綠豆球蛋白淀粉樣纖維的形成、結構表征及乳化特性

白 露，李志明，張 舒，馮玉超，富天昕，劉宇航，王長遠,2,*

（1.黑龍江八一農墾大學食品學院，黑龍江 大慶 163319；2.國家雜糧工程技術研究中心，黑龍江 大慶 163319）

綠豆蛋白是一種優質膳食蛋白，是綠豆的重要組分（占24%～28%），芳香族氨基酸、亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸的含量與聯合國糧農組織/世界衛生組織參考蛋白相當[1]，極具開發潛力。綠豆球蛋白（mung bean globulin，MBG）是綠豆蛋白的主要儲藏蛋白質，占比達60%，按照不同的重量沉降系數，MBG分為7S、8S和11S球蛋白[2]。MBG具有優良的溶解性、乳化性、凝膠性等特性，在食品工業中應用較為廣泛[3]。其中，MBG的乳化性能可與大豆蛋白相媲美，Liu Hong等[4]研究表明，MBG的乳化活性指數（emulsifying activity index，EAI）和乳化穩定性指數（emulsifying stability index，ESI）分別為3.38 m2/g和77.23%，綜合乳化能力優于大豆7S球蛋白（EAI和ESI分別為4.87 m2/g和57.50%），可作為一種高效的天然乳化劑。然而，MBG獨特的分子構造及柔性不足等局限[4]制約了其高值化利用。通過有效的改性手段實現MBG的功能（尤其是乳化性）增效極具現實意義。

食源性蛋白質淀粉樣纖維是由食品蛋白質在酸性（pH 2～3）、高溫（80～90 ℃）和低離子濃度下獲得的一種富含交叉β-折疊的蛋白聚集體[5]。蛋白質淀粉樣纖維是一種高度有序、無支鏈、分子尺寸為納米級的大分子結構[6]，具有天然的高剛度、極高的長寬比，在乳液中表現出優異的不可逆界面吸附能力和抗聚集性能，是良好的乳化劑[7]。米糠蛋白[8]、大豆蛋白[9]、乳清蛋白[10]等食品蛋白質在淀粉樣纖維化后乳化和界面性能均得到顯著提升。因此，蛋白質淀粉樣纖維化被認為是一種提升食源蛋白質乳化性能的新方法。已有報道顯示，酸熱加工能夠使MBG具有形成淀粉樣纖維的潛能，如Liu Jing等[11]研究發現，MBG在pH 2.0、85 ℃條件下加熱24 h能形成大量短棒狀形態的纖維聚集體。綠豆8S球蛋白與β-伴大豆球蛋白（即大豆7S球蛋白）結構相似；Tang Chuanhe等[12]發現，β-伴大豆球蛋白在蛋白含量1%、pH 2.0條件下加熱12 h，形成輪廓長度為600～800 nm、高度為1.4～1.8 nm的蠕蟲狀淀粉樣纖維。因此，應用MBG制備淀粉樣纖維具有可行性。雖然已有相關研究報道MBG在酸熱環境下會出現纖維化聚集行為，但其纖維化的動力學特征和分子機制尚不清晰，綠豆球蛋白淀粉樣纖維（mung bean globulin amyloid fibrils，MBGFs）的乳化性能也有待探究。

基于此，本研究擬先對MBG進行0～24 h的酸熱處理（pH 2.0、95 ℃），然后對不同階段形成的MBGFs進行結構分析，明晰其纖維化過程中的結構演變規律；同時利用MBGFs構建乳液體系，探究不同酸熱處理時間對MBGFs乳化特性的影響，旨在揭示MBGFs的形成機理，為MBG源乳化劑的開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

綠豆購自山西東方亮生命科技股份有限公司；金龍魚大豆油購自黑龍江省大慶市北京華聯生活超市。

十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）凝膠制備試劑盒、蛋白Marker（SM0431）、牛血清蛋白 北京索萊寶科技有限公司；考馬斯亮藍G250、溴化鉀、硫磺素T（thioflavin T，ThT）、8-苯胺基-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）上海麥克林生化科技有限公司；以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

DS-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 上海力辰邦西儀器科技有限公司；RF-6000熒光光譜儀 上海滴冠實業有限公司；TENSOR II傅里葉變換紅外光譜（Fouriertransform infrared spectroscopy，FTIR）儀 天津市金貝爾科技有限公司；ZEN3700納米粒度電位儀 英國Malvern公司；FJ300-SH實驗室數顯高速剪切均質機上海滬析實業有限公司；JEM-1200EX透射電子顯微鏡（transmission electron microscopy，TEM）日本電子株式會社；MARS60流變儀 上海珩澤科技有限公司；BX53F顯微鏡 山東因斯綽科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 MBG及MBGFs的制備

MBG的制備：首先將脫脂綠豆粉與氯化鈉溶液（0.5 mol/mL）按照料液比1∶10配制成混合溶液，用HCl溶液調整混合溶液pH值至3.5，室溫攪拌2 h后，取懸浮液離心（4 ℃、7 500×g、25 min），上清液與蒸餾水按1∶3的體積比混合，在冰水浴中靜置2 h后離心取沉淀，然后將沉淀進行透析（24 h），重復3 次后冷凍干燥備用。

MBGFs 的制備參考Liu Jing 等[11]的方法。將1 g/100 mL的MBG分散于去離子水中，室溫攪拌2 h使其充分水化，并將溶液pH值調整至2.0，磁力攪拌20 min后過濾膜（0.45 μm），將濾液于油浴鍋中95 ℃加熱0、2、4、6、8、10、12、16、20、24 h后取出，立即冰水浴20 min，冷凍干燥后獲得MBGFs樣品。

1.3.2 MBGFs的結構表征

1.3.2.1 TEM形態分析

MBGFs用水稀釋至1 mg/mL，超聲使樣品分散，取10 μL樣品滴在銅網上靜置10 min后吸除多余樣品，再滴10 μL負染液在原銅網上2 min后吸除多余染液，晾干后用TEM觀察。加速電壓100 kV，分辨率1.60 nm。

1.3.2.2 SDS-PAGE測定

參考梁征等[13]的方法。用0.1 mol/L NaOH溶液配制樣品混合液（0.5 mg/mL），加入等量的上樣緩沖液后沸水浴5 min。5%濃縮膠，12%分離膠，上樣量10 μL，電壓80～120 V。當條帶移動至膠最底端后停止加壓，結束后對膠面依次進行染色和脫色，并拍照觀察。

1.3.2.3 ThT熒光光譜測定

參考Wang Yajuan 等[6]的方法并稍作修改，用10 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0，含150 mmol/L NaCl）配制質量濃度8 mg/mL的ThT濃縮液，過濾膜后得到ThT儲備液。實驗前，用上述磷酸鹽緩沖液將濃縮液稀釋50 倍，將50 μL 1 g/100 mL待測樣品溶液與5 mL ThT稀釋液混合，混勻后靜置2 min，使用熒光光譜儀測定熒光強度（激發波長430 nm，發射波長450～600 nm，縫隙5 mm，掃描速率200 nm/min）。

1.3.2.4 FTIR測定

參考Xiang Ning等[14]的方法并作一定修改。取2 mg MBGFs和200 mg KBr混合后研磨、壓片。在400～4 000 cm-1范圍內進行掃描，分辨率4 cm-1，波數精度0.01 cm-1，掃描次數64。使用Peakfit 4.12軟件對光譜中酰胺I帶進行基線校正、平滑、去卷積和二階導數擬合等處理，計算每個亞峰面積，獲得二級結構的相對含量。

1.3.2.5 粒徑分析

用pH 7.0、0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液溶解樣品至質量濃度為1 mg/mL。采用粒度儀測定MBGFs粒徑，所有樣品均在25 ℃下進行測定。

1.3.2.6 表面疏水性（H0）測定

參考Zhang Shu等[15]的方法并稍作修改，配制1 mg/mL樣品溶液（溶劑為pH 7.0、0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液），10 744×g離心10 min后取上清液進行梯度稀釋，將稀釋液與8 mmol/L ANS溶液以體積比100∶1混合，3 min后測定熒光強度，激發波長為390 nm，發射波長為468 nm。以熒光強度-蛋白質質量濃度作圖，所得直線斜率為H0。

1.3.3 乳液的制備及性能測定

1.3.3.1 乳液的制備及EAI和ESI測定

參照劉興麗等[16]的方法并修改，向15 mL 1 g/100 mL MBGFs溶液中緩慢加入5 mL大豆油，使用高速剪切均質機12 000 r/min均質2 min，形成乳液，立即吸取乳液底部液體50 μL，并置于5 mL 1 g/100 mL SDS溶液中，混勻后立即在650 nm波長處測定其吸光度（A0），間隔10 min后重復操作測定吸光度（A10）。EAI和ESI分別按式（1）、（2）計算。

式中：ρ為樣品質量濃度/（g/L）；φ為油相體積分數；n為稀釋倍數。

1.3.3.2 蛋白吸附率和界面蛋白吸附量測定

參照王可心等[17]方法并作一定的修改，吸取一定量乳液13 200×g離心30 min，緩慢吸取少量下層清液稀釋后于650 nm波長處測定其吸光度，代入牛血清蛋白標準曲線中計算其蛋白質量濃度，蛋白吸附率和界面蛋白吸附量分別按式（3）、（4）計算。

式中：ρ0為乳液中總蛋白質量濃度/（mg/mL）；ρf為下層清液中蛋白質量濃度/（mg/mL）；φ為油相體積分數；D3,2為乳液表面積平均粒徑/nm。

1.3.3.3 光學顯微鏡觀察

取少量乳液置于載玻片上，緩慢蓋上蓋玻片，此過程防止氣泡產生，然后于光學顯微鏡下觀察其微觀形態并選擇標尺進行拍照。

1.3.3.4 流變學特性測定

利用流變儀對MBGFs乳液的表觀黏度、儲能模量（G′）和損耗模量（G″）進行測定。吸取適量樣品于樣品臺上，轉子下降后擦凈多余的樣品，設置間隙0.048 mm，溫度25 ℃，測定樣品在0.1～10.0 s-1剪切速率范圍內的表觀黏度。G′和G″的測定參數為：間隙0.048 mm，溫度25 ℃，頻率掃描范圍0～16 Hz。

1.4 數據處理

所得數據利用IBM SPSS Statistics 22.0軟件進行方差分析，采用Duncan’s模式比較組間差異顯著性（P＜0.05），并用Origin 8.0軟件制作圖表。

2 結果與分析

2.1 MBGFs的形成和結構表征

2.1.1 MBGFs形態分析

如圖1所示，MBG主要由大小不均一、不規則的球狀納米顆粒組成（圖1A）。在pH 2.0環境下，MBG（0 h）發生了一定程度的聚集，但沒有線性聚集體存在（圖1B）。加熱2 h后，球狀結構消失，轉化為中間粗兩端細的絮狀纖維絲，表明在此階段構建單元（蛋白或多肽）已開始進行有序的聚集排序，形成MBGFs初始形態。在4～12 h內，MBGFs逐漸成熟，纖維呈現細直、柔性的長條狀，并且長短不一的纖維共存在同一體系。相較于其他處理組，加熱12 h形成的淀粉樣纖維體系中單個MBGFs間距較大，分布更為均勻。而酸熱處理24 h后重新出現絮狀纖維形貌，說明過度酸熱處理導致成熟MBGFs被破壞，這種現象與Wang Yajuan等[6]的研究結果一致。

圖1 加熱處理過程中MBGFs的TEM圖（×50 000）Fig.1 TEM images of MBGFs at different heating times (× 50 000)

溶液體系的pH值對MBGFs形成起關鍵作用。本研究中溶液體系pH 2.0，為后續MBG的纖維化聚集提供兩方面影響：一是促MBG去折疊，釋放大量易誘發纖維化聚集的肽片段[18]；二是通過改變MBG電離狀況，暴露疏水基團，為MGB纖維化聚集提供驅動力[19]。酸熱處理2 h后，出現大量長度不一但取向相同、細小的MBGFs，其匯聚后形成了相對粗大、延長狀的淀粉樣纖維聚集中間體。在2 h酸熱處理初期，初始MBGFs發生典型的成核聚合反應，釋放肽片段，這些纖維化聚集態的多肽在溶液體系中達到閾值水平后，會為組裝更長、更柔性的MBGFs提供物質基礎[20]。12 h MBGFs的形貌與現有報道存在差異，Liu Jing等[11]研究發現，MBG在含量0.5%、pH 2.0、85 ℃條件下處理12 h后會形成短棒狀纖維聚集體，而本研究得到的是細直的長纖維，這可能與制備時蛋白質含量和溫度的不同有關[21]。綜上，在整個酸熱處理過程中（0～24 h），MBGFs呈現“纖維前體形成→組裝→延伸→成熟→重新解離”的形成規律。

2.1.2 加熱處理過程中MBG的降解

由圖2可知，MBG泳道的條帶分布符合MBG亞基組成特征（60、48、32、26 kDa）[4]。由于將溶液體系pH值調至2.0，MBG變性的同時發生聚集反應，出現高分子質量的亞基[22]，如出現多條＞66.2 kDa的新條帶。2 h的譜圖變化不明顯，但也出現了14.4～25.0 kDa的肽段。研究表明，在初始酸熱水解階段（2 h以內），2 h時MBG的水解程度高于一般谷物蛋白，如米谷蛋白[23]和蕓豆球蛋白[11]，這與MBG高含量的天冬氨酸（占比10.1%～12.3%）有關[24]，這種快速水解產生的MBG多肽片段有助于快速積累足夠數量的MBGFs結構單元。4～12 h是MBGFs形成的主要構建期，＜14.4 kDa的肽片段不斷積累，期間隨著纖維單元含量的不斷提升，MBGFs淀粉樣纖維化程度不斷提高[25]。上述分析表明，2～12 h是MBG成淀粉樣纖維化關鍵時段，與TEM的結果相對應。然而酸熱處理16～24 h時，大部分大分子質量亞基已水解成＜14.4 kDa的肽片段，提示長時間酸熱處理可能會導致前一階段生成的多肽類淀粉樣纖維單元遭到破壞，并影響纖維特性[26]。

圖2 加熱過程中MBGFs的SDS-PAGE圖Fig.2 SDS-PAGE patterns of MBGFs at different heating times

2.1.3 ThT熒光光譜

與未處理的蛋白質相比，成熟蛋白質淀粉樣纖維有更多的β-折疊構型，能被ThT特異性結合，結合后熒光強度會增加多個數量級，所以用該方法可有效監測食源蛋白質淀粉樣纖維化的進程[27]。由圖3可知，加熱2 h后，ThT熒光強度相較于MBG顯著增強，有明顯的交叉β-折疊結構形成，表明MBG的自組裝纖維化已被觸發，符合MBG自組裝纖維化聚集的特點[11]，即水解與纖維化同步進行。2～12 h內，ThT熒光強度持續上升，表明MBGFs在有序形成，結構趨于穩定，并于12 h時ThT熒光強度最大，纖維化程度最高。已有報道表明，蛋白質淀粉樣纖維的形成包括滯后期、生長期和固定期，呈現“S”型的生長模式[28]，本研究發現MBGFs形成過程中并未出現滯后期，初始時期（0～6 h）的ThT熒光強度迅速上升，這可能與MBG發生去折疊導致大量的β-折疊結構暴露有關。ThT熒光強度在16～24 h持續下降，說明長時間的酸熱處理導致MBGFs的β-折疊結構被破壞。目前研究發現蛋白質淀粉樣纖維的生長動力學曲線在固定階段出現2 種不同的現象，一種是ThT熒光強度逐漸平穩，另一種情況是成熟的淀粉樣纖維結構發生解離，ThT熒光強度發生衰退。例如，大豆蛋白質淀粉樣纖維[6]和β-乳球蛋白淀粉樣纖維[29]在長時間（＞12 h）酸熱處理后，ThT熒光強度降低，而蕓豆蛋白淀粉樣纖維[11]卻沒有發生這一現象。這可能是蛋白質來源和制備條件不同導致蛋白質淀粉樣纖維的熱穩定性存在差異，具體機理還需進一步探討。

圖3 加熱過程中MBGFs的ThT熒光強度及最大ThT熒光強度（λ＝485 nm）Fig.3 ThT fluorescence intensity of MBGFs at different heating times (λ=485 nm)

2.1.4 FTIR光譜

由表1可知，在酸熱處理的0～12 h，MBGFs的有序結構不斷形成，并趨于穩定，表現為α-螺旋和β-折疊相對含量逐漸增大。其中β-折疊相對含量在12 h達到最大，為（53.61±1.15）%，表明β-折疊在MBGFs的淀粉樣纖維化進程中大量存在，有助于MBGFs的形成[30]，與ThT熒光檢測結果相一致。已有報道均顯示出這類現象，即蛋白質淀粉樣纖維的形成涉及二級結構的破壞和重組，最明顯的特征是在淀粉樣纖維成熟時β-折疊結構大量出現，而更具有靈活性和無重復的二級結構（β-轉角和無規卷曲）減少[30]。在酸熱處理后期（16～24 h），α-螺旋和β-折疊相對含量顯著下降，β-轉角和無規卷曲相對含量顯著上升（P＜0.05）。研究表明，蛋白質中的α-螺旋構型含量高有利于其纖維化聚集，對纖維長度的延伸起重要作用[31-32]。這些結果均證實，在MBGFs整個的纖維化進程中，MBGFs結構呈現先有序后無序的變化。

表1 加熱過程中MBGFs的二級結構相對含量
Table 1 Relative contents of secondary structures in MBGFs at different heating times %

注：同列小寫字母不同表示差異顯著（P＜0.05）。

2.1.5 粒徑分布

由圖4A可知，顆粒粒徑大小呈現先上升后急劇下降的趨勢，其中12 h最大，為（226.90±7.95）nm；16～24 h粒徑減小。在酸熱處理0～12 h，顆粒粒徑增大主要是由于構建體如蛋白單元或多肽單元的水解釋放，同時進行積極的纖維化聚集，這個階段稱之為“纖顫準備階段”；在長時間加熱后（16～24 h），已成型的纖維化聚集體因持續酸水解而出現降解，致使粒徑減小[26]，稱為“纖顫逆轉階段”。同時，隨著加熱時間的延長，MBG粒徑的分布狀態由三峰逐步轉變為雙峰，且吸收強度明顯提升，粒徑分布更寬，分布峰向粒徑較大的方向偏移（圖4B），表明酸熱加工下的纖維化聚集反應引起蛋白質或多肽等構建單元粒徑的增大，MBGFs的形態趨于規則且分布均勻。

圖4 加熱過程中MBGFs的平均粒徑（A）及粒徑分布（B）Fig.4 Average particle sizes (A) and particle size distribution (B) at different heating times

2.1.6H0分析

作為蛋白質纖維化聚集的主要驅動力，酸熱處理下MBG會在疏水相互作用、靜電相互作用和氫鍵的影響下發生成核聚合反應，有序聚集的肽片段首尾相接形成具有高長寬比的淀粉樣纖維[5]。因此，H0提升有助于MBGFs的形成[33]。由圖5可知，隨加熱時間延長，H0呈現先上升后下降的趨勢，6 h達到最大。表明0～6 h是MBGFs快速形成的關鍵階段。H0的增大可能是由于酸熱處理使MBG水解而產生低分子肽，暴露了蛋白質分子內疏水基團，同時這些疏水基團可作為MBG聚集的活性結合位點[34-35]。當加熱時間大于6 h后，H0逐漸下降，這可能是由于持續加熱后蛋白質或多肽單元發生了更為劇烈的纖維化聚集，期間以自發成核的聚集反應為主，使得暴露的疏水基團被掩埋在纖維化聚集體中，造成H0下降[36]，這與Pang Shuxian等[8]的研究結果相一致。

圖5 加熱過程中MBGFs的H0Fig.5 H0 of MBGFs at different heating times

2.2 MBGFs乳化特性

2.2.1 MBGFs乳液的EAI及ESI

如圖6所示，將加工環境的pH值調整至2.0（0 h），MBG的EAI和ESI顯著提升（P＜0.05）。MBG的等電點在pH 5.0左右[37]，偏離等電點時表面靜電荷含量提升，溶解性增大，最終改善了MBG的EAI和ESI[38]。在酸熱處理中（2～24 h），MBGFs的EAI和ESI均顯著高于MBG（P＜0.05），表明淀粉樣纖維化提升了MBG的乳化性能，這得益于MBGFs在油-水界面優異的不可逆界面吸附和抗聚集性能[7]。另外，隨酸熱處理時間延長，EAI和ESI呈現先上升后下降的趨勢，4 h MBGFs的EAI和ESI均達到最大，與MBG相比分別提高160.80%和103.07%。且4 h MBGFs的乳化性能顯著優于12 h MBGFs，這可能是由于4 h MBGFs的柔韌性強于12 h MBGFs（圖1），使其易于附著在油滴表面；同時，持續酸熱處理后（6～12 h），數量更多、成熟度更高的MBGFs在乳液中發生絮凝，導致乳化性能的下降，這種現象同樣出現在了Pang Shuxian等[8]的研究中。綜上，適度的纖維化（4 h MBGFs）有助于最大程度地提升MBG的EAI及ESI。

圖6 MBGFs乳液的EAI及ESIFig.6 EAI and ESI of emulsions stabilized by MBGFs

2.2.2 MBGFs乳液的蛋白吸附率和界面蛋白吸附量

在乳液中，油滴表面吸附蛋白質在降低界面張力的同時可增加相鄰油滴間阻力，因此吸附的蛋白質含量高低直接影響油滴的界面形成，最終影響乳液體系穩定性[39-40]。如圖7所示，MBG纖維化過程中，MBGFs的蛋白吸附率和界面蛋白吸附量總體呈現先上升后下降的趨勢，但始終大于MBG。其中酸熱處理4 h時蛋白吸附率和界面蛋白吸附量最高，分別達到（80.03±0.30）%和（0.89±0.01）mg/m2。上述結果表明，淀粉樣纖維化能顯著提升MBG的蛋白吸附率和界面蛋白吸附量，從而有效降低油滴界面層的界面張力，使乳化體系更加穩定。通常，與天然蛋白質和一些小分子活化劑相比，蛋白質淀粉樣纖維在油滴界面具有較高的分離能，吸附形成的界面層彈性強，穩定性高，有助于形成更穩定的乳液[41]。蛋白吸附效果與淀粉樣纖維的柔性密切相關，酸熱處理4 h時MBGFs已經成型，柔韌性較高（圖1），這種形態有助于吸附在油-水界面[42]，從而導致較高的蛋白吸附率和界面蛋白吸附量，與EAI和ESI的實驗結果相一致。

圖7 MBGFs乳液的蛋白吸附率和界面蛋白吸附量Fig.7 Protein adsorption rates and interfacial protein adsorption quantity of emulsions stabilized by MBGFs

2.2.3 MBGFs乳液的微觀形態

如圖8所示，MBG乳液油滴體積較大且分布較為無序，這種狀態下油滴間發生聚集效應，從而不利于乳液體系的穩定[43]。pH值調至2.0時，絮凝的油滴發生分離，油滴間空隙加大，分散更為均勻。這主要是因為低pH值提升了MBG表面正電荷含量，增加了乳液油滴之間的靜電排斥力，導致油滴間的聚集程度下降[38]。隨加熱時間延長（2～10 h），油滴尺寸減小，分布更加致密有序，尤其是4 h時，油滴體積較小，分布較為松散。由上述分析可知，加熱4～6 h后，MBGFs形狀更為柔軟，在油-水界面的蛋白吸附能力更強，這些情況將有助于乳液更小油滴的形成和更均勻的排布，提升乳液的均勻性和穩定性。Mantovani等[10]的研究顯示，在乳清蛋白淀粉樣纖維所構建的乳液中，更小的油滴尺寸和更均勻有序的分布有助于改善乳液的穩定性。

圖8 MBGFs乳液的微觀形態（×200）Fig.8 Microstructures of emulsions stabilized by MBGF (× 200)

2.2.4 MBGFs乳液的表觀黏度

如圖9所示，不同酸熱處理時間MBGFs乳液樣品的表觀黏度均隨著剪切速率的增大而減小，表現出剪切稀化特性（假塑性流體）[44]。0 h時，同一剪切速率下，乳液的表觀黏度大于MBG組，原因是極酸性條件下MBG表面水合層被破壞后引起了聚集，最終增大了乳液的黏度[45]。MBGFs乳液的表觀黏度明顯高于MBG，表明MBG淀粉樣纖維化可提升其乳液的黏度，改善乳液穩定性。不同加熱時間下MBGFs乳液的表觀黏度不同，表現為MBGFs（2～12 h）大于MBG組（尤其是4 h MBGFs），變化規律和EAI及ESI一致，這表明4 h MBGFs有助于乳液網絡結構的構建。另外，加熱時間為16～24 h的MBGFs乳液表觀黏度低于2～12 h，這可能是由于2～12 h處于纖維成型階段，大量未參與淀粉樣纖維構成的纖維單元在乳液中定向聚集，形成了具有較高黏性的蛋白質原纖維，最終乳液黏度增強[46-47]。

2.2.5 MBGFs乳液的黏彈性

如圖10所示，所有組別乳液的G′均大于G″，G′和G″未出現交叉點，表明在設定頻率范圍內（0～16 Hz），乳液表現出了凝膠特性，且結構致密、組成單一、富有彈性[48]。pH 2.0處理下MBG乳液的G′明顯增大，可能是調整pH值后MBG分子中的巰基發生氧化反應，形成的二硫鍵提升了分子間相互作用，并增強了凝膠有序的網絡結構，有利于改善G′[49]。與MBG相比，MBGFs乳液的G′和G″明顯增大，表明淀粉樣纖維化有助于改善乳液的黏彈性，進而提高乳液穩定性。其中4 h MBGFs乳液G′和G″均處于最大值，與上述結果相一致。乳液凝膠黏彈特性與油滴粒徑相關，較小的乳液油滴比較大的乳液油滴有更大的G′[50]。與其他組別相比，4 h MBGFs乳液油滴尺寸較小，更多MBGFs被油-水界面吸附，有助于形成均勻、致密的凝膠，從而增強乳液的凝膠性能。

圖10 MBGFs乳液的G′（A）和G″（B）Fig.10 G′ (A) and G″ (B) of emulsions stabilized by MBGFs

3 結論

本研究探討了MBGFs在形成過程中的結構演變規律及乳化特性變化情況。酸熱處理下，MBG逐步水解，球狀蛋白質分子結構去折疊，并獲得大量具有自組裝能力的肽片段，期間肽片段發生定向的淀粉樣纖維化聚集，在疏水相互作用等驅動力下，形成富含β-折疊構型且“兩端細、中間粗”絮狀形態的長剛性MBGFs。但同時，長時間的酸熱處理（＞12 h）會對MBGFs的結構造成破壞。與MBG相比，MBGFs具有更優異的乳化性能（尤其是4 h MBGFs），4 h MBGFs將EAI、ESI、蛋白吸附率和界面蛋白含量分別提升了168.80%、103.07%、73.79%和61.57%，且4 h MBGFs乳液的油滴粒徑更小，分散更加均勻有序，具有更高乳液黏度，更易形成凝膠狀的網狀結構。本研究為進一步理解MBGFs的形成和結構提供了理論依據，為構建新型、高效的植物蛋白基乳化劑提供了一定的方法指導。