丁苯酞對小鼠顱腦損傷后認知功能的保護作用

牛文書,張振紅,王玉斌,李經綸,劉揚

(聯勤保障部隊第九八八醫院,1.神經內科;2.神經外科,河南 鄭州 450000)

外傷性顱腦損傷(traumatic brain injury,TBI)會造成感覺、認知、行為、運動等功能損害,是45歲以下人群致死、致殘的重要病因之一[1]。TBI后神經功能障礙可由直接和間接的機械損傷及合并的腦出血、缺血、水腫引起,也可由繼發的生化和病理生理層面的級聯反應引起[2-3]。除手術、康復鍛煉外,有效的腦保護藥物也是治療顱腦損傷的策略之一。丁苯酞是我國自主研發的腦血管領域新藥,具有抗炎、抗氧化、減輕神經細胞損傷、促進神經功能恢復等作用[4]。丁苯酞目前已被證實可改善大腦認知功能,在急性腦梗死、血管性癡呆等疾病中顯示了良好的臨床效果[5]。有研究[6]報道丁苯酞能改善TBI小鼠的神經功能評分,但目前對丁苯酞在TBI后認知障礙的應用報道較少?；诖?本研究擬通過構建小鼠急性TBI模型,旨在初步探討丁苯酞對腦外傷后認知障礙的保護作用及可能的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級健康雄性昆明小鼠40只,由鄭州大學實驗動物中心提供,7～8周齡,體重(27±2.1)g。飼養條件:光照時間12 h,室溫20～22 ℃,濕度50%～60%,給予充足無菌水及飼料喂養,適應性喂養7 d。實驗經本院實驗動物倫理委員會批準,實驗過程符合國家和單位有關實驗動物的管理和使用規定。

1.2 主要實驗儀器和試劑

丁苯酞氯化鈉注射液(石藥集團恩必普藥業有限公司);抗小鼠腦衍生神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)抗體(美國Abcam);抗小鼠GAPDH抗體(美國Abcam);BCA試劑盒(上海碧云天),TUNEL反應試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司);DP71型熒光顯微鏡(日本奧林巴斯株式會社);成像系統(加拿大QImaging公司),Morris水迷宮系統(北京友誠嘉業生物科技有限公司);凝膠成像分析系統(美國BioRAD)等。

1.3 實驗方法

1.3.1 模型制備及分組 將小鼠隨機分為假手術組、手術對照組、丁苯酞處理組1和組2,每組各10只。小鼠適應性喂養7 d后,手術對照組、丁苯酞處理組1和組2采用壓縮損傷法誘導顱腦損傷。小鼠經0.3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后固定于鼠板上,備皮消毒,沿顱中線切開頭皮并暴露頂骨,在左頂部用牙科鉆研磨一直徑約為4 mm的骨窗,僅保留薄層顱骨。將小鼠固定于腦立體定位儀上,腦立體定位儀縱軸連接一鈍端直徑為3 mm的無菌損傷器械,以前囟后1.8 mm、中線旁2 mm為中心,緩慢旋轉腦立體定位儀縱軸,使骨面與損傷器械鈍端接觸后向下按壓1.3 mm,導致顱骨向內塌陷壓縮腦組織。打擊結束后清潔創面,用骨蠟封閉骨窗,逐層縫合頭皮,放回鼠籠。假手術組僅磨薄顱骨,不造成腦壓縮損傷,其余步驟一致。

1.3.2 實驗方法 以腹腔注射給藥對小鼠進行干預。假手術組給予200 mg·kg-1·d-1丁苯酞處理;丁苯酞處理組1和組2分別給予100 mg·kg-1·d-1、200 mg·kg-1·d-1丁苯酞處理;手術對照組給予同等劑量生理鹽水處理。自開始造模前1 d每日固定時間給藥,連續給藥15 d。

1.4 檢測指標

1.4.1 神經行為學 (1)Y型迷宮測試。于建模后7 d、14 d以Y型迷宮自發輪替行為測試。Y型迷宮由3個不透光等長臂組成(長30 cm,寬8 cm,高15 cm),相鄰臂之間的角度為 120 °。小鼠初始置于迷宮的中心位置,并允許自由探索3個臂10 min。自發輪替行為定義為大鼠依次連續進入3個不同臂為1次。最大輪替次數=自發輪替次數-2;自發輪替行為百分比=自發輪替次數/最大輪替次數×100%。動物自發輪替行為比例較高時被認為具有較好的空間工作記憶能力。(2)Morris水迷宮測試:于建模后14 d、28 d行Morris水迷宮定位航行測試。將小鼠放置于Morris水迷宮系統(直徑90 cm、高60 cm的圓形不銹鋼水池+深度為30 cm的無毒不透明液體)中,將圓形水池平均分為4個象限,在其中1個象限中央放置1個圓柱形隱藏平臺,小鼠隨機從水池的4個入水點頭朝池壁入水,任其游泳,直到找到平臺,小鼠找到平臺的時間和軌跡由水池上方的攝像機記錄,每次試驗后將小鼠烘干并休息20 min后進行下一次實驗;記錄小鼠每次尋找平臺的逃避潛伏期。

1.4.2 腦組織BDNF表達 造模后14 d行為學評估后,于麻醉下取小鼠腦組織,分離傷側前額葉皮層和海馬結構,按試劑盒操作流程提取蛋白液,BCA法測定蛋白濃度并配平。行經SDS-PAGE電泳,并將蛋白轉至PVDF膜。封閉抗體后,加入抗BDNF、抗GAPDH (1∶500) 4 ℃孵育過夜孵育,漂洗后加入辣根過氧化物酶(HRP) 標記的二抗 (1∶500) 孵育2 h。使用ECL化學發光底物顯影。以假手術組BDNF/GAPDH灰度比為1,計算其他各組條帶相對灰度比。

1.4.3 海馬區神經元凋亡 于建模后7 d麻醉小鼠后制備腦組織冰凍切片,采用TUNEL法進行檢測。常規行脫蠟、復水和抗原修復處理,使用TUNEL試劑盒,PBST溶液洗脫玻片(3次、10min/次),滴加核染色劑,室溫下處理5 min;PBST溶液洗脫,滴加抗熒光衰減液5 μL,封片;熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.5 統計學分析

2 結果

2.1 各組小鼠神經行為學比較

在Y型迷宮試驗中,與假手術組比較,手術對照組小鼠造模后7～14 d自發輪替行為百分比減少(P<0.05)。與手術對照組小鼠相比,丁苯酞處理組1小鼠在7～14 d時自發輪替行為百分比有一定上升,但差異無統計學意義;丁苯酞處理組2小鼠自發輪替行為百分比上升,差異有統計學意義(P<0.05)。兩丁苯酞處理組間比較,組2小鼠14 d時自發輪替行為百分比高于組1 (P<0.05)。見圖1。

在Morris水迷宮試驗中,與假手術組比較,手術對照組小鼠造模后7～14 d逃避潛伏時間延長(P<0.05)。與手術對照組小鼠相比,丁苯酞處理組1小鼠在14 d時逃避潛伏時間延長(P<0.05),但在28 d時差異無統計學意義(P>0.05);丁苯酞處理組2小鼠在14 d及28 d時均低于手術對照組 (P<0.05)。見圖2。

2.2 各組小鼠海馬和前額葉內側皮質BDNF表達比較

TBI后14 d,小鼠海馬及額葉前內側皮質均下調(P<0.05)。與手術對照組相比,丁苯酞處理組1小鼠海馬BDNF表達水平上調(P<0.05);丁苯酞處理組2小鼠海馬及前額葉內側皮質BDNF表達水平上調(P<0.05)。兩丁苯酞處理組間比較,組2小鼠前額葉內側皮質BDNF上調高于組1(P<0.05)。見圖3。

2.3 各組小鼠海馬區神經元凋亡情況比較

TBI后7 d,各組小鼠海馬區神經元凋亡率比較:假手術組<丁苯酞處理組2<丁苯酞處理組1<手術對照組,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖4。

3 討論

顱腦損傷的發生與外部因素作用于腦組織造成的神經系統損傷有關,輕度顱腦損傷患者的神經功能可在短時間內恢復,但受臨床癥狀不明顯、影像學表現不典型、治療延誤等因素的影響,部分患者可能出現傷后遠期神經退行性變和認知功能障礙,影響患者整體預后,需要引起更多的關注。

丁苯酞是指南[7-8]推薦的神經保護劑,可通過上調NF-E2相關因子2(Nrf-2)/血紅素氧合酶1信號通路表達及其他多種機制,對腦損傷大鼠起到神經保護作用。本研究通過構建小鼠顱腦損傷模型,探討了丁苯酞對腦外傷后認知障礙的保護作用。研究顯示,實驗小鼠腦組織在遭受外力打擊后,出現明顯的空間記憶功能損傷,表現為Morris水迷宮試驗逃避潛伏時間延長和Y型迷宮試驗自發輪替行為減少。丁苯酞干預對這些指標具有改善作用,并至少可持續至顱腦損傷后28 d,提示其在腦外傷后急性期及亞急性期對認知功能受損具有保護作用。

據報道[9]丁苯酞可靶向調控Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白1(Keap-1),抑制Keap-1與Nrf-2的相互作用,激活細胞抗氧化活性,減輕氧化應激損傷,發揮腦保護作用。劉俊等[10]研究發現,丁苯酞可通過降低大鼠腦組織炎癥因子的表達改善腦水腫狀態;Wang等[11]也發現,丁苯酞在腦震蕩性腦損傷中可明顯降低腦組織含水率,具有較好的腦保護作用。這些機制可能是丁苯酞在腦損傷急性期發揮神經保護作用的機制。

BDNF做為內源性神經保護劑,參與了神經細胞修復和神經功能恢復。顱腦損傷后BDNF可促進神經細胞再生和神經網絡重建,減輕繼發性損傷的影響[12-13]。本研究發現,小鼠顱腦損傷后14 d,海馬及前額葉內側皮質BDNF表達有明顯下調,這可能是外傷的直接影響,并進一步延緩外傷后神經修復。外源性補充BDNF難以通過血腦屏障發揮作用,而丁苯酞干預能明顯上調海馬及前額葉內側皮質BDNF的表達、促進內源性BDNF功能,一般認為這兩個腦區與學習認知密切相關,因此這可能是丁苯酞發揮腦保護作用的機制之一。本研究發現,與假手術組比,手術對照組、丁苯酞處理1組和2組的神經元凋亡率明顯升高;與手術對照組比,丁苯酞處理1組和2組的神經元凋亡率明顯降低,這從組織細胞層面表明,丁苯酞可降低顱腦損傷后神經元的凋亡,從而對神經功能起到保護作用。一項有關丁苯酞對腦癱大鼠海馬神經元凋亡的影響的研究[14]發現,丁苯酞可能通過介導磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B信號通路,調控B細胞淋巴瘤-2相關蛋白表達,抑制海馬神經元凋亡,促進神經功能康復。但顱腦損傷后,丁苯酞影響神經元凋亡的具體機制仍有待進一步明確。

綜上,丁苯酞可改善小鼠TBI后空間記憶功能,對認知損傷具有一定的神經保護作用,上調海馬及前額葉內側皮質BDNF表達及抑制海馬區神經元的凋亡可能是其潛在機制。