致腦膜炎豬鏈球菌2型的分子分型鑒定及其生物學特性

李芃緒,李世景,孫 駿,項 維,趙苗苗,侯天牧,李華明,廣 敏,陳瑞格,徐夢然,吳曉敏,姜合祥,雷連成,,張付賢*

(1.長江大學動物科學技術學院,荊州 434023;2.吉林大學動物醫學學院,長春 130062)

豬鏈球菌(Streptococcussuis,SS)是一種重要的革蘭陽性人畜共患病原菌,在世界各地廣泛分布,可通過侵入黏膜和傷口等途徑感染牛、馬、狗和魚等多種動物和人[1-2]。基于不同的莢膜多糖抗原,SS目前主要被分為29個血清型;感染豬的SS血清型主要是1～9型、1/2型和14型,亞洲主要流行血清型2、3和4等,血清型9主要在歐洲流行[3-6]。多序列位點分型(multilocus sequence typing,MLST)也常被用于豬鏈球菌的分類依據,目前已超過1 000個STs 被鑒定[7]。在已報道的豬鏈球菌感染病例中,豬鏈球菌2型(Streptococcussuisserotype 2,SS2)是臨床分離比例最高、也被認為是毒力最強的血清型。SS2在感染人和豬時具有感染率高、發病急、感染宿主可導致不可逆轉的后遺癥等特點,其在嚴重危害我國養豬業發展的同時,也給公共衛生安全帶來了潛在的巨大威脅[4-5]。

SS2通常定植在被感染豬的呼吸道、扁桃體等部位,通過口鼻感染、接觸傳播,引起敗血癥、心內膜炎,關節炎和腦膜炎等病癥,嚴重的可引發腦膜炎、敗血癥甚至致死[8-9];近年來從臨床上人和豬感染SS2病例中,腦膜炎型豬鏈球菌病的比例有明顯上升趨勢[10-11]。但是臨床的病例,鮮見對豬源致腦膜炎SS2進行MLST分子分型鑒定,以及致病性和耐藥性系統性研究的報道。本研究從湖北某養殖場患呼吸道病豬的腦組織中分離到一株SS2,命名為PX0923。通過MLST對其進行分型鑒定,結合致病性、生物被膜形成能力和抗生素、中藥敏感性分析系統性研究分離菌株的生物學特性,為進一步探究SS2的致腦膜炎機理和臨床上SS2感染的防控、精確診斷和有效治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試劑和中藥藥材

牛腦心浸出液(BHI)培養基、瓊脂粉等購自國藥基團化學試劑有限公司;胰酪胨大豆羊血瓊脂購自青島高科技工業園海博生物技術有限公司;細菌基因組提取試劑盒,病毒基因組提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司;DL2000 DNA Marker購自北京聚合美生物科技有限公司;革蘭氏染色劑購自北京索萊寶生物科技有限公司;Taq酶購自上海碧云天生物技術有限公司;抗生素藥敏片均購自杭州微生物試劑有限公司;實驗所使用相關引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

33種中草藥:羌活、蘇子、板藍根、羅漢果、桑皮、桔梗、丁香、金銀花、胖大海、天竹黃、川貝母、連翹、魚腥草、半夏、鶴藤、秦皮、朱砂、大青葉、黃連、炒僵蠶、黃芩、檳榔、蒲公英、灸白附子、五倍子、荊芥、款冬花、薄荷、烏梅、熟大黃、三七、菊花和全蝎,以上中藥均購自南京同仁堂大藥房。

1.2 病例描述

2021年12月至2022年2月,湖北某生豬養殖場,部分仔豬出現精神沉郁、氣喘、呼吸困難肌肉抽搐和后肢震顫、滑動等臨床表現。剖檢病死豬,可見胸腔和腹腔積液,肺臟充血水腫,脾臟出血,腦膜明顯充血、出血。使用抗生素慶大霉素和卡那霉素的治療效果不理想,反復用藥后病情不穩定。

1.3 病原檢測

無菌條件下解剖病死豬,采集病豬的肺、肝、腦和脾等病變組織(約200 mg)于RNase free的1.5 mL EP管中研磨加無菌PBS勻漿,使用細菌與病毒基因提取試劑盒提取樣品的基因組。合成的豬常見呼吸道疾病病原:豬圓環病毒2型(PCV2)、副豬嗜血桿菌(HPS)、多殺性巴氏桿菌(Pm)和胸膜肺炎放線桿菌(APP)的特異性引物[12-13]以及用于擴增豬鏈球菌gdh基因和recN基因的特異性引物[14](表1),使用反轉錄試劑盒反轉錄病毒RNA,以細菌和病毒DNA以及反轉錄產物作為病原檢測模板,采用20 μL PCR擴增反應體系: DNA模板1 μL,上下游引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL,2×Taq PCR Master Mix酶 10 μL,ddH2O 8 μL。PCR的擴增條件:95 ℃預變性5 min;95 ℃變性30 s,退火1 min,72 ℃延伸30 s,循環數34;72 ℃終延伸10 min。擴增產物經1.5% 瓊脂糖凝膠電泳,120 V電泳30 min。

表1 PCR鑒定豬常見病原的引物序列

1.4 細菌分離和鑒定

取病豬的腦組織劃線接種于含5% 胎牛血清的BHI固體培養基中,于37 ℃恒溫培養箱中培養18 h。根據病原檢測結果按細菌形態挑選可疑菌落再次PCR鑒定,按照鑒定結果挑取可疑菌落純化3代,觀察其菌落形態。取純化3代后的疑似豬鏈球菌菌落涂板并進行革蘭染色,在光學顯微鏡下觀察其形態特征。收集純化后的疑似豬鏈球菌菌液,無菌PBS清洗3次后,棄液,使用2.5%戊二醛重懸并于4 ℃冰箱中固定過夜,ddH2O清洗3次后冷凍干燥,在掃描電鏡下觀察其形態。

1.5 病原菌的16S rRNA基因測序以及系統進化樹的構建

根據病原檢測以及形態學觀察結果取純化三代后的疑似豬鏈球菌菌落,以細菌16S rRNA基因通用引物27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′與1492R:5′-TACGCTACCTTGTTACGACTT-3′進行PCR擴增。采用50 μL反應體系:DNA模板1 μL;2×Taq PCR Master Mix酶25 μL,上、下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL,ddH2O 22 μL。擴增條件:95 ℃預變性5 min;95 ℃變性30 s,50 ℃退火1 min,72 ℃延伸30 s,循環數34;72 ℃終延伸10 min。PCR產物經1.5% 瓊脂糖凝膠電泳后,目的條帶切膠回收送武漢生物工程有限公司測序。測序結果使用NCBI BLAST網站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行比對分析。選取與分離菌株同源性強且為豬鏈球菌屬的其他菌株16S rRNA基因序列,通過Mega.11軟件的MUSCLE功能對多重序列進行對齊排列,并使用鄰接法(Neighbor-Joining)構建分離菌株基于16S rRNA基因的系統進化樹,Bootstrap 1 000次檢查進化樹可信度,在ITOL網站(https://itol.embl.de/)構建系統進化樹。

1.6 病原菌的血清型鑒定

合成針對谷氨酸脫氫酶基因(glutamic acid dehydrogenase,gdh)的引物(表2),根據PCR產物大小鑒別豬鏈球菌的血清型[15-16]:如果條帶為575 bp,表明分離菌株是2型或1/2型;條帶為440 bp,表明分離菌株為1型或14型;條帶為250 bp,表明為7型;條帶為390 bp,表明分離菌株為9型。鑒于普通PCR無法區分血清2型和血清1/2型,也無法區分1型和14型,采用基于聚合酶鏈式反應限制性片段長度多態性(PCR-restriction fragment length polymorphism, RCR-RFLP)的cpsK基因多態性檢測方法進行鑒別[17];合成SS2莢膜抗原基因簇cpsK的特異性引物(表2),以提取的分離菌株的基因組為模板進行PCR,擴增產物以限制性核酸內切酶BstNⅠ進行酶切,酶切產物經1.5% 瓊脂糖凝膠電泳。判定標準:如果酶切后僅出現大小為486 bp的一條帶,則表明分離菌株血清型為1/2型或1型;如果酶切產物出現大小為347 bp與139 bp的兩條帶,則表明分離菌株的血清型為2型或14型;綜合上述兩種方法判定分離菌株的血清型。

表2 PCR鑒定分離株血清型引物的序列

1.7 Multilocus sequence typing (MLST)分析

檢索MLST數據庫網站(https://pubmLst.org/organisms/streptococcus-suis)合成用于擴增豬鏈球菌的7個管家基因aroA、cpn60-L、dpr、gki、mutS、recA和thrA的引物[18],PCR反應產物進行測序,將測序結果上傳至MLST數據庫中查找等位基因的編號,進而確定分離菌株的 ST 型別,并利用PHYLOViZ Online網站(https://online.phyloviz.net/index)對豬鏈球菌的ST 型進行分組和聚類,繪制MLST最小生成樹。

1.8 致病性試驗

1.8.1 毒力基因檢測 合成豬鏈球菌的8種毒力基因:細胞外蛋白因子(extracellular protein factor,EPF),溶菌酶釋放蛋白(muramidase-released protein,MRP),溶血素(suilyin,SLY),甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH),表面膜蛋白(fibronectin binding proteins,FBPS),orf2,sao和89K的特異性引物[19-20],以及與豬鏈球菌2型的毒力相關基因簇nmt的引物nadR、pnuC、nutT[21](表3),以提取的分離株的DNA為模板,PCR擴增產物經1.5% 瓊脂糖凝膠電泳。

表3 ST7型豬鏈球菌的部分信息

1.8.2 溶血性試驗 取分離株純培養物,用接種環劃線接種于胰酪胨大豆羊血瓊脂平板上,37 ℃孵育48 h后觀察平板的溶血情況,分析分離株產生溶血素的能力。

1.8.3 小鼠感染試驗 健康SPF昆明系雄性小鼠60只,體重25 g±1.8 g,購自湖北宜昌三峽大學實驗動物中心;暫養3 d,檢測確認無特定病原后用于人工感染試驗。挑取分離菌株培養至對數生長期(OD600 nm=0.6,5 h),進行梯度稀釋和活菌計數后,4 000 r·min-1離心10 min收集菌體,用無菌PBS重復洗滌3次,最后以無菌PBS重懸調整至攻毒濃度:4.3×1010、4.3×109、4.3×108、4.3×107、4.3×106CFU·mL-1。將小鼠隨機分為6組,每只腹腔注射0.5 mL菌液,對照組腹腔注射同體積無菌PBS。攻毒后連續觀察7 d,記錄顯著的臨床癥狀和死亡情況,根據改良寇氏法統計分離菌株的 LD50[22]。解剖死亡小鼠,采集死亡小鼠的病變組織,進行致病菌的分離和鑒定;無菌條件下采集死亡小鼠的心、肝、脾、肺、腎和腦,勻漿后以平板法統計組織細菌載量;固定具有典型病變的腦、肺、肝組織,制成石蠟切片后鏡檢觀察。

1.9 耐藥性試驗

1.9.1 生物被膜形成能力測定 采用剛果紅瓊脂培養基法分析分離菌株是否有形成生物被膜的能力[23]。以大腸桿菌O157作為質檢菌,檢測剛果紅瓊脂實驗的有效性;取10 μL對數生長期的菌液,均勻滴在剛果紅瓊脂上,37 ℃恒溫培養24 h后觀察菌落形態。如果菌落形態呈鋸齒狀或光滑的白色則表明菌株缺乏胞外多糖基質和纖維蛋白的生成,沒有生成生物被膜的能力;如果菌落形態為紅色或黑色、干燥且邊緣卷曲則說明菌株形成胞外多糖基質和纖維蛋白較多,具有生成生物被膜的能力。同時以結晶紫染色法來定量測定分離菌株形成生物被膜的能力。取200 μL對數期的菌液加入96孔細菌培養板,37 ℃恒溫培養48 h后棄去培養基,加入200 μL 4%多聚甲醛固定15 min,清洗風干后加入200 μL 0.1%結晶紫室溫染色10 min,經無水乙醇脫色后使用酶標儀測定每孔的OD570 nm值。依據ODc的值(ODc的值為對照組OD570 nm的平均值)判定分離菌株生物被膜形成能力:OD≤ODc,為無成膜能力;ODc4ODc,為強成膜能力。

1.9.2 耐藥基因檢測 合成針對各種抗生素耐藥基因的引物[24-29]:四環素的tetC、tetM、tetA基因,氟喹諾酮的grvA、grvB基因,紅霉素的ermF、ereD基因,氨基糖苷類的aadA1、aadB基因,磺胺類的sul1、sul2基因,β-內酰胺類的bla-IMP、bla-TEM、bla-SHV、bla-CTX、bla-OXA、bla-DHA、β-KPC、β-HDM基因,林可霉素的1nuH基因,PCR的方法來篩查分離株耐藥基因攜帶情況。

1.9.3 抗生素敏感性試驗 采用Kirb-Bauer(K-B)紙片擴散法分析分離菌株對不同抗生素的敏感性。在以金黃色葡萄球菌ATCC25923驗證藥敏片的有效性后,取分離純化后菌株的純培養物均勻涂布在BHI瓊脂平板上,將抗生素藥敏片分別貼在培養基標記處,于37 ℃恒溫培養箱中培養24 h。測量形成抑菌圈的直徑,藥敏試驗重復3次,根據抑菌圈直徑大小判斷分離菌株對藥物的敏感程度。

1.9.4 中藥抑菌和最小抑菌濃度(minimal inhibit concentration,MIC)的測定 分別稱取中草藥,以煎煮法制備終濃度為1 g·mL-1的中藥藥液,經121 ℃、滅菌20 min,4 ℃保存備用。將空白藥敏紙片浸泡在中藥藥液中,待浸透后風干備用。取對數生長期的分離菌株涂布平板,將含中藥的紙片均勻貼在平板上,并以含抗生素的藥敏片作為對照;37 ℃ 靜置培養 24 h,分別測量抑菌圈直徑;試驗重復3次,計算平均值,評估分離菌株對中藥藥液的敏感性;以96孔板微量稀釋法測定待測中草藥對分離菌株的MIC[30]。

2 結 果

2.1 病原的分離和鑒定

病豬組織的病原篩查PCR結果顯示,病料中胸膜肺炎放線桿菌、多殺巴氏桿菌、豬圓環病毒2型、副豬嗜血桿菌均為陰性,豬鏈球菌的gdh基因和recN基因的檢測均呈陽性反應,且條帶大小與陽性模板所擴增出的條帶大小一致(圖1A),判定該豬場病豬疑似由豬鏈球菌感染引起。革蘭染色結果表明,分離菌株為革蘭陽性菌,多為成對或成鏈狀排列的菌體(圖1B);在平板上可見灰白色邊緣整齊的圓形菌落(圖1C);掃描電鏡下,分離菌株似卵圓形或短桿狀,呈鏈狀平行延伸(圖1D);分離菌株的形態及生長特性與《伯杰氏細菌鑒定手冊》中豬鏈球菌的特性相符。將16S rRNA引物所擴增出的1 500 bp左右大小的條帶進行測序,基因序列進行同源序列比對分析結果如圖1E所示,在系統進化樹中分離株與三株豬鏈球菌(115737.1、038918.1和117504.1)匯成一支,親緣關系最近;與2型豬鏈球菌S735(GenBank No.:NR 036918.1)相似性達到99%以上,基因序列的相似性最高;結合分離菌株的形態、生理生化結果,確定分離菌株為豬鏈球菌,命名為PX0923。

表4 分離菌株的藥敏試驗結果

表5 中藥抑菌結果

2.2 豬鏈球菌的血清學鑒定

血清型鑒定的PCR結果如圖2A所示,以PX0923基因組為模板,gdh的引物擴增出575 bp左右的條帶,表明分離菌株PX0923為豬鏈球菌血清2或1/2型,排除14型;cpsK的特異性引物擴增出486 bp的條帶,酶切后電泳呈現出大小為347 bp與139 bp的兩條帶(圖2B),表明分離菌株的血清型為2型或14型;綜合上述兩種血清型鑒定結果,判定豬鏈球菌PX0923的血清型為2型。

A. gdh基因擴增結果(M1. DL2000 DNA相對分子質量標準;1. gdh基因陰性對照;2. 分離菌株);B. PCR-RFLP結果(M2. DL2000 DNA相對分子質量標準;3. cpsK基因陰性對照;4. PCR結果;5. BstNⅠ酶切結果)A. gdh gene amplification results (M1. DL2000 DNA marker; 1. gdh gene negative control; 2. Isolated strain); B. PCR-RFLP results (M2. DL2000 DNA marker; 3. cpsK gene negative control; 4. PCR result; 5. Digestion result by BstNⅠ)

2.3 MLST分型

對分離株PX0923的管家基因(aroA、cpn60-L、dpr、gki、mutS、recA、thrA)進行測序, 結果上傳至MLST網站,7個等位基因的編號分別為1、1、1、1、1、1、3,確定PX0923屬于ST7型豬鏈球菌。數據庫中ST7型豬鏈球菌株主要分布在中國,宿主為人和豬(表3)。在MLST數據庫中下載186個菌株信息包括166種ST型別,使用 PHYLOViZ 軟件對豬鏈球菌進行分組聚類分析,結果如圖3 所示,ST7型與ST1型豬鏈球菌(ID:3150)匯聚為一支,二者具有較近的親緣關系。

圖3 MLST分析Fig.3 MLST analysis

2.4 致病性分析

2.4.1 毒力基因檢測結果 根據各對毒力基因引物的擴增結果顯示,分離株PX0923攜帶有7種毒力基因:epf、mrp、sly、gapdh、fbps、orf2和sao,其毒力基因型為:epf+/mrp+/sly+/gapdh+/fbps+/orf2+/sao+/89K-(圖4A);與此同時,PX0923的nadR、pnuC和nutT基因均擴增出相應條帶,表明PX0923同時攜帶有豬鏈球菌2型特有的nmt毒力基因簇,進一步確定分離株PX0923為豬鏈球菌2型,且PX0923可能具有一定的致病性。

A. 分離株毒力基因與毒力基因簇的篩查結果(M. DL2000 DNA相對分子質量標準;1. epf;2 mrp;3. sly;4. orf;5. gapdh;6. fbps;7. sao;8.89K;9. nadR;10. pnuC;11. nutT);B. 血平板溶血試驗結果;C. 攻毒組小鼠狀態;D. 攻毒組小鼠眼部;E. 對照組小鼠狀態;F. 對照組小鼠眼部;G. 組織細菌載量;H. 存活曲線A. Screening results of virulence genes and virulence gene cluster of isolates (M. DL2000 DNA marker; 1, epf; 2. mrp; 3. sly; 4. orf; 5. gapdh; 6. fbps; 7. sao; 8. 89K; 9. nadR; 10. pnuC; 11. NutT); B. Blood plate hemolysis test results; C. The status of mice in the challenged group; D. Eyelids of mice in the challenged group; E. The status of mice in the control group; F. The eyelids of control group mice; G. Tissue bacterial load; H. Survival curve

A. 對照組與攻毒組(4.3×1010CFU·mL-1)腹腔與胸腔觀察;B. 對照組、低劑量組(4.3×107CFU·mL-1)和高劑量組(4.3×1010CFU·mL-1)肺、腦和肝觀察;C. 對照組與攻毒組(4.3×1010CFU·mL-1)肺(100×)、腦(100×)和肝(400×)組織切片觀察A. Control group and drug attack group (4.3×1010CFU·mL-1) observation of abdominal and thoracic cavities; B. Observation of the lung, brain, and liver in the control group, low-dose group (4.3×107CFU·mL-1), and high-dose group (4.3×1010CFU·mL-1); C. Observation of lung (100×), brain (100×), and liver (400×) tissue sections in the control group and the attack group (4.3×1010CFU·mL-1)

2.4.2 溶血性試驗結果 分離株PX0923在綿羊血平板上37 ℃培養48 h后,在菌落周圍形成直徑0.5 ～1 mm、草綠色的圓形溶血環(圖4B),該區域紅細胞未完全溶解,呈現出α型溶血的典型特點,表明分離菌株PX0923在綿羊血平板上具有α溶血活性。

2.4.3 回歸試驗結果 攻毒12 h后,4.3×1010CFU·mL-1攻毒組小鼠出現明顯的精神沉郁、被毛凌亂,肛門處出現糞便黏著(圖4C),眼瞼有黏性分泌物(圖4D);攻毒24 h后,對照組小鼠精神狀態正常,未出現死亡(圖4E、F);4.3×1010CFU·mL-1攻毒組小鼠全部死亡,4.3×109CFU·mL-1攻毒組共計死亡小鼠8只;其他攻毒組小鼠出現輕微的臨床癥狀,未見小鼠死亡(圖4H);經統計,分離株PX0923的LD50為1.08×109CFU·小鼠-1。從死亡小鼠的肝、脾、肺、腎和腦組織中分離出致病菌,經鑒定為攻毒菌株PX0923,對照組中未發現攻毒菌株;死亡小鼠心、肝、脾、肺、腎和腦的組織菌載量分別為9.35×105、6.48×105、3.81×106、1.53×106、2.14×106和5.28×104CFU·mg-1,其中脾中的組織載量最高(圖4G),表明PX0923具有一定的組織嗜性。

剖檢死亡小鼠,發現其腹腔、胸腔內有大量淡紅色液體,4.3×107CFU·mL-1組與4.3×1010CFU·mL-1組小鼠的肺和腦組織均出現不同程度的出血,4.3×107CFU·mL-1組小鼠肝上出現白色干酪樣病變,4.3×1010CFU·mL-1組呈現黃白相間的花紋樣肝(圖5A、B)。病理組織學觀察發現,攻毒組小鼠肺泡壁增厚且肺泡囊中充滿紅細胞;軟腦膜充滿大量紅細胞;肝細胞發生脂肪變性,胞質呈現空泡狀且細胞核偏向一側(圖5C),表明感染分離菌株PX0923具有一定的致病性,可導致小鼠腦膜炎、肺和肝等組織嚴重的損傷。

2.5 耐藥性分析

2.5.1 生物被膜形成能力 大腸桿菌O157在在剛果紅瓊脂上生成灰白色、邊緣鋸齒狀的菌落(圖6A),表明大腸桿菌O157沒有生成生物被膜的能力,證明剛果紅瓊脂有效。如圖6B所示,分離株PX0923在剛果紅瓊脂上形成了暗紅色且邊緣卷曲、隆起、干燥的菌落,表明分離株PX0923具有生成生物被膜的能力。結晶紫染色試驗顯示,在無水乙醇脫色后測得分離株PX0923組OD570 nm的平均值為0.406,對照組OD570 nm的平均值為0.167(圖6C),判定分離菌株PX0923具有中等成膜能力。

A. 大腸桿菌O157在剛果紅瓊脂平板上的菌落形態;B. 分離株PX0923在剛果紅瓊脂平板上的菌落形態;C. 結晶紫試驗結果;D. 分離株耐藥基因篩查結果(M. DL2000 DNA相對分子質量標準;1. tetC;2. tetM;3. tetA;4. gryA;5. gryB;6. ermF;7. ereD;8. aadA1;9. aadB;10. sul1;11. sul2;12. bla-IMP;13. bla-TEM;14. bla-SHV;15. bla-CTX;16. bla-OXA;17. bla-DHA;18. β-KPC;19. β-HDM;20. lnuH)A. Colony morphology of Escherichia coli O157 on Congo red agar plate; B. Colony morphology of the isolated strain on Congo red agar plate; C. Results of crystal violet experiment; D. Screening results of drug resistance genes in strain (M. DL2000 DNA marker; 1. tetC; 2. tetM; 3. tetA; 4. gryA; 5. gryB; 6. ermF; 7. ereD; 8. aadA1; 9. aadB; 10. Sul1; 11. Sul2; 12. bla-IMP; 13. bla-TEM; 14. bla-SHV; 15. bla-CTX; 16. bla-OXA; 17. bla-DHA; 18. β-KPC; 19. β-HDM; 20. lnuH)

2.5.2 耐藥基因檢測結果 耐藥基因篩查結果顯示,分離菌株PX0923攜帶aadA1和bla-TEM2種耐藥基因,其余耐藥基因的篩查結果為陰性(圖6 D),表明該分離株PX0923具有一定的耐藥性。

2.5.3 抗生素敏感性試驗結果 金黃色葡萄球菌 (ATCC25923)為質控菌株進行的藥敏試驗,結果證實藥敏片有效。抑菌圈直徑測量發現,慶大霉素、卡那霉素、新霉素、阿米卡星、克林霉素、多黏菌素、呋喃唑酮、多西環素、四環素、美滿霉素、麥迪霉素和頭孢拉定等12種藥物對PX0923的抑菌圈直徑均≤15 mm,表明PX0923菌株對以上抗生素均耐藥;對諾氟沙星、青霉素、阿莫西林、頭孢他啶和氨芐西林5種抗生素中介;對環丙沙星、氧氟沙星、頭孢哌酮和頭孢唑林4種抗生素的抑菌圈直徑均>20 mm,表明分離菌株PX0923菌株對上述4種抗生素均敏感;以上結果表明,分離菌株PX0923為多重耐藥菌株。

2.5.4 中藥抑菌試驗結果 中藥體外抑菌試驗結果顯示,全蝎對分離菌株的抑菌直徑為25 mm,大于20 mm,表明其對PX0923抑菌作用較強,為極度敏感;三七的抑菌直徑為14 mm,對PX0923抑菌作用為中度敏感;在中藥最小抑菌濃度的試驗中,全蝎的最小抑菌濃度為3.91 mg·mL-1,三七的最小抑菌濃度為125 mg·mL-1;其余中藥提取液對分離菌株PX0923無顯著抑制效果。

3 討 論

豬鏈球菌在感染人的病例中,主要以SS2感染居多,少數為1、4、5、9、14、16、21、24和31血清型所致[26,31-32]。研究發現,當前在SS的諸多MLST型別中,世界范圍內流行的豬鏈球菌主要是ST1、ST7和ST28,其中ST1和ST7是感染人的主要菌株型[8]。除此之外,最近在我國的不同地方發現了豬鏈球菌新的ST型,如ST658、ST242、ST377、ST1131和ST665等;這些新發現的ST型目前僅出現在人類感染的病例中,尚無人與人之間傳播和流行的直接證據[28]。本研究從患呼吸道疾病豬腦組織中分離的PX0923經16S rRNA測序、PCR和PCR-RFLP鑒定為SS2,這與流行病學調查中亞洲主要流行血清型2、3和4的研究結果相一致。分離菌株PX0923進一步經分子分型鑒定為ST7型,這也與SS在世界范圍內的分子分型的流調結果一致[7,29]。在已報道的ST7型豬鏈球菌中,均分布在國內,來源于人和豬的組織。2022年,熊衍峰等[33]首次發現江西省贛州市人源ST7型豬鏈球菌(血清2型)病例;本研究從患病豬的腦組織中分離出可導致腦膜炎的ST7型豬鏈球菌(血清2型),目前尚未見報道。豬源和人源ST7型豬鏈球菌(血清2型)病例的發現,提示SS2作為一種人獸共患病病原,不管是經典菌株型,還是新型菌株,其在人和動物及環境中的傳播,結合其致病性和耐藥性的潛在威脅,應引起高度的重視,開展深入、系統的流調和致病機制研究,防患于未然。

據統計,豬鏈球菌可產生百余種不同的毒力因子,主要分為四大類:細菌表面成分/分泌分子、酶、轉錄因子/調節系統、轉運因子/分泌系統。EPF、MRP和FBPS屬胞外蛋白,MRP是SS主要的黏附素,FBPS是細菌黏附的底物,這些毒力因子均與細菌的侵染相關;研究發現,毒力基因型為mrp+epf+的菌株大多為強毒株,常引起豬典型的腦膜炎和關節炎。SLY是一種巰基活化類毒素,研究發現其可能在SS侵入和裂解細胞的過程中發揮重要作用;GAPDH與SS黏附宿主細胞有關[34-35]。本研究的分離的豬源ST7型分離株PX0923攜帶7種毒力基因[36]:epf、mrp、sly、gapdh、fbps、orf2和sao,以及SS2特有的毒力基因簇nmt。人工感染試驗中,攻毒組小鼠腹腔、胸腔內有大量淡紅色液體,肺組織出現顯著病變,這與自然發病豬胸、腹腔積液的臨床癥狀相一致。分離菌株所攜帶毒力因子的致病作用與本研究致病性試驗中小鼠的臨床癥狀相符合。豬源ST7型分離株PX0923可致小鼠出現腦膜炎、脾和肝出血等多器官損傷,這可能與其攜帶的毒力因子mrp、epf、sly和gapdh有關,也與分離菌株本身具有的α溶血活性相關。經病理組織學分析,分離菌株能夠導致腦和肺等組織器官出血、肝細胞發生脂肪變性和細胞質空泡化等病理變化,進一步說明分離菌株具有一定的致病性。高劑量感染分離株PX0923可導致小鼠死亡,同時從死亡小鼠的脾、肺、肝等器官中均可分離到攻毒菌株,印證了豬源ST7型豬鏈球菌(血清2型)與湖北某豬場暴發的呼吸道疾病的關聯性。

鑒于養殖場呼吸道疾病抗生素治療效果不理想的情況,本研究通過藥敏試驗發現ST7型豬鏈球菌(血清2型)PX0923菌株是一株多重耐藥菌,對慶大霉素、卡那霉素、新霉素、阿米卡星等12種抗生素耐藥,且攜帶aadA1和bla-TEM2種耐藥基因。研究發現,生物被膜的形成與細菌耐藥有著密切關系,生物被膜的特殊屏障滲透作用使得豬鏈球菌對多種抗生素產生強的耐藥性。生物被膜試驗結果顯示,分離菌株PX0923能夠生成生物被膜,且具有中等的生物被膜形成能力,這與其在藥敏試驗中表現的多重耐藥情況相符。鑒于致腦膜炎豬源ST7型豬鏈球菌(血清2型)PX0923菌株的血清型和致病性,應及早開展系統性的流行病學調查和溯源工作,深入研究不同來源豬鏈球菌的血清型、多位點序列分型、毒力和致病機理,為豬鏈球菌的源頭控制和精準防控奠定基礎。

中藥歷史悠久、藥源廣泛、低毒、功效明確且不易產生耐藥性,在抗致病菌、病毒感染和提高機體的免疫力方面有得天獨厚的優勢,特別是在當前禁抗、減抗的大背景下,篩選針對耐藥菌株有效的中藥成為研究熱點[37-38]。Li等[39]發現黃連提取物在體外對豬鏈球菌具有抑制作用;馮沙沙等[40]發現黃連、黃柏、黃芩、丹參等29種中藥對豬鏈球菌具有顯著的抑制效果;陳儉清等[41]確定大黃、 黃芩水提物對豬鏈球菌生物被膜具有極顯著的干預作用;詹佳飛等[42]研究發現毛蕊花糖苷在不影響2型豬鏈球菌生長活性的情況下,可通過抑制溶血素活性來降低2型豬鏈球菌對小鼠的致病性。唐陽[43]通過提取大黃素,發現大黃素可有效抑制溶血素蛋白產生,抑制豬鏈球菌的溶血能力,同時引起毒力基因表達量下調,發揮對豬鏈球菌抑菌活性。本研究發現,中藥全蝎和三七對分離菌株的抑菌效果最佳,其中全蝎對分離菌株極度敏感,這與前人的研究結果存在不同,可能與中藥的產地、中藥的采集部位、炮制方法、菌株的毒力及耐藥性等原因有關。中藥的種類和成分繁多,可通過多種靶點抑制病原菌生長、破壞病原菌結構或殺死病原;本研究僅進行了體外抑菌試驗,后續開展中藥組方、生物被膜清除劑和中西藥聯合用藥,發掘中藥全蝎和三七在動物體內的對豬鏈球菌的抑菌效果及抑菌機制,為開發和利用中藥治療耐藥鏈球菌感染奠定理論基礎。

4 結 論

本試驗證實從患腦膜炎病豬腦組織中分離出一株豬鏈球菌(血清2型),ST型為ST7,具有多重耐藥特性,且攜帶epf、mrp、sly、gapdh、fbps、orf2和sao7種毒力基因;在綿羊血平板上呈現α型溶血特點,能導致小鼠患腦膜炎、肺炎等癥狀,具有一定的致病性,對公共衛生安全具有潛在威脅;其攜帶aadA1和bla-TEM2種耐藥基因,對慶大霉素、卡那霉素、新霉素、阿米卡星等12種藥物耐藥,對環丙沙星、氧氟沙星、頭孢哌酮、頭孢唑林4種藥物敏感;中藥全蝎和三七在體外試驗中對分離菌株PX0923均有顯著抑菌作用。相關結果旨在為致腦膜炎豬源ST7型豬鏈球菌(血清2型)的研究提供科學參考。