牛支原體兔體攻毒模型的建立

武文英,夏 青,胡萌婕,趙逸軒,王 琛,張宇豪,郝成武,賀 筍,郭愛珍,陳建國,2,陳穎鈺*

(1.華中農業大學動物科學技術學院動物醫學院,武漢 430070;2.華中農業大學生豬健康養殖協同創新中心,武漢 430070;3.華中農業大學農業微生物資源發掘與利用國家重點實驗室,武漢 430070;4.天康生物制藥有限公司,烏魯木齊 830011)

牛支原體是牛呼吸道疾病綜合征(bovine respiratory disease,BRD)的主要病原之一[1],能夠引起牛的肺炎、中耳炎、關節炎及乳房炎等[2-3],發病率最高可達100%,死亡率可達50%[4],給養牛業造成了巨大的經濟損失。自1961年首次被發現以來[5],牛支原體病已在世界范圍內廣泛傳播;我國自2008年首次在湖北隨州的牛肺組織中分離到該病原[6],之后在多地出現了該病的報道[7]。牛支原體可感染各個年齡段甚至各種品種的牛[8],其中肉牛和奶牛最為易感,犢牛病情相對嚴重,病死率較高[9]。牛支原體可在牛群中水平及垂直傳播[10]。

目前,牛支原體尚無特效治療藥物。一方面由于缺乏細胞壁[11],青霉素類的抗生素對其敏感性較差。另一方面,抗生素的濫用也導致了新型耐藥菌株的不斷出現[12]。因此,疫苗免疫無疑是一個最佳的選擇。我國目前尚無牛支原體的疫苗問世[13],疫苗評估是疫苗研制過程中的重要環節之一,宿主動物免疫攻毒保護試驗是必不可缺的,因此制備疫苗可再現的攻毒模型是必要的。本體動物牛的成本較高,尋求合適的小動物替代攻毒模型是牛支原體疫苗中必不可缺的步驟之一[14]。

目前,雖然有部分學者在進行小動物模型的研究[15-17],但操作上存在有一定的差別。大多數僅用牛支原體對動物進行直接攻毒。而事實上牛支原體條件致病,在不同免疫條件下動物的臨床發病會存在有差別。因此,為系統研究牛支原體小動物感染模型,本研究以日本大耳白兔為研究對象,不僅采用了牛支原體的單獨感染,同時模擬了免疫抑制及刺激免疫狀態,即用地塞米松降低兔免疫力;利用免疫刺激物巰基乙酸鹽[18]和孔藍蛋白(KLH)[19],刺激免疫,因此能夠更好地模擬臨床上的真實情況。為牛支原體疫苗的研發提供了重要的技術儲備。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 血藍蛋白(Keyhole Limpet Hemocyanin,KLH)、最低基本培養基(minimum essential medium,MEM)、丙酮酸鈉購自美國Sigma公司;瓊脂糖、PPLO肉湯粉、酵母粉購自美國BD公司;酚紅購自上海滬試有限公司;青霉素鈉購自紅寶獸藥有限責任公司;馬血清購自hyclone公司。

1.1.2 菌種、蛋白及實驗動物 牛支原體HB0801株由本實驗室分離保存?？贵w檢測用P579蛋白為本實驗室制備并保存。

健康雄性2月齡日本大耳白兔(約1.5 kg)購于華中農業大學實驗動物中心。通過PCR方法檢測確認無支氣管敗血波氏桿菌、巴氏桿菌、肺炎克雷伯菌以及牛支原體。于試驗前進行7天的安靜飼養,緩解應激。動物試驗經由華中農業大學科學倫理委員會審批符合動物實驗倫理審查要求(倫理編號:HZAURAB-2022-0003)。

1.1.3 PPLO培養基配制 液體培養基:PPLO10.5 g,酵母粉2.5 g,丙酮酸鈉0.5 g,加單蒸水定容至440 mL,121 ℃滅菌15 min,待培養基冷卻后,加入馬血清50 mL,滅菌10×MEM 5 mL,無菌4萬單位·mL-1青霉素鈉溶液5 mL。

固體培養基:PPLO10.5 g,酵母粉2.5 g,丙酮酸鈉0.5 g,瓊脂粉7.5 g,加單蒸水定容至440 mL,121 ℃滅菌15 min,待培養基溫度降至45 ℃左右,加入馬血清50 mL,滅菌10×MEM 5 mL,無菌8萬單位·mL-1青霉素鈉溶液5 mL,然后傾倒平板。

1.2 方法

1.2.1 HB0801攻毒菌株的復蘇及計數 將原代HB0801菌株凍干粉接種于液體PPLO培養基中培養36 h后再以 1∶100 的比例轉接至PPLO液體培養基中。37 ℃靜置培養48 h后以1∶1 000比例再次轉接至PPLO液體培養基中。自24 h起每隔12 h進行倍比稀釋至109,用顏色改變單位(CCU)及平板菌落計數法CFU進行計數[20]。

將培養好的牛支原體高速離心濃縮至1010后置于4 ℃保存,以備攻毒使用。

1.2.2 常見呼吸道病原菌的檢測 利用PCR方法對多殺性巴氏桿菌[21]、肺炎克雷伯菌[22]以及支氣管敗血波氏桿菌[23]進行檢測。

用牛支原體Uvrc(GenBank登錄號:AF003 959.1)特異性片段對牛支原體進行普通PCR檢測[24]。用設計的引物和探針進行熒光定量PCR檢測[25],引物見表1,反應條件及體系見表2。

表1 PCR引物

表2 PCR反應的體系及條件

1.2.3 分組及攻毒 將11只日本大耳白兔分為4組,除對照組2只兔外,攻毒組均為3只。

組1為僅攻擊HB0801組:氣管注射1010CFU·mL-1HB0801株,1 mL·只-1,連續攻擊3 d。

組2為注射地塞米松后攻擊HB0801組:連續5 d肌肉注射地塞米松0.5 mg·kg-1后,第6天開始氣管注射1010CFU·mL-1HB0801株1 mL·只-1,連續攻擊3 d。

組3為攻擊HB0801后注射免疫刺激物KLH和巰基乙酸鹽培養基組:氣管注射1010CFU·mL-1HB0801株,1 mL·只-1,連續攻擊3 d后,再連續3 d肌肉注射KLH 0.1 mg·只-1,同時腹腔注射巰基乙酸鹽培養基1 mL·只-1。

組4為空白對照組:氣管注射PPLO液體培養基連續3 d。

1.2.4 觀察并記錄臨床癥狀 每日觀察各組日本大耳白兔精神狀態、呼吸狀況,口鼻分泌物等臨床癥狀,記錄體溫。

1.2.5 鼻拭子排菌情況檢測 隔天采集兔鼻拭子至無菌PPLO液體培養基中,充分混勻后用0.45 μm[26]濾器過濾,取濾液500 μL接種至等體積PPLO液體培養基中,于37 ℃ CO2培養箱培養2～3 d。將菌液離心后取上清煮沸作為模板PCR擴增Uvrc片段檢測牛支原體。

1.2.6 血清中抗體的檢測 采用本實驗室前期所建立的ELISA抗體檢測法對完成安靜飼養后,進行試驗操作前1天的血清及攻毒后第7、14、21天以及第31天的血清進行抗體檢測[27]。

具體步驟如下:包被P579蛋白0.1 μg·孔-1,4 ℃過夜后充分洗滌,加入50 μL 待檢血清/陰陽性對照以及50 μL酶標單抗,充分混勻后置37 ℃溫育60 min。充分洗滌后加入底物進行顯色,10 min后進行終止。OD450nm讀數。按照以下計算公式,計算阻斷率(PI值)。

PI值=(1-S/N)×100%,其中,S=樣品OD450nm值;N=陰性對照血清OD450nm平均值。

判定:試驗成立的條件陰性對照血清OD450nm平均值>0.65,且<2.0,陽性對照血清PI值均>60%,則判為試驗成立。

結果判定:待檢樣品PI值≥40%時,判為陽性;待檢樣品PI值<40%時,判為陰性。

1.2.7 肺部病理變化的評分及病理切片的制作 于攻毒后第31天將所有日本大耳白兔進行剖殺。觀察并記錄大體病變情況,并依據實變型肺部評分標準(LLS)對肺組織進行評分[28]。

評分標準:在LLS方案中,根據肺葉的大小,每個肺葉被分成幾個三角形(每個尖葉和中葉7個,每個膈葉19個,附屬葉8個)。每葉受影響的三角形數乘以5,再除以每葉的三角形數(完全受這些病變影響的葉的得分為5)。LLS的最高分為30分(每葉5分)。兔肺包括左尖葉、左膈葉、右尖葉、右中葉、右膈葉和心葉。

在眼觀變化明顯的組織交界處無菌采集約為1 cm3的肺部組織4%多聚甲醛-PBS 緩沖液中進行固定后制作HE染色切片。

1.2.8 肺組織中牛支原體的檢測 無菌條件下,取病變肺組織 0.5 g 進行充分勻漿,離心后取上清過濾,接種至PPLO液體培養基中,置于37 ℃含有5% CO2培養箱中培養 72 h后觀察培養基顏色變化。

2 結 果

2.1 HB0801攻毒菌株的復蘇及計數

復蘇后的牛支原體于36 h時可達到109CCU·mL-1及3.67×109CFU·mL-1。符合攻毒濃度要求。

2.2 臨床癥狀的觀察

各攻毒組兔均表現為精神狀態變差,食欲下降,體溫無顯著變化。對照組兔均表現正常。

攻毒組中,組2臨床變化最為顯著,一只明顯流涕(圖1A),另一只鼻腔出現肉眼可見白色分泌物(圖1B)。

A.流涕;B.鼻腔有白色分泌物A. Runny nose; B. White nasal discharge

2.3 鼻拭子中排菌情況檢測

隔天對鼻拭子中牛支原體的排菌情況進行檢測。檢測結果如表3所示。PCR結果顯示,各攻毒組于攻毒后第1天均可以檢測到牛支原體,組1表現為間歇性排菌,雖然第1天有2/3的兔檢測為陽性,但第3～5天均為陰性,第7～11天也僅有1/3的兔檢測為陽性。表明該模型不能有效誘導穩定的排菌。

表3 PCR檢測鼻拭子中牛支原體

組2雖然僅在攻毒后第1和3天檢測到陽性,但所有的兔均表現為排菌,表明該模型穩定性較好。

組3僅第1天和第9天有1/3的兔檢測到了牛支原體。

空白組均未檢測到牛支原體。

2.4 血清中抗體的檢測

對攻毒前及攻毒后第7、14、21、31天的血清進行抗體檢測,結果顯示(表4),組1自攻毒后第7天有1只兔開始檢測到抗體,至第21天所有兔均為抗體陽性。

表4 血清ELISA檢測結果

組2自攻毒后第7天開始,有2只兔檢測為抗體陽性,隨后所有兔轉陽。表明該模型能夠誘導較好的抗體水平。

組3抗體水平呈現波動,僅第7、21和31天能夠檢測到部分兔的抗體。

空白對照組均為抗體檢測陰性。

2.5 肺部病理變化

于攻毒后第31天對所有兔進行剖殺。發現各攻毒組兔肺均出現不同程度的病變。組1中各組兔均有不同程度的淤血,組2除有明顯出血外,有2只兔有明顯肉變(圖2)。組3除1只兔有肉樣變化外,其它僅有淤血。組4肺部無顯著病理變化。依據評分標準對各肺臟進行評分,結果顯示(表5),在各攻毒組中,組2評分最高,為2.82分。

圖2 組2兔肺部多處出現肉樣病變Fig.2 Multiple fleshy lesions in the lungs of group 2 rabbits

表5 各組兔肺臟得分

進一步的病理切片結果(圖3)顯示,各攻毒組均表現為肺泡壁增厚,肺泡Ⅱ型上皮細胞增生,大量炎性細胞聚集,巨噬細胞浸潤,有炎性滲出物,符合牛支原體造成的間質性肺炎的病變特征[29]。

圖3 各組兔肺病理切片Fig.3 Pathological sections of the lungs from rabbits of each group

該部分研究結果顯示,用地塞米松誘導后再進行牛支原體的攻毒能夠引起最顯著的病理變化。

2.6 肺組織中牛支原體的檢測

在肺組織中,各組兔均未檢測到多殺性巴氏桿菌、肺炎克雷伯菌以及支氣管敗血波氏桿菌。僅組2的一只兔用PCR及熒光定量PCR檢測均為陽性。其他組均未檢測到陽性。詳見圖4。

圖4 熒光定量PCR結果Fig.4 The result of qPCR

3 討 論

牛支原體對于宿主的特異性要求較高,動物模型復制成為制約牛支原體疫苗研究的瓶頸問題。前期的研究顯示,用雞胚作為替代動物,雖有較好的致死性,但是缺乏較好的評價指標,臨床癥狀、抗體水平等不明顯。小鼠作為動物模型既不能引起明顯的臨床癥狀,也無顯著病理變化[30]。選用兔作為牛支原體的代替模型,相較于其他動物有較好的易感性和臨床意義[16]。

本試驗采取氣管注射的方法攻毒兔,設置地塞米松免疫抑制組和KLH和巰基乙酸鹽培養基作為免疫刺激物的組別,模擬在實際情況中,牛支原體作為條件致病菌,常在應激條件下由于免疫力下降時造成的繼發感染[31]。利用藥物降低動物的免疫力達到一定的攻毒效果,是之前試驗均沒有嘗試過的,這樣做是為了盡可能地貼合實際情況,誘發更為典型的病理變化。

綜合臨床癥狀、排菌、抗體及大體病變等各項指標,用地塞米松誘導后再進行HB0801攻毒確實表現出了穩定的攻毒效果,能夠誘導出流涕、鼻腔出現白色分泌物等臨床癥狀,能夠導致尖葉和心葉的肉樣變,使得肺泡壁增厚,Ⅱ型肺泡細胞增生,出現纖維素性滲出以及巨噬細胞浸潤等病理現象;病原和免疫反應方面,能夠出現穩定的排菌和較長的抗體持續時間。但與自然感染患牛相比,體溫未出現明顯升高,肺部的實質性病變也不夠明顯[32]。

4 結 論

綜合本研究結果,得出以下結論:1)日本大耳白兔感染牛支原體模型建立成功。2)地塞米松造成免疫抑制后連續3 d,每天每只兔氣管攻毒1 mL濃度為1010CFU·mL-1的牛支原體HB0801株的感染模型最好。