不同方法提取柳葉蠟梅揮發油成分及其抗氧化性、抑菌性的比較

◎ 吳俊清，段凱月，蘇 婷，吳雅雯，陳秀蘭，柳素真

（慶元縣市場監督管理局，浙江 慶元 323800）

柳葉蠟梅（Chimonanthus salicifoliusH. H. Hu）是中國特有的一種半常綠灌木，主要分布在浙江省中南部、安徽省南部和江西省北部等地，是少數兼具觀賞性、食用性和藥理活性的植物[1-2]。研究表明，柳葉蠟梅葉中含有豐富的揮發油類物質，而揮發油是柳葉蠟梅的主要藥效物質基礎之一，具有消炎殺菌、抗病毒、抗氧化和提高機體免疫力等功效[3-6]，具有很大的開發潛力。目前，對柳葉蠟梅揮發油的研究主要集中在成分分析[7-12]方面，對于同時使用3 種方法提取柳葉蠟梅揮發油的化學成分、抗氧化和抑菌性差異的研究較少。本研究旨在利用揮發油提取器法、同時蒸餾萃取法、水蒸氣蒸餾法提取柳葉蠟梅中的揮發油，并通過比較其得率、化學成分、抗氧活化和抑菌活性差異，為柳葉蠟梅的進一步研究及開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

柳葉蠟梅干葉，慶元縣三禾元農業發展有限公司。大腸埃希氏菌（Escherichia coli）、黑曲霉菌（Aspergillus niger）、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），杭州武洋生物科技有限公司。正己烷，分析純，江蘇強盛功能化學股份有限公司；無水硫酸鈉、無水乙醇，均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；1,1-二苯基-2-苦基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽[2,2'-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)diammonuim salt，ABTS]，高純試劑，合肥博美生物科技有限責任公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基，生物試劑，廣東環凱微生物科技有限公司。

1.1.2 儀器與設備

水蒸氣發生裝置，揮發油測定儀（規格5 mL，精度0.1 mL），四川蜀牛玻璃儀器有限公司；AL204分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；HWS-26 電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學儀器有限公司；同時蒸餾萃取裝置，天長市康鵬實驗設備有限公司；TU-1901 紫外可見分光光度計（雙光束），北京普析通用儀器有限責任公司；7890A-5975C 氣相色譜質譜聯用儀，Agilent Technologies Inc。

1.2 實驗方法

1.2.1 柳葉蠟梅揮發油的提取方法

（1）揮發油提取器法提取柳葉蠟梅揮發油。取柳葉蠟梅干葉粉碎，過40 目篩，稱取100 g 粉末置于2 L 蒸餾瓶中，加入12 倍量的純水，充分浸泡混合，連接揮發油提取裝置。從冷凝管上端敞口處添加純水直到沒過揮發油提取器刻度線，電熱套170 ℃加熱10 h，待冷卻后打開活塞收集揮發油，加入適量無水硫酸鈉于收集的揮發油中以去除水分[13]，濾出無水揮發油，稱重，計算揮發油得率。

（2）同時蒸餾萃取法提取柳葉蠟梅揮發油。稱取100 g 柳葉蠟梅粉末置于2 L 蒸餾瓶中，加入12 倍量的純水，充分浸泡混合，將含物料的2 L 蒸餾瓶置于同時蒸餾萃取裝置的重相一端，電熱套170 ℃加熱；量取200 mL 正己烷置于同時蒸餾萃取裝置輕相一端，水浴50 ℃加熱。連續提取10 h 后，收集萃取液，加入適量無水硫酸鈉于萃取液中以去除水分，過濾，20 ℃減壓濃縮，收集揮發油，稱重，計算揮發油得率。

（3）水蒸氣蒸餾提取柳葉蠟梅揮發油。稱取100 g柳葉蠟梅粉末置于2 L 蒸餾瓶中，連接至水蒸氣發生裝置，蒸餾提取10 h。收集餾出液，用適量正己烷萃取3 次，合并萃取液，20 ℃減壓濃縮，收集揮發油，稱重，計算揮發油得率。

（4）揮發油得率計算。計算提取率，提取率=柳葉蠟梅揮發油質量/柳葉蠟梅粉末總質量×100%，每種方法平行操作6 次。

1.2.2 GC-MS 分析

（1）GC 條件。進樣口溫度：230 ℃，進樣量：1 μL，分流比為20 ∶1，色譜柱：HP-5MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm）。升溫程序：初始溫度為70 ℃，以10 ℃·min-1升至280 ℃，保持5 min。

（2）MS 條件。電子電離源，離子源溫度150 ℃；溶劑延遲2 min，全掃描模式，掃描質量范圍為50 ～500 amu。采用NIST MS Search 2.0 數據庫進行揮發性成分的定性分析。

經CA-074預處理后再加LPS刺激，相比于單純使用LPS刺激，CA-074+LPS組小鼠的肝組織變性壞死顯著減輕，肝組織膨脹明顯緩解，僅有少量空泡存在。

1.2.3 抗氧化活性測定

本研究選取DPPH 法和ABTS 法對柳葉蠟梅揮發油的抗氧化活性進行測定，參考標準GB/T 39100—2020[14]，并進行適當修改。

（1）DPPH 法測定抗氧化活性。DPPH 法的實驗原理為揮發油中抗氧化成分提供的1 個電子可與DPPH·自由基配對結合，使DPPH·自由基的特征性紫色變為無色或黃色，而后用紫外分光光度計測定反應后的吸光度，可以用來判定揮發油的抗氧化能力。稱取DPPH 用適量無水乙醇避光超聲充分溶解，用無水乙醇配制成5 μg·mL-1的DPPH 溶液，現配現用。取柳葉蠟梅揮發油用無水乙醇配制成1 mg·mL-1、

3 mg·mL-1、5 mg·mL-1、10 mg·mL-1、15 mg·mL-1、20 mg·mL-1、30 mg·mL-1和40 mg·mL-1的供試品溶液。每個濃度下，取3 只試管，第一支中加入1 mL 樣品溶液，3 mL DPPH 溶液，第二支中加入1 mL 樣品溶液，3 mL 無水乙醇，第三支加入1 mL 無水乙醇，3 mL DPPH 溶液，室溫避光反應60 min，于517 nm 處測定吸光度，分別為A1、A0、A2，DPPH 的自由基清除率=[1-（A1-A0）/A2]×100%。以清除率（Y）對藥物濃度（X）進行回歸擬合[15]，根據對數函數方程求出清除率為50%時藥物的濃度（IC50）。

（2）ABTS 法測定抗氧化活性。揮發油中抗氧化成分與ABTS-自由基反應后使其褪色，在734 nm 處的吸光值降低，反應后的吸光度用紫外可見分光光度計測定，來判定揮發油的抗氧化能力。稱取ABTS母液，用95%乙醇稀釋至吸光度值在0.7±0.02（OD734nm），作為測定溶液，該溶液現配現用。取柳葉蠟梅揮發油用無水乙醇配制成1 mg·mL-1、3 mg·mL-1、5 mg·mL-1、10 mg·mL-1、15 mg·mL-1、20 mg·mL-1、30 mg·mL-1和40 mg·mL-1的供試品溶液。每個濃度下，取兩支試管，第一支中加入0.4 mL 樣品溶液，3.6 mL ABTS 溶液，室溫避光反應5 min，第二支中加入0.4 mL 無水乙醇，3.6 mL ABTS 溶液，室溫避光反應5 min，于734 nm 處測定吸光度，分別為A1、A0，自由基清除率=[（A0-A1）/A0]×100%。以清除率（Y）對藥物濃度（X）進行回歸，根據對數函數方程求出清除率為50%時藥物的濃度（IC50）。

1.2.4 抑菌性測定

（1）菌種活化及菌懸液制備。于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基上接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、蠟樣芽孢桿菌和黑曲霉菌5 種菌種磁珠，細菌在37 ℃下培養24 h，真菌在28 ℃下培養48 h 后，分別挑取對應菌落轉接在0.9%的無菌生理鹽水中，制成106～107CFU·mL-1的菌懸液，備用。

1.3 數據處理

提取實驗所得數據以平均值±標準差（x-±s）表示。采用NIST MS Search 2.0 數據庫進行揮發性成分的定性分析，按峰面積歸一化法進行計算求得各化學成分在揮發油中的相對含量。采用WPS 表格對抗氧化和抑菌性實驗結果進行處理。

2 結果與分析

2.1 不同方法的提取率

不同方法提取的柳葉蠟梅揮發油提取率見表1，所提取的揮發油均為淡黃色油狀物，其中，揮發油提取器法的提取率最高，蒸餾萃取法次之，水蒸氣蒸餾法得率最低。

表1 不同方法提取的揮發油提取率表

2.2 柳葉蠟梅揮發油的化學成分

對不同方法提取的柳葉蠟梅揮發油進行GC-MS分析，3 種方法的總離子流色譜圖見圖1、圖2、圖3，不同方法提取的揮發油化學成分及相對含量見表2。由圖1、圖2、圖3 和表2 可知，3 種提取方法鑒定出的化學成分差異較小，而相對含量差別較大。揮發油提取器法鑒定出22 種化合物，占揮發油含量的99.33%，含量排在前5 的成分依次為桉葉油醇（48.593%）、黑蟻素（14.34%）、喇叭烯氧化物-(I)（8.006%）、石竹素（7.309%）、α-蒎烯（3.777%）。同時蒸餾萃取法鑒定出24 種化合物，占揮發油含量的98.968%，含量排在前5 的成分依次為桉葉油醇（41.994%）、黑蟻素（16.884%）、石竹素（9.126%）、喇叭烯氧化物-(I)（7.670%）、γ-欖香烯（3.071%）。水蒸氣蒸餾法鑒定出27 種化合物，含量排在前5 的成分依次為桉葉油醇（29.378%）、黑蟻素（20.495%）、喇叭烯氧化物-(I)（11.003%）、石竹素（10.063%）、γ-欖香烯（3.946%）。3種提取方法共鑒定出28種化合物，共有化合物有21 種，相對含量比例不同，21 種共有成分相對含量分別為99.333%、98.116%、96.275%，高含量的共有成分中，黑蟻素、石竹素具有較高的藥理活性。水蒸氣蒸餾法鑒定出成分多于其他2 種方法。

圖1 揮發油提取器法譜圖

圖2 水蒸氣蒸餾法譜圖

圖3 同時蒸餾萃取法譜圖

表2 不同方法提取的柳葉蠟梅揮發油化學成分及相對含量表

2.3 柳葉蠟梅揮發油的抗氧化性

2.3.1 柳葉蠟梅揮發油的DPPH 自由基清除能力

由圖4 可知，3 種方法提取的揮發油對DPPH 自由基均有一定的清除能力，且清除率與劑量呈現出依賴關系。對數回歸方程及IC50值見表3。由圖4 和表3 可知，3 種方法提取的揮發油清除DPPH 自由基能力為水蒸氣蒸餾法＞同時蒸餾萃取法＞揮發油提取器法。

圖4 不同方法提取的柳葉蠟梅揮發油清除DPPH 自由基能力圖

表3 不同方法提取的柳葉蠟梅揮發油對DPPH 自由基能力對數回歸方程及IC50 值表

2.3.2 柳葉蠟梅揮發油的ABTS 自由基清除能力

不同方法提取的柳葉蠟梅揮發油清除ABTS 自由基能力見圖5，實驗結果可得，3 種方法提取的揮發油對DPPH 自由基均有一定的清除能力，且清除率與劑量呈現出依賴關系。對數回歸方程及IC50值見表4。由圖5 和表4 所得，3 種方法提取的揮發油清除ABTS自由基能力為水蒸氣蒸餾法＞同時蒸餾萃取法＞揮發油提取器法。

圖5 不同方法提取的柳葉蠟梅揮發油清除ABTS 自由基能力圖

表4 不同方法提取的柳葉蠟梅揮發油對ABTS 自由基能力對數回歸方程及IC50 值表

2.4 柳葉蠟梅揮發油的抑菌性

由表5 可知，3 種方法提取的柳葉蠟梅揮發油對鼠傷寒沙門氏菌、蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌有較為明顯的抑制作用，對大腸埃希氏菌和霉菌無明顯抑制作用。其中，揮發油提取器法和水蒸氣蒸餾法提取的揮發油對金黃色葡萄球菌抑制作用最為明顯，同時蒸餾萃取法提的揮發油對蠟樣芽孢桿菌抑制作用最為明顯。

表5 不同方法提取的柳葉蠟梅揮發油對5 種菌的抑菌圈直徑表

3 結論與討論

采用揮發油提取器法、同時蒸餾萃取法、水蒸氣蒸餾法3 種方法對柳葉蠟梅揮發油進行提取；采用GC-MS 對3 種柳葉蠟梅揮發油成分進行分析；以對DPPH 自由基能力和ABTS 自由基清除能力作為判定指標，研究3 種揮發油體外抗氧化活性；以抑菌圈實驗結果作為評價指標，研究3 種揮發油體外抑菌性。實驗結果表明，采用揮發油提取器法提取柳葉蠟梅揮發油得率較高，同時蒸餾萃取法和水蒸氣蒸餾法得率稍低，可能與提取后萃取濃縮損耗有關。3 種方法提取的柳葉蠟梅揮發油化學成分均以萜類化合物為主，其中以桉葉油醇含量最高，與楊華等[8]、史小娟等[17]研究結果類似。其中，以水蒸氣蒸餾法提取的揮發油鑒定出的化合物種類最多。3 種方法提取的柳葉蠟梅揮發油均有一定的抗氧化活性，且抗氧化能力與揮發油濃度呈正相關關系，3 種方法提取的揮發油對抗氧化活性大小順序均為水蒸氣蒸餾法＞同時蒸餾萃取法＞揮發油提取器法，可能與揮發油中黑蟻素含量有關，研究表明[18]，黑蟻素具有一定的抗氧化性。3 種揮發油成分中，水蒸氣蒸餾法提取揮發油黑蟻素相對含量占比最高。抑菌實驗結果顯示，3 種方法提取的揮發油對鼠傷寒沙門氏菌、蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌有較為明顯的抑制作用，對大腸埃希氏菌和霉菌無明顯抑制作用。其中，揮發油提取器法和水蒸氣蒸餾法提取的揮發油對金黃色葡萄球菌抑制作用最為明顯，同時蒸餾萃取法提取的揮發油對蠟樣芽孢桿菌抑制作用最為明顯。

綜上所述，柳葉蠟梅揮發油提取率較高，其揮發油具有一定的抗氧化活性和抑菌性。從提取率角度考慮，揮發油提取器法提取效率最高。從抗氧化活性角度考慮，水蒸氣蒸餾法提取的揮發油抗氧化活性最強。從抑菌效果考慮，不同方法提取的柳葉蠟梅揮發油抑菌性各有不同。因此，需要依據實際選擇合適的方法進行揮發油提取。