCK8的100 μL維持混合溶液,孵育20 min,使用酶標儀在450 nm處測量其吸光度(OD)值。細胞存活率=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]*100%,其中As為試驗組在450 nm處的OD值,Ab、Ac為空白組、對照組在450 nm處的OD平均值。

1.2.9 統計學分析 數據以“平均值±標準誤差(SEM)”表示。采用 GraphPad Prism 8.0 軟件對細胞存活率檢測CCK8試驗結果進行單因素方差分析,顯著性用P值表示,P<0.05代表差異顯著。

2 結 果

2.1 目的基因擴增

通過使用F2、R2引物擴增SPAM1目的基因,PCR結果顯示獲得1條1 653 bp的目的條帶與預期相符(圖1A),成功擴增出攜帶中間載體同源臂的SPAM1目的基因。

A. SPAM1目的基因PCR鑒定;B. R6K-amp-mCMV-SPAM1-SV40 polyA-kmccdB中間載體酶切鑒定;C. 感染性克隆P15A-CAV-2-mCMV-SPAM1-SV40 polyA酶切鑒定;D. P15A-CAV-2-mCMV-SPAM1-SV40 poly-kmccdB質粒PCR鑒定,泳道1、2、3為重復單克隆;E. 感染性克隆P15A-CAV-2-mCMV-SPAM1-SV40 poly陽性菌PCR鑒定,泳道1、2、3為重復單克隆,泳道4、5、6為重復單克隆A. PCR identification of SPAM1 target gene; B. Identification of R6K-amp-mCMV-SPAM1-SV40 polyA-kmccdB intermediate vector by restriction enzyme digestion; C. Cloning and identification of infectious clone P15A-CAV-2-mCMV-SPAM1-SV40 polyA; D. P15A-CAV-2-mCMV-SPAM1-SV40 poly-kmccdB plasmid was identified by PCR, and lane 1, 2, 3 were duplicate monoclonal; E. The infectious clone P15A-CAV-2-mCMV-SPAM1-SV40 poly-positive bacteria was identified by PCR, and lane 1, 2, 3 were duplicate monoclonal,lane 4, 5, 6 were duplicate monoclonal

2.2 R6K-amp-mCMV-SPAM1-SV40 polyA-kmccdB中間載體PCR與酶切鑒定

使用限制性內切酶NcoI對構建的中間載體R6K-amp-mCMV-SPAM1-SV40 polyA-kmccdB進行酶切電泳,酶切結果顯示分別獲得了在2 864、1 416、700、235處的4條目的條帶(圖1B),結果符合預期。通過測序酶切陽性菌結果顯示成功構建出攜帶SPAM1外源基因的中間載體R6K-amp-mCMV-SPAM1-SV40 polyA-kmccdB。

2.3 P15A-CAV-2-mCMV-SPAM1-SV40 polyA感染性克隆PCR與酶切鑒定

使用限制性內切酶EcoR V對構建的感染性克隆P15A-CAV-2-mCMV-SPAM1-SV40 polyA進行酶切電泳,酶切結果顯示分別獲得了在11 115、8 116、5 356、2 940、1 730、849、789 bp處的7條目的條帶(圖1C),結果符合預期。

2.4 重組感染性克隆PCR與測序驗證

使用F3、R3為引物,構建的P15A-CAV-2-mCMV-SPAM1-SV40 poly-kmccdB質粒為模板進行PCR擴增,PCR結果顯示獲得一條4 955 bp的目的條帶,符合預期(圖1D)。分別使用F1、R1和F3、R3為引物,感染性克隆P15A-CAV-2-mCMV-SPAM1-SV40 poly酶切陽性菌為模板進行PCR擴增,PCR結果顯示分別獲得1 748、3 492 bp的目的條帶與預期相符(圖1E),并進行測序驗證,證明攜帶外源基因SPAM1的感染性克隆P15A-CAV-2-mCMV-SPAM1-SV40 poly構建成功。

2.5 病毒拯救及鑒定

以提取的P1～P16代重組病毒CAV-2-SPAM1的基因組為模板,分別使用F1、R1和F3、R3為引物進行PCR擴增,PCR結果顯示分別獲得1 748、3 492 bp的目的條帶與預期相符(圖2),說明成功拯救出1株攜帶外源基因SPAM1的重組病毒,并且該重組病毒具有基因組遺傳穩定性。

A. 以F3、R3為引物重組病毒CAV-2-SPAM1: P1～P15. PCR結果;M.5 000 bp的DNA marker;1.陽性對照組;2.陰性對照組。B. 以F1、R1為引物重組病毒CAV-2-SPAM1: P1～P15. PCR結果; M.2 000 bp的DNA marker;1.陽性對照組;2.陰性對照組A. Recombinant virus CAV-2-SPAM1 used F3 and R3 as primers: P1-P15. PCR results; M. 5 000 bp DNA marker; 1. Positive control group; 2. Negtive control group. B. Recombinant virus CAV-2-SPAM1 used F1 and R1 as primers: P1-P15. PCR results; M. 2 000 bp DNA marker; 1.Positive control group; 2. Negtive control group

2.6 重組毒株生長曲線測定

以MOI=0.1進行接毒每隔6 h收樣,收取至72 h的樣品進行一步生長曲線測定,結果顯示,野生型毒株在54 h到達平臺期,重組毒株在60 h到達平臺期(圖3),總體趨勢上野生毒株與重組毒株沒有顯著差異,最大增殖滴度無顯著差異。

CAV. 接種CAV病毒的CAV組;CAV-PH20. 接種CAV-PH20的CAV-PH20組(PH20為SPAM1基因的別名)。下同CAV. Group infected with CAV virus, named CAV group; CAV-PH20. Group infected with CAV-PH20, named CAV-PH20 group(PH20 is the alias of SPAM1 gene). The same as below

2.7 外源蛋白表達間接免疫熒光IFA檢測

以MOI=1接種6孔板培養的 MDCK-E1A,感染24 h后進行間接免疫熒光檢測,結果顯示,在沒有接種毒的空白對照組中與綠色熒光指示的CAV-2和紅色熒光指示的SPAM1均無反應。在接種親本毒CAV-2的對照組中與綠色熒光指示的CAV-2有特異熒光反應且與紅色熒光指示的SPAM1無反應。在接種重組病毒CAV-2-DelE3-SPAM1的實驗組中與綠色熒光指示的CAV-2和紅色熒光指示的SPAM1均有反應。且可以發現紅色熒光指示的SPAM1有胞間彌散分布的特點,不完全被局限于病毒感染的細胞中(圖4)。

NC. 空白對照組;CAV. 接種原毒試驗組;CAV-2-DelE3-SPAM1. 接種重組毒試驗組;SPAM1. 重組基因抗體顯色通道;DAPI.染核染料顯色通道;CAV. 病毒結合抗體顯色通道;Merge. 三通道融合顯色圖NC. Blank control group; CAV. Experimental group inoculated with the original virus; CAV-2-DelE3-SPAM1. Experimental group inoculated with the recombinant virus; SPAM1. Recombinant gene antibody color channel; DAPI. Nuclear dye color channel; CAV. Virus-binding antibody color channel; Merge. Three-channel fusion color image

2.8 重組溶瘤病毒體外溶瘤效應檢測

如圖5,顯微鏡明場下觀察2D細胞殺傷模型和CCK8細胞殺傷檢測試驗可以發現,缺失E3區域表達外源基因SPAM1的重組溶瘤病毒對A72犬癌細胞系有強烈的溶瘤殺傷效應與野毒相比沒有明顯差異,且腫瘤細胞殺傷效應具有劑量依賴性(圖6),說明重組改造沒有影響腺病毒載體對腫瘤細胞的體外殺傷活性。在3D細胞模型上可以觀察到接種野生型CAV毒株比起NC組細胞微球邊緣彌散,微球長徑略有回縮,說明野生型CAV毒株對A72 3D微球具有一定的殺傷效應。而CAV-2-DelE3-SPAM1重組毒比CAV野生型毒株顯著減小了A72 3D細胞微球的體積。

下行圖比例尺為均5 μm,3D細胞微球直徑從左到右依次為:17.63、15.85、12.27 μmThe scale of the pictures on the lower line is 5 μm, the diameters of 3D cell microsphere from left to right are 17.63, 15.85, 12.27 μm, respectively

*. P<0.05,***. P<0.001

3 討 論

溶瘤病毒為腫瘤治療提供了更安全有效的治療方法,某些天然的溶瘤病毒本身特異性靶向腫瘤細胞以及對人體的弱毒性均為溶瘤病毒治療方案提供了安全保障[17]。但是單純依靠天然溶瘤病毒去徹底殺傷清除腫瘤細胞是非常困難的。隨著基因工程技術的發展以及對病毒基因結構和功能的深入了解,目前已經可以對天然病毒基因組進行編輯[17-18]。在病毒序列中插入外源基因,如Ma等[19]在單純皰疹病毒中刪除與病毒緊密關聯的ICP34.5/ICP0基因,插入治療基因GM-CSF(粒細胞巨噬細胞集落刺激因子),王立朋等[20]在流感病毒中插入PD1(程序性細胞死亡蛋白)序列等,獲得對腫瘤具有多能效應的溶瘤病毒從而提高其溶瘤效果。當前應用的抗瘤外源基因,主要具有刺激抗瘤免疫應答、重塑腫瘤微環境、誘導腫瘤細胞凋亡等功能[21],從多方面加強溶瘤病毒的治療效果。

SPAM1可以通過降解透明質酸,破壞腫瘤免疫逃逸物理屏障,重塑腫瘤微環境從而增加溶瘤病毒的瘤內擴散,以及促進樹突狀細胞激活腫瘤特異細胞毒性T細胞并促進Th1型免疫細胞的瘤內浸潤從而提高抗腫瘤效果[22-25]。本研究首次采用犬腺病毒CAV-2作為溶瘤載體表達SPAM1蛋白,構建拯救的重組病毒CAV-2-DelE3-SPAM1能夠高表達SPAM1蛋白,并且通過共定位關系可以發現SPAM1隨著細胞裂解可以被釋放并廣泛分布于所有細胞間隙不局限于病毒感染的區域,這預示著在實體瘤中SPAM1可以隨著彌散作用廣泛作用于實體瘤的腫瘤微環境實現其促進抗瘤免疫效應的目的。在體外腫瘤細胞殺傷試驗中可以觀察到其對犬癌細胞系A72強烈的殺傷效果,與野生型毒株無顯著差異。說明缺失E3區域和SPAM1外源基因的表達沒有影響毒株對癌細胞的殺傷效率。進一步在3D細胞微球模型中可顯著減低A72細胞微球體積,證明重組毒CAV-2-DelE3-SPAM1在實體瘤殺傷效應上有顯著改善。

在Cloquell等[26]研究中使用CAV17進行臨床試驗治療10只自發腦膠質瘤的患犬,無嚴重不良反應,僅有2只出現了疾病進行性進展,9只在外周血中檢出了循環CAV17。在Martín-Carrasco等[27]的研究中使用CAV15進行臨床試驗治療上皮源性的腫瘤患犬,有75%的患犬疾病被有效控制。在Cloquell等[26]和Martín-Carrasco等[27]的研究中均證明了犬腺病毒作為腫瘤患犬治療手段具有廣泛的安全性、有效性以及臨床應用前景。在Kremer等[28]的研究中,證明了CAV2可以在體內體外對犬高發骨肉瘤產生有效的殺傷效應。CAV2作為一種病理生理學上類人Ad2、Ad5型腺病毒,若在犬腫瘤臨床治療上取得有意義的進展,通過比較腫瘤學,深入評估其對人源性腫瘤疾病的臨床治療應用前景[29],有望為解決人體內預存人源腺病毒抗體影響溶瘤病毒療效以及難以重復治療的問題提供新思路。

酶切連接的基因編輯技術連接效率較低并受限于天然病毒基因組單酶切位點的數量和位置不能進行病毒所有基因組區域的廣泛編輯與改造,而且酶切連接由于酶切位點的限制不能實現無痕重組,非必要的堿基殘留可能會影響病毒的生物學特性增加病毒的復制負擔[30-31]。本研究使用RED/ET同源重組作為反向遺傳操作的主要基因編輯技術,可以通過同源臂的設計實現在病毒全基因組的所有區域進行無痕插入,最大程度減少不必要的堿基接入,降低基因重組對病毒生物學特性的影響[32]。通過重組病毒一步生長曲線可以發現,由于外源基因的存在以及E3區域的缺失,野生毒株在54 h到達復制平臺期而重組病毒則在72 h到達復制平臺期,達峰時間延緩但病毒的最大增殖滴度未受影響,和野生型毒株一致。

在井匯源等[33]的研究中使用PRRSV作為病毒載體,在病毒基因的基因組穩定性評估中發現,隨著連續傳代外源基因表達量有逐漸降低的趨勢并且最大病毒增殖滴度也低于野生型毒株。CAV-2是一種雙鏈DNA病毒,具有穩定的病毒基因組不會發生與宿主基因組的整合事件,具有臨床應用安全性與穩定性的優勢。通過P1～P15的連續傳代以及PCR檢測可以發現,外源基因在重組病毒基因組中并未發生丟失、突變重組等事件,在P15代的間接免疫熒光試驗中可以發現,外源基因的高表達沒有因連續傳代而丟失[34-35]。

4 結 論

本研究以CAV-2為親本株成功構建缺失E3區域并表達外源基因SPAM1的重組CAV-SPAM1,該重組毒株具有對犬癌細胞系A72強烈的體外溶瘤活性。