一種快速測定醬油和醋中對羥基苯甲酸酯的方法

◎ 楊姍姍，趙海峰，英 瑜，王曉雯，金 偉

（青島市食品藥品檢驗研究院，國家藥品監督管理局海洋中藥質量研究與評價重點實驗室，山東 青島 266071）

對羥基苯甲酸酯又稱羥苯甲酯或尼泊金酯，因其存在酚羥基結構，可破壞細胞膜，使細胞內的蛋白質變性，抑制微生物的酶系統活性，造成微生物的新陳代謝異常，從而阻止其正常生長和繁殖，具有抑菌作用[1]；又因其晶體無色或白色、無味，不會影響產品的色澤和風味，在人體內代謝迅速、不會產生累積，所以被國際公認為安全、高效、廣譜的防腐劑，在食品工業、化妝品、醫藥等領域得到了廣泛使用。隨著研究的深入，1978 年，ISHIDATE 等[2]研究表明對羥基苯甲酸酯可以引發染色體畸變；1998 年，ROUTLEDGE 等[3]發現對羥基苯甲酸酯存在雌激素活性；2002 年，日本東京都衛生研究所報道，即使微量攝入對羥基苯甲酸丁酯，也會造成實驗大鼠精子數量和濃度的顯著下降，對雄性小鼠生殖系統造成不良影響[4]；2008 年，DARBRE 等[5]的研究發現，對羥基苯甲酸酯具有雌激素和抗雄激素活性，不僅會影響男性生殖功能，還有可能增加乳腺癌的發病率；2012 年，SUGANDHA 等[6]證實對羥基苯甲酸酯確實會增加女性患乳腺癌的風險。對羥基苯甲酸酯的激素活性被越來越多的人所重視，在食品工業中的應用也受到了一定的限制。

目前，我國要求醬油、醋中對羥基苯甲酸酯類及其鈉鹽（以對羥基苯甲酸計）最大使用量均為0.25 g·kg-1[7]，食品中對羥基苯甲酸酯的檢測方法主要有氣相色譜法[8-11]、氣相色譜-質譜法[12-15]、液相色譜法[16-19]、液相色譜-質譜法[20-22]、毛細管電泳法等[23]。GB 5009.31—2016 是目前食品中檢測對羥基苯甲酸酯類的主要方法[24]，但是操作煩瑣，消耗時間長、試劑用量大，不利于大批量樣品的檢測工作。本文研究建立了測定醬油、醋中對羥基苯甲酸酯類樣品前處理方法，該方法前處理工作操作簡單，檢測結果準確可靠，在實驗室檢測中既能提高工作效率，又可減少試劑用量，適宜大批量樣品的檢測工作。同時，本文的研究內容也對其他品類樣品的前處理方法具有指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

4種對羥基苯甲酸酯類混合標準溶液（1 000 mg·L-1）：購自國家標物中心；乙酸乙酯：HPLC 級，德國Merk公司；NaCl、NaHCO3：均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；實驗用水均為Millipore 現制水。

1.2 儀器與設備

7890B 氣相色譜儀：美國Agilent；Multi Reax 渦旋振蕩器：德國Heidolph；3-18KS 高速冷凍離心機：美國Sigma；電子天平：美國Ohaus。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

飽和NaCl 的飽和NaHCO3溶液：在飽和NaHCO3溶液中加入NaCl 至過飽和。

飽和NaHCO3的飽和NaCl 溶液：在飽和NaCl 溶液中加入NaHCO3至過飽和。

1.3.2 樣品前處理

稱取5 g（精確至0.001 g）均勻樣品于50 mL 離心管中，加入10 mL 乙酸乙酯，振搖3 min 后，5 000 r·min-1離心5 min，取上清液于新的50 mL 離心管中，加入10 mL 飽和NaCl 的飽和NaHCO3溶液，振搖3 min 后，5 000 r·min-1離心5 min，取5 mL 上清液，氮吹至近干，加1 mL 乙醇復溶，過0.22 μm 有機濾膜，待測。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：HP-5（美國Agilent，30 m×0.32 mm，0.25 μm）；載氣：氮氣；恒流模式：2 mL·min-1。

進樣口溫度：250 ℃；進樣模式：不分流；進樣體積：1 μL。

程序升溫：100 ℃保持1 min；20 ℃·min-1升溫至170 ℃；12 ℃·min-1升溫至220 ℃，保持1 min；10 ℃·min-1升溫至250 ℃，保持8 min。

FID 檢 測 器 溫 度：280 ℃； 空 氣 流 速：450 mL·min-1；氫氣流速：40 mL·min-1。

2 結果與分析

2.1 鹽酸酸化步驟的去除

在樣品前處理過程中加入1 ∶1 鹽酸1 mL 對樣品進行酸化，可以將對羥基苯甲酸的鈉鹽酸化為對羥基苯甲酸，但是對羥基苯甲酸的沸點為336.2 ℃，不易被汽化，需經甲酯化后方能使用氣相色譜法進行測定[10]。若不進行甲酯化，由于對羥基苯甲酸的酸度比碳酸強，使用飽和碳酸氫鈉洗滌樣液時，樣液中的對羥基苯甲酸會與碳酸氫鈉反應再次生成對羥基苯甲酸鈉鹽，因此原方法中加入1 ∶1 鹽酸1 mL 對樣品進行酸化，對檢測結果無影響。本文使用含有對羥基苯甲酸甲酯和對羥基苯甲酸乙酯的醬油樣品就是否需要酸化樣品進行了6 個平行樣的對比，結果如表1 所示。在樣品前處理過程中加入1 ∶1 鹽酸對樣品酸化和不進行酸化，測定結果無顯著差異。另外，考慮到節儉、環保的要求，本文方法不再進行樣品酸化。

表1 樣品酸化比對實驗結果表

2.2 萃取試劑的選擇

在實驗用水和18%的NaCl 溶液（模擬醬油的含鹽量）中加入終濃度均為10 mg·L-1的4 種對羥基苯甲酸酯類，選擇常用試劑甲醇、乙醇、乙醚、乙酸乙酯和乙腈，分別進行萃取。實驗過程中發現，甲醇和乙醇均能分別與實驗用水和NaCl 溶液互溶，無分層現象發生，不適宜作為對羥基苯甲酸酯的萃取試劑；乙腈可以與實驗用水互溶，但與NaCl 溶液混勻后仍分層現象明顯，因此在提取過程中可以通過鹽析作用得到乙腈層，乙腈可以用作對羥基苯甲酸酯的萃取試劑；乙醚和乙酸乙酯與實驗用水和NaCl 溶液混勻后均分層現象明顯，可以用作對羥基苯甲酸酯的萃取試劑。

按1.3.2 的操作經離心、氮吹、復溶、過膜后測定，結果如圖1 所示，用乙醚和乙酸乙酯提取實驗用水中的對羥基苯甲酸酯類，上機檢測，采用乙酸乙酯萃取時，4 種對羥基苯甲酸酯的加標回收率基本在105%左右，明顯優于乙醚；用乙醚、乙酸乙酯和乙腈提取18% NaCl 溶液中的對羥基苯甲酸酯類，使用乙酸乙酯萃取時，4 種對羥基苯甲酸酯的加標回收率基本在100%～105%，整體上優于乙醚和乙腈。因此，最終選擇乙酸乙酯作為萃取試劑。

圖1 不同提取溶劑的對羥基苯甲酸酯類回收率圖

乙酸乙酯提取18%NaCl 溶液中對羥基苯甲酸酯類的回收率相對提取實驗用水的回收率偏低，可能是由于乙酸乙酯在實驗用水和18% NaCl 溶液中的溶解度不同，溶于實驗用水中的乙酸乙酯相對NaCl 溶液更多一些，造成乙酸乙酯層的體積減小，在溶質基本不變的情況下，溶劑體積減小，必然導致濃度的增高。

2.3 凈化溶劑的選擇

在5 g 醬油樣品中加入10 mg 4 種對羥基苯甲酸酯的標準物質，使用乙酸乙酯提取，分別采用20 mL 10 g·L-1的NaHCO3溶液、20 mL 飽和NaCl 溶液、10 mL飽和NaCl 溶液+10 mL 10 g·L-1NaHCO3溶液、10 mL 10 g·L-11的NaHCO3溶液、10 mL 飽和NaCl 溶液、5 mL飽和NaCl 溶液+5 mL 10 g·L-1NaHCO3溶液對提取液進行凈化。

實驗過程中發現，提取液經含有NaHCO3的溶液凈化后，有機層中的深色雜質會轉移至水相中；若凈化液中無NaHCO3，深顏色的雜質仍留存在有機層中，說明NaHCO3對提取液中的深色雜質有良好的去除作用，凈化溶液中應含有NaHCO3。凈化后的有機層，按1.3.2 的操作氮吹、復溶、過膜后測定，結果如圖2 所示。使用20 mL 10 g·L-1的NaHCO3溶液凈化提取液后，4 種對羥基苯甲酸酯的加標回收率大多高于110%，對羥基苯甲酸乙酯的加標回收率高于120%，過高的回收率說明20 mL 10 g·L-1的NaHCO3溶液不適宜用作本實驗的凈化。同時，對比10 mL 10 g·L-1的NaHCO3溶液凈化，凈化溶液濃度相同，加入的體積不同導致加標回收率明顯差異，再次驗證了乙酸乙酯在水溶液中的溶解量增加，會導致加標回收率的上升。同理，對比20 mL 飽和NaCl 溶液和10 mL飽和NaCl 溶液凈化后的加標回收率，對比10 mL 飽和NaCl 溶液+10 mL 10 g·L-1NaHCO3溶液和5 mL 飽和NaCl溶液+5 mL 10 g·L-1NaHCO3溶液的加標回收率，凈化溶液體積越大，其加標回收率相對偏高，因此凈化過程中凈化溶液的體積應控制在合理范圍內。

圖2 不同凈化溶液的對羥基苯甲酸酯類回收率圖

前期的實驗已經證明NaHCO3對去除提取液中雜質具有重要的作用，而且凈化溶液的使用量會影響實驗的最終結果。為了進一步驗證凈化溶液體積相同，不同的溶質組合對加標回收率的影響，實驗室比對飽和NaCl 的飽和NaHCO3溶液，飽和NaHCO3的飽和NaCl 溶液，飽和NaCl 的10 g·L-1NaHCO3溶液的凈化效果。分別取10 mL 凈化溶液凈化10 mL 提取液，提取液中的深色雜質都能轉移至水相中。通過圖3 的加標回收率比較，采用飽和NaCl 的飽和NaHCO3溶液凈化后，4 種對羥基苯甲酸酯的綜合回收率相對更優。

圖3 不同凈化溶液的對羥基苯甲酸酯類回收率圖

2.4 標準曲線、檢出限、準確度及精密度

用乙醇配制4 種目標物混標系列濃度4.0 mg·L-1、10.0 mg·L-1、20.0 mg·L-1、50.0 mg·L-1、100 mg·L-1、200 mg·L-1和300 mg·L-1進行測試，分別以4 種對羥基苯甲酸酯類的峰面積A為縱坐標，以質量濃度ρ（mg·L-1）為橫坐標繪制標準曲線，詳見表2。

表2 4 種目標物的線性關系、相關系數表

在未檢出對羥基苯甲酸酯類的醬油樣品和醋樣品中，分別添加6 平行的0.6 mg·kg-1（GB 5009.31—2016的檢出限）、2.0 mg·kg-1、4.0 mg·kg-1和10.0 mg·kg-1的對羥基苯甲酸酯，按照1.3.2 進行樣品前處理，檢測結果詳見表3。4 種目標物在不同添加水平的回收率基本在70%～120%，相對標準偏差在0.90%～7.06%，表明該方法的準確度和精密度均較好。按照國標方法檢出限水平添加，也能準確定量，能滿足日常檢測醬油、醋中對羥基苯甲酸酯類的要求。

表3 方法回收率和精密度實驗表（n=6）

2.5 討論

本文樣品前處理方法可以準確、快速高效、經濟環保地測定醬油、醋中的對羥基苯甲酸酯類，單個樣品的前處理時間約30 min，批量樣品的前處理時間與單個樣品的區別主要在于試劑添加的耗時，同時有機試劑用量少，檢出限也滿足GB 5009.31—2016 的要求。然而存在的問題是，GB 2760—2014 中的限量要求是針對“對羥基苯甲酸酯類及其鈉鹽”，而其指定檢測方法GB 5009.31—2016 為僅能測定“對羥基苯甲酸酯類”，本文樣品前處理方法也未考慮“對羥基苯甲酸鈉鹽”的測定，將在之后的研究中加以完善。

3 結論

對羥基苯甲酸酯是食品中常見的防腐劑，為保證食品質量安全，建立一種快速高效、經濟環保的檢測方法十分必要。本文研究了測定對羥基苯甲酸酯類的樣品前處理的操作機理、優選了萃取試劑和凈化方法，并使用實際樣品驗證了方法的檢出限、準確度、精密度，建立了快速高效、經濟環保測定醬油和醋中對羥基苯甲酸酯類的樣品前處理方法，適宜大批量樣品的快速測定。同時，本文的研究內容也對測定其他品類樣品中對羥基苯甲酸酯類的前處理方法具有指導意義。