酯化反應-氣相色譜-質譜聯用法測定茶葉中氯酞酸殘留

◎ 巫立健

（南平市食品藥品檢驗檢測中心，福建 南平 353000）

氯酞酸為苯甲酸類除草劑，也是芽前除草劑敵草索在植物體內的主要代謝產物，通常用于控制禾本科雜草和闊葉雜草[1]。美國環保署針對敵草索除草劑發布了職業和居民暴露評估報告，評估結果認為該農藥對職業工人及接觸農藥的相關人員存在健康風險，其中大鼠甲狀腺毒性測試報告研究表明，敵草索對大鼠具有潛在的內分泌干擾特性，可能會造成孕婦胎兒甲狀腺素紊亂，從而對胎兒產生不利的健康風險[2]。因此，建立一種植物源食品中氯酞酸殘留量的分析方法十分必要。

2021 年3 月，國家衛生健康委員會等3 部委聯合發布《食品安全國家標準 食品中農藥最大殘留限量》（GB 2763—2021），其中在蔬菜、水果、食用菌等食品上新增的檢測項目氯酞酸尚無配套的檢測標準，經查也沒有可供參考的食品安全國家標準。氯酞酸水溶性好、極性強，導致其在反相液相色譜柱上無保留，使用液相色譜法檢測時需在流動相中使用離子對試劑磷酸四丁胺來解決強極性化合物難保留的問題[3]；選用高選擇性的質譜檢測器，一定程度上可以克服氯酞酸在反相液相色譜柱上的保留難題，但目前關于液相色譜-質譜法檢測氯酞酸的研究較少[4-5]。

作為農藥殘留的重要檢測手段，氣相色譜、氣相色譜-質譜技術只能對揮發性組分進行分析，不能直接用于難揮發、熱不穩定化合物及生物農藥等多種結構類型的農藥多殘留的篩選測定。氯酞酸揮發性低和極性強，因此不能直接使用氣相色譜法進行分析，需要先進行衍生化反應[6-7]，此類檢測方法前處理過程復雜、耗時長、成本高，不適合大批量的樣品檢測。本方法擬采用基于芳香基羧酸與鹵代烴的酯化反應對茶葉中的氯酞酸進行提取、衍生化、凈化后，使用氣相色譜-串聯質譜法進行分析，以期為茶葉中氯酞酸的殘留檢測提供快速、簡便的分析方法[8]。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

茶葉為市售；乙腈，色譜純；Copure? QuEChERS凈化管（貨號COQ015020-TJ，150 mg N-丙基乙二胺鍵合硅膠吸附劑+15 mg 石墨化炭黑吸附劑+900 mg硫酸鎂），深圳逗點生物技術有限公司；氯酞酸標準品（10 mg，純度大于98%），天津阿爾塔科技有限公司；碘乙烷，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

TSQ8000 Evo 氣相色譜-三重四極桿串聯質譜儀，美國賽默飛世爾科技公司；BP211D 電子天平，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；3-18 KS 臺式高速冷凍離心機，德國Sigma 公司；TurboVap 多功能全自動樣品濃縮儀，瑞典Biotage 公司；Milli-Q Advantage Direct 16 超純水制備系統，德國默克密理博公司。

1.3 溶液配制

①氯酞酸儲備溶液。稱取10 mg（精確至0.1 mg）氯酞酸標準品，用乙腈溶解并定容至10 mL，得到濃度為1 000 μg·mL-1的氯酞酸儲備液。②氯酞酸中間液。準確移取100 μL氯酞酸標準儲備液至10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，得到濃度為10 μg·mL-1氯酞酸中間液。③氯酞酸工作液。準確移取500 μL 氯酞酸中間液至10 mL 容量瓶中，用乙腈定容至刻度，得到濃度為500 ng·mL-1的氯酞酸工作液，-18 ℃避光保存。④系列基質工作溶液的具體配制方法。取2 g 茶葉空白試樣，分別加入20 ng、40 ng、80 ng、120 ng、160 ng 和200 ng 的氯酞酸標準品，再按1.4 樣品前處理方法提取、衍生、凈化后，制成氯酞酸質量濃度分別為5.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1、20.0 ng·mL-1、30.0 ng·mL-1、40.0 ng·mL-1和50.0 ng·mL-1的基質工作溶液。

1.4 樣品前處理方法

①提取。稱取2 g茶葉試樣（精確至0.01 g）于50 mL塑料離心管中，加入4.0 mL 超純水渦旋混勻，靜置復原30 min，待茶葉試樣完全吸收加入的水后加入10 mL乙腈，蓋上離心管蓋，劇烈振蕩提取1 min，轉移試樣到臺式高速冷凍離心機，5 000 r·min-1離心5 min。②衍生。吸取全部上清液至25 mL 帶蓋玻璃瓶中，加入0.5 mL 衍生試劑碘乙烷后加瓶蓋密封后搖勻，轉移至60 ℃恒溫水浴反應30 min，取出，冷卻，待凈化。③凈化。吸取6 mL 衍生后上清液加到Copure?QuEChERS 樣品凈化管中，混勻后推出2.5 mL 澄清濾液于10 mL 試管中，轉移至40 ℃恒溫水浴，N2氣吹掃至近干，然后加入1 mL 乙酸乙酯復溶樣品，過微孔濾膜，用于測定。

1.5 儀器條件

（1）色譜條件。色譜柱：農殘專用石英毛細管柱Thermo Pesticides II（30 m×0.25 mm，0.25 μm，帶5 m 保護，美國賽默飛世爾科技公司）；柱溫：100 ℃；程序升溫過程：100 ℃保持0.5 min，以20 ℃·min-1程序升溫至260 ℃，再以40 ℃·min-1升溫至300 ℃，保持5.0 min；載氣：氦氣，純度≥99.999%，載氣流速1.0 mL·min-1；碰撞氣：氮氣，純度均≥99.999%；進樣口溫度：220 ℃；進樣方式：不分流進樣；進樣量：1 μL。

（2）質譜條件。電離能量：70 eV；離子源溫度、傳輸線溫度：280 ℃；質譜掃描方式：多反應監測模式，質譜監測離子及相關參數見表1。

表1 氯酞酸二乙酯（氯酞酸衍生物）的定量離子對、定性離子對、碰撞能和離子豐度比表

2 結果與分析

2.1 衍生化條件的優化

目前測定氯酞酸的方法主要分衍生和不衍生兩種，考慮到不衍生的方法對儀器要求高，本方法采用碘乙烷作為衍生劑，考察不同反應溫度和時間對衍生效率的影響。由圖1 可知，在25 ℃條件下反應30 min，衍生化反應十分緩慢，相對響應強度為19.9%。隨著反應溫度的升高，衍生化反應加快，40 ℃條件下反應30 min，相對響應強度為達到65.0%，反應60 min 相對響應強度為達到89.1%。在60 ℃條件下，反應時間從5 min 增加到30 min，隨著反應時間的增加，峰面積不斷增加；反應30 min 后峰面積增加不明顯，表明底物已經完全衍生化。實驗最終選擇60 ℃反應30 min 作為衍生化條件。

圖1 不同反應溫度和時間條件下氯酞酸衍生化效率結果比較圖

2.2 凈化方法

茶葉基質復雜，樣品前處理過程中得到的提取液中除了目標物，還有大量的天然色素、游離氨基酸、生物堿、茶多酚等物質，可能會對檢測結果造成干擾。本方法使用Copure? QuEChERS 凈化管對衍生化實驗的反應溶液進行凈化處理，可以有效消除樣品基質的干擾。由圖2 可知，未凈化處理的綠茶樣品提取液中存在大量的雜質峰，經過凈化處理的茶葉樣品提取液基線平穩，雜質峰少。

圖2 紅茶空白、紅茶加標、綠茶空白、綠茶加標及未凈化綠茶樣品中氯酞酸二乙酯總離子流色譜圖

2.3 方法的線性范圍及定量限

取紅茶空白、綠茶空白試樣，移取適量的氯酞酸標準工作液并加入樣品，再按1.4 樣品前處理方法提取、衍生、凈化后，按1.3 項方法配制氯肽酸系列溶液，供氣相色譜-質譜聯用儀測定。結果表明，紅茶和綠茶基質在5.0 ～50.0 ng·mL-1時，氯酞酸質量濃度與其峰面積呈現良好的線性關系，紅茶基質線性方程為Y=1.313×104X-2.402×104，綠茶基質線性方程為Y=9.681×103X-1.479×104，線性相關系數均大于0.999。通過在空白基質中添加氯酞酸標準溶液，定義當氯酞酸標準物質產生信號為3 倍信噪比時濃度為檢出限，10 倍信噪比時濃度為定量限，測得本方法檢出限為0.000 05 mg·kg-1，定量限為0.000 15 mg·kg-1，均能滿足《食品安全國家標準 食品中農藥最大殘留限量》（GB 2763—2021）中茶葉分類下氯酞酸臨時限量0.01 mg·kg-1的檢測要求。

2.4 回收率及精密度

采用標準物質添加回收的方法，在不含氯酞酸的空白茶葉試樣中添加0.01 mg·kg-1、0.05 mg·kg-1、0.10 mg·kg-13 個濃度水平的氯酞酸，每個添加濃度平行測定6 次，考察方法精密度，結果見表2。在不同的氯酞酸添加濃度下，茶葉試樣的平均回收率為75.3%～90.2%，相對標準偏差為2.5%～8.7%，結果表明本方法測定復雜基質中氯酞酸具有良好的回收率和精密度，能夠滿足農藥殘留測定的要求。

表2 氯酞酸基質加標回收率和精密度表

3 結論

通過對氯酞酸衍生化條件進行篩查優化，本文成功建立了一種衍生化法檢測茶葉樣品中氯酞酸殘留含量的方法。采用碘乙烷作為衍生劑，在反應溫度為60 ℃的條件下反應30 min 后，采用Copure? QuEChERS凈化管凈化樣品中的雜質，排除了基質效應對結果的干擾。結果表明，紅茶和綠茶基質在5.0 ～50.0 ng·mL-1時，氯酞酸質量濃度與其峰面積呈現良好的線性關系，定量限為0.000 15 mg·kg-1。在茶葉樣品中添加0.01 mg·kg-1、0.05 mg·kg-1、0.10 mg·kg-13 個濃度水平氯酞酸，平均回收率為75.3%～90.2%，相對標準偏差為2.5%～8.7%。該方法簡單、回收率好、精密度高，實現了對茶葉中氯酞酸的精確定量分析，為茶葉中氯酞酸的分析確證提供依據，也可以作為其他方法的輔助手段。