豬腹膜間皮細胞的分離培養及初步應用

黃媛媛,王 佳,陳嘉瑜,甘 源,袁 廳,馮志新,3,邵國青,3,王先煒,熊祺琰,3*

(1.南京農業大學動物醫學院,南京 210095;2.江蘇省農業科學院獸醫研究所/農業部獸用生物制品工程技術重點實驗室,南京 210014;3.獸用生物制品(泰州)國泰技術創新中心,泰州 225300)

間皮是分布于腹膜、胸膜、心包膜和大多數內臟器官表面的單層扁平上皮,其基本功能是作為一種保護性的濕潤光滑表面減少臟器之間的摩擦,也是抵抗微生物和腫瘤細胞入侵的重要防線[1]。間皮主要由間皮細胞構成,其源自于中胚層,但具有與上皮細胞相似的特征,如細胞極性、基底膜黏附、胞間緊密連接、表面微絨毛等[2-3]。間皮細胞可分泌黏多糖和表面活性物質為臟器提供潤滑和保護,同時間皮細胞還具有其他多種生理功能,如參與物質轉運、參與炎癥反應、調節凝血與纖溶、抑制腫瘤細胞擴散、參與間皮損傷修復等,同時也與多種病理過程有關,如漿膜炎(胸膜炎、腹膜炎、心包炎)、粘連、腫瘤的發生發展等[4-6]。

漿膜炎是動物傳染病的一類常見臨床表現,包括胸膜炎、腹膜炎、心包炎,引起動物漿膜炎常見的病原包括副豬革拉瑟菌(Glaesserellaparasuis,GPS)[7]、豬鼻支原體(Mycoplasmahyorhinis,Mhr)[8-9]、鴨疫里氏桿菌(Riemerellaanatipestifer)[10]等,給我國養殖業造成嚴重經濟損失。其中Mhr在世界范圍內廣泛感染,可引起多發性漿膜炎、關節炎,給養豬業帶來重大經濟損失[11-12]。細胞模型是病原學研究的重要基礎,本研究以豬腹膜間皮細胞(peritoneal mesothelial cell,PMC)為對象,建立豬原代間皮細胞分離培養方法,并以Mhr作為引起漿膜炎病原的代表將PMC細胞初步用于體外感染試驗,以期為引起豬漿膜炎相關病原的感染致病機制研究提供細胞模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 1～3月齡健康二元雜交豬(長白-大白)。

1.1.2 豬鼻支原體 Mhr 495c強毒株由江蘇省農業科學院獸醫研究所分離并保存。

1.1.3 主要試劑 DMEM/F12培養基、0.25%EDTA-胰酶、特級胎牛血清、鼠單抗白細胞 CD45單克隆抗體、兔抗第Ⅷ因子單克隆抗體購自賽默飛科技有限公司。青霉素、鏈霉素、DAPI、LDH試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司。紅細胞裂解液和膠原酶購自北京索萊寶科技有限公司。鼠抗波形蛋白單克隆抗體、兔抗角蛋白18多克隆抗體、FITC-羊抗兔IgG二抗、Cy3-羊抗鼠IgG二抗購自武漢博士德生物工程有限公司。明膠、DMSO購自西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司。KM2培養基由江蘇省農業科學院獸醫研究所自制。

1.2 方法

1.2.1 豬原代腹膜間皮細胞的分離與培養 無菌采集豬腹腔大網膜組織,放入裝有含雙抗(青霉素100 U·mL-1、鏈霉素100 μg·mL-1)的無菌D-Hanks溶液的離心管中,低溫條件下運送至實驗室。將大網膜組織置于培養皿內,用預冷的D-Hanks溶液洗滌6～8遍。盡量剔除血管和脂肪,將剩余大網膜組織剪成1 cm2大小,加入預熱的0.1% Ⅰ型膠原酶消化液,混勻后置于37 ℃搖床180 r·min-1消化約8 min,期間手動劇烈震蕩一次,而后加入3倍～4倍體積的D-Hanks溶液終止消化。用力震蕩,使細胞從消化的組織中充分釋放出來,棄去消化后的組織,過150目篩網,收集液體于50 mL尖底離心管,300g離心10 min,棄上清。如紅細胞較多,加入紅細胞裂解液室溫處理5 min裂解紅細胞,再用D-Hanks洗滌細胞2次,最終用含15%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)和雙抗的DMEM/F12培養基重懸。將細胞按1×106～2×106·mL-1濃度鋪入25 cm2細胞培養瓶內,置于含5% CO2培養箱37 ℃培養,差速貼壁2次,即貼壁1 h后換新的細胞瓶,再次貼壁1 h,收集上清于15 mL尖底離心管,離心收集細胞,用完全培養基重懸,按3 × 105·mL-1濃度鋪入0.1%明膠包被的25 cm2細胞培養瓶,置于含5% CO2培養箱37 ℃培養。

1.2.2 明膠包被方法 使用無菌PBS配制1%明膠溶液,試驗前用PBS稀釋至0.1%后過 0.22 μm濾器除菌,取3 mL加入25 cm2細胞培養瓶中完全覆蓋瓶底或取500 μL明膠加入24孔板中使其完全覆蓋孔底,4 ℃過夜,次日倒去多余液體并晾干1～2 h即可使用。

1.2.3 細胞傳代培養 當原代細胞的融合度達85%～90%時,需對PMC細胞進行傳代處理。使用無菌PBS潤洗細胞后,向瓶內加入適量0.25%胰酶-EDTA消化液,使其完全覆蓋瓶底,置于37 ℃培養箱內消化2～4 min,消化過程中注意觀察細胞形態變化,當細胞變圓并與瓶底脫離后,加入與胰酶等量的完全培養基終止消化過程。收集瓶內液體于尖底離心管,300g離心10 min,用完全培養基重懸細胞沉淀,按1 × 105·mL-1濃度轉移至2～3個細胞瓶內培養。

1.2.4 腹膜間皮細胞的鑒定

1.2.4.1 光學顯微鏡鑒定:取原代培養的PMC細胞置于光鏡下觀察細胞形態。

1.2.4.2 掃描電鏡鑒定:玻片經滅菌處理后用明膠包被,將細胞按1 × 105·mL-1濃度接種于放置有玻片的6孔板中,待細胞生長至90%融合時,用PBS洗滌細胞3遍,加入2.5%戊二醛電鏡固定液4 ℃過夜固定細胞,PBS洗滌后,用1%鋨酸溶液固定,乙醇梯度脫水,臨界點干燥法干燥,離子濺射,真空噴鍍金后進行掃描電鏡(EVO-LS10)觀察。

1.2.4.3 間接免疫熒光鑒定:將細胞按1×105·mL-1濃度接種于明膠包被的24孔板中,待細胞生長至90%融合時,用PBS洗滌細胞3遍,加入1.25%戊二醛室溫固定10 min,洗滌后用0.2% Triton X-100透化處理5 min,洗滌后加入5%牛血清白蛋白于37 ℃封閉1 h,再加入一抗溶液(波形蛋白、角蛋白18、第VIII因子、CD45抗體),4 ℃孵育過夜,次日洗滌后加入相應的FITC-羊抗兔IgG二抗和Cy3-羊抗鼠IgG二抗,于37 ℃室溫孵育1 h,洗滌后加入DAPI室溫染色10 min,洗滌后于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.5 細胞凍存與復蘇 提前配制細胞凍存液,按50% DMEM/F12基礎培養基、40% FBS、10% DMSO比例配制并混勻。棄去細胞瓶內原培養基,使用無菌PBS潤洗兩遍后,加入適量0.25%胰酶-EDTA消化液置于37 ℃消化,顯微鏡下觀察待消化完全后,加入等量完全培養基終止消化,收集細胞懸液于尖底離心管,300g離心10 min,棄上清。使用已配制好的凍存液重懸細胞沉淀并轉移至凍存管,將凍存管置于凍存盒中,-80 ℃放置過夜,次日轉移至液氮中保存。

細胞復蘇時,取出液氮中的細胞凍存管,迅速置于37 ℃水浴搖晃直至液體融化,將細胞懸液轉移至15 mL離心管中,補加5 mL常溫完全培養基,混勻后,300g離心10 min,棄上清,用完全培養基重懸至5 mL,轉移至25 cm2細胞瓶內,置于含5% CO2培養箱37 ℃培養。

1.2.6 Mhr的培養 取Mhr菌種按1∶9的比例接種于KM2液體培養基中,置于37 ℃細菌培養箱培養,待菌液由紅色變為黃色時,收集菌液或繼續按1∶9比例擴大培養,最終收獲的Mhr菌液分裝凍存于-80 ℃,測定滴度,用顏色變化單位(color change unit,CCU)表示,分裝保存備用。

1.2.7 Mhr感染細胞 將細胞按1×105·mL-1濃度接種于96孔板中,培養至85%～90%融合后進行感染,設置未感染孔為對照組。取凍存的Mhr菌液,12 000g離心20 min,棄去上清,用含1% FBS的DMEM/F12培養基重懸菌體,調整濃度至108CCU·mL-1,按100 μL·孔-1接種于感染組細胞孔中。感染24 h后取出細胞培養板觀察或進行下一步試驗。感染及對照組均設置3個重復孔。

1.2.8 Mhr感染后細胞活力檢測 Mhr感染24 h后,取出96孔板,吸取細胞上清后分裝至離心管,并做好標記,400g離心5 min。分別取各孔的上清液70 μL,加入到新的96孔板相應孔中。將乳酸溶液、10 × INT 溶液、INT稀釋液、酶溶液恢復至室溫。按說明書避光配制LDH檢測工作液,各孔分別加入35 μL的檢測工作液并混勻,室溫避光孵育30 min,然后于490 nm處測定吸光度。

2 結 果

2.1 細胞分離培養及形態學觀察

取健康豬大網膜組織,采用0.1% Ⅰ型膠原酶消化分離豬原代PMC細胞。消化分離的原代細胞貼壁72 h后,使用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態,早期細胞密度低,細胞多伸展,呈拉網狀生長(圖1A);培養4～8 d后,細胞逐漸融合,融合后細胞呈多邊形,大小較為一致,邊緣不齊,似鋪路石狀(圖 1B)。

A. 培養早期的豬腹膜間皮細胞;B. 融合后的豬腹膜間皮細胞A. PMC cells in early culture stage; B. Confluent PMC cells

2.2 超微結構

利用掃描電鏡對F2代細胞進行超微結構觀察,結果如下圖所示,電鏡下細胞較為鋪展,呈橢圓形或多角形,有核處細胞隆起較厚,細胞表面可見大量微絨毛(圖2)。

圖2 掃描電鏡下豬腹膜間皮細胞超微結構(2 000×)Fig.2 Ultrastructure of porcine peritoneal mesothelial cells under scanning electron microscopy (2 000×)

2.3 免疫熒光鑒定

對分離的F2代細胞進行特征性抗原的免疫熒光鑒定,結果顯示,細胞角蛋白18抗原(圖3A)和波形蛋白抗原(圖3B)均呈陽性,符合PMC細胞特征;而第VIII因子相關抗原和CD45抗原呈陰性,由此排除了成纖維細胞、血管內皮細胞和白細胞。PMC細胞純度可達95%。

A. 角蛋白18;B. 波形蛋白A. Cytokeratin 18; B. Vimentin

2.4 傳代培養

細胞傳代培養2～3代時細胞貼壁率、生長速度和形態與初始原代細胞無明顯差異,4～5代開始細胞貼壁率降低、生長增殖變緩,部分細胞膨大、變形,出現衰老現象。體外培養一般可維持到4～6代(圖4)。

A．F2代;B．F3代;C．F5代;D．F6代A. Second generation; B. Third generation; C. Fifth generation; D. Sixth generation

2.5 細胞的凍存與復蘇

細胞經凍存復蘇后,細胞形態仍為典型的鵝卵石形,間皮細胞的純度在90%以上。經凍存復蘇后第6～7天生長至融合(圖5)。

A．凍存細胞復蘇后第2天;B．凍存細胞復蘇后第6天A. The second day after resuscitation of the frozen cells; B. The sixth day after resuscitation of the frozen cells

2.6 Mhr感染誘導豬腹膜間皮細胞損傷

Mhr感染PMC細胞24 h后,光鏡下可觀察到感染組細胞發生明顯皺縮(圖6)。通過LDH試劑盒檢測細胞LDH釋放量,結果如圖7所示,感染組細胞的LDH釋放量較對照組細胞顯著升高(P<0.01)。結果提示Mhr感染對PMC細胞有明顯損傷作用。

A.感染細胞;B.對照細胞A.Infected cells;B.Control cells

**.P<0.01

3 討 論

間皮細胞是研究漿膜炎的主要靶細胞。大網膜是腹膜的最大褶皺,具有高密度的間皮細胞,每平方厘米的網膜組織中可提供一百萬個左右的間皮細胞,能夠獲取相對較多的細胞,因此常用大網膜分離間皮細胞[13]。目前報道的人、大鼠、小鼠等動物的腹腔大網膜間皮細胞分離多用胰蛋白酶進行消化[14-16]。但在豬大網膜間皮細胞分離中,筆者發現胰酶消化法效果不穩定,時間難以控制,容易受到動物日齡和脂肪含量的影響,消化時間過短獲得的細胞少,時間過長則易損傷細胞,或者增加成纖維細胞污染的概率,筆者改用Ⅰ型膠原酶消化,獲得細胞得率和純度更佳。

本研究結果顯示,從大網膜消化的原代細胞在培養初期呈拉網狀生長,不易與成纖維細胞區別,融合后才形成特殊的鋪路石樣外觀,此時可與成纖維細胞明顯區分開來,與人、大鼠等動物腹腔間皮細胞分離時的形態變化過程類似[17-18]。進一步對所分離細胞進行免疫熒光鑒定和掃描電鏡鑒定,波形蛋白和角蛋白-18特征性抗原表達為陽性,細胞表面具有微絨毛,證實了筆者分離的細胞為豬原代PMC細胞。由此,本研究成功建立了豬大網膜PMC細胞的體外培養方法。

為提高培養成功率,在試驗過程中需要注意以下問題:1)選用的試驗豬日齡以3月內為宜。日齡過大的豬腹腔脂肪過多,大網膜是腹腔脂肪堆積的主要部位,過多的脂肪影響間皮細胞的消化,分離不易成功。2)處理組織時盡量摘除血管和脂肪組織,并多次清洗去除多余油脂,組織剪碎至1 cm2左右,組織過大與消化液接觸面積不足,不利于充分消化,剪得過碎消化獲得的細胞中成纖維細胞比例上升。3)根據最終獲得的大網膜組織量,加入適量膠原酶消化,消化液體積以不低于組織體積的3倍為宜。消化液應提前預熱,加入后充分分散組織,置于搖床中震蕩消化。嚴格掌握消化時間,消化結束后及時終止,并充分振搖使細胞從組織碎片中釋放出來。4)消化獲得的細胞通過差速貼壁法去除成纖維細胞,貼壁時間以2 h左右為宜。5)合適的接種密度有利于細胞快速生長并提高細胞純度。如果接種密度過低,細胞不但鋪展速度慢,生長形態差,而且在間皮細胞的間隙處易出現成纖維細胞生長。根據筆者經驗,豬原代PMC 細胞一般接種密度以2×105～5 × 105·mL-1為宜;6)F1代培養時避免換液過早。3 d內不宜挪動細胞,首次換液最好在第3～4天后進行。換液時動作輕柔,貼壁良好時可采用全換液,貼壁不佳時采用半換液。7)用明膠包被細胞瓶更有利于PMC細胞貼壁。8)試驗使用細胞以1～3代為佳,4代以后細胞增殖活力下降,部分細胞形態出現老化現象,可能影響試驗結果的準確性。

Mhr是臨床上引起豬多發性漿膜炎的主要病原之一。本研究嘗試將所分離的PMC細胞用于Mhr感染,結果發現Mhr感染后可造成PMC細胞形態發生明顯的皺縮,細胞活性受損,提示PMC細胞對Mhr感染較為敏感,可成為后續Mhr誘導漿膜炎致病機制研究和疫苗、藥物研究的良好細胞模型。

4 結 論

本研究采集豬大網膜組織,利用膠原酶消化法分離獲得原代細胞,通過形態學和免疫學鑒定為豬PMC細胞,建立了簡便、快捷的豬原代PMC細胞分離和體外培養方法。使用Mhr感染PMC細胞可觀察到明顯的細胞形態變化和LDH釋放量的顯著增加。