大豆DHQ-SDH基因家族生物信息學分析

張安寧，毛慶豐，孫浩楠，申 晴，李志剛，劉中奇

（內蒙古民族大學農學院，內蒙古 通遼 028043）

大豆（Glycine max）起源于中國［1］，已有5 000多年的栽培歷史［2］，春大豆主產區包括黑龍江、吉林、遼寧和內蒙古四省（區）［3］。大豆屬于一年生草本植物［4］，具有很高的蛋白質含量與油含量［5-6］，是人類主要的糧食作物之一［7］。同時，大豆不僅可以作為食品的原材料，還可用于食用油的加工，并且加工所剩的豆餅可用于制作肥料［8-10］。大豆生長發育過程中需要芳香族類物質，而莽草酸途徑作為芳香族類物質合成的必要途徑，對大豆生長發育有重要作用。DHQ-SDH 是植物體內合成的、調節莽草酸途徑的關鍵酶。一方面，可催化3-脫氫奎尼酸脫水形成莽草酸，另一方面，在NADP+存在的條件下催化3-脫氫莽草酸和莽草酸之間的可逆反應［11］。截至目前，已有學者對DHQ-SDH基因家族進行了相關研究。SINGH等［12］研究表明，擬南芥體內的DHQ-SDH蛋白為莽草酸途徑中的代謝物分配提供了額外的調節水平，從而使代謝物從DHQ區域轉移到SDH區域的效率提高。HAN等［13］首次報道冷脅迫對淡水綠藻DHQ-SDH基因的調控。目前，有關大豆DHQ-SDH基因家族的研究少有報道，筆者通過生物信息學方法，對大豆DHQSDH基因家族成員的理化性質、基因架構、保守基序、系統發育進化樹等進行了預測與分析，旨為日后大豆DHQ-SDH基因的研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

所使用的擬南芥DHQ-SDH蛋白序列、番茄DHQ-SDH蛋白序列以及大豆全基因組Glycine maxv2.1數據均來源于Ensembl（http：//plants.ensembl.org/index.html）數據庫［14］。

1.2 大豆DHQ-SDH基因家族的鑒定

將擬南芥DHQ-SDH序列作為對照，利用Tbtools軟件［15］進行blast比對，將篩選得到的候選序列上傳至在線網站Pfam（http：//pfam.xfam.org/）［16］檢查是否含有DHQas_1序列，最終得到全部大豆DHQ-SDH基因家族成員。使用Expasy（https：//web.expasy.org/protparam/）在線軟件［17］預測家族成員蛋白質的理化性質，利用WoLF PSORT（https：//wolfpsort.hgc.jp/）在線網站［18］對其家族成員蛋白質進行亞細胞定位預測。

1.3 染色體位置與基因結構分析

根據大豆基因注釋文件可獲得GmDHQ-SDH家族的13個成員在染色體上的位置信息及基因結構信息，使用Tbtools軟件［15］實現染色體定位與基因結構的可視化。

1.4 大豆DHQ-SDH蛋白質的二級結構和三級結構分析

使用SOPMA（https：//hfffg35d63ad69a164cc2swoc6n65wcbov6k6vfgfy.eds.tju.edu.cn/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html）網站［19］和SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）網站［20］預測大豆DHQSDH基因家族成員蛋白質的二級結構以及三級結構，通過PROCHECK軟件［21］完成三級結構可靠性的檢測。

1.5 大豆DHQ-SDH蛋白質的保守基序分析

利用Tbtools［15］軟件預測大豆DHQ-SDH蛋白的保守基序，并進行可視化。

1.6 大豆DHQ-SDH基因家族系統發育進化樹的構建

于Ensemble（http：//plants.ensembl.org/index.html）數據庫［14］下載擬南芥和番茄的DHQ-SDH蛋白質序列（分別為1 個和2 個），將擬南芥和番茄2 個物種的DHQ-SDH 蛋白質序列（3 個）與所提取到的大豆DHQ-SDH蛋白質序列通過MEGA11軟件［22］進行系統發育樹的構建，并使用iTOL（https：//itol.embl.de/）在線網站［23］美化進化樹。

1.7 大豆GmDHQ-SDH基因的轉錄后調控預測

利用Tbtools［15］篩選大豆DHQ-SDH基因家族成員的CDS 序列，將篩選出的序列上傳至psRNATarget（https：//www.zhaolab.org/psRNATarget/home）在線軟件［24］，預測大豆GmDHQ-SDH基因的miRNA。

1.8 大豆DHQ-SDH基因家族啟動子順式作用元件分析

通過Tbtools軟件［15］從基因組文件中提取得到GmDHQ-SDH基因家族成員的上游2kb序列。將提取得到的序列上傳至PlantCARE（https：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）網站［25］進行分析，最終使用Tbtools軟件［15］進行啟動子順式作用元件分布的可視化。

2 結果與分析

2.1 GmDHQ-SDHs基因家族成員鑒定

共鑒定出DHQ-SDH基因家族成員13個，將其命名為GmDHQ-SDH1至GmDHQ-SDH13。并對家族成員進行蛋白質理化性質分析，其中，氨基酸數量位于409～577之間；分子量為44.36～62.98 kD；不穩定系數介于23.32～32.03 之間；等電點為5.26～6.77；除GmDHQ-SDH1、GmDHQ-SDH3、GmDHQ-SDH13 外，其余蛋白均屬于疏水蛋白，而且，大豆DHQ-SDH家族成員均具有較好的熱穩定性，分別位于葉綠體、過氧物酶體與胞液中。

表1 GmDHQ-SDHs蛋白理化性質及亞細胞定位Tab.1 Physicochemical properties and subcellular localization by GmDHQ-SDHs protein

2.2 大豆DHQ-SDH家族基因染色體定位和基因結構分析

GmDHQ-SDHs家族成員共分布在5條染色體上，且分布具有隨機性。GmDHQ-SDH13與GmDHQ-SDH12分布在1號染色體上，GmDHQ-SDH2位于19號染色體，GmDHQ-SDH1位于20號染色體，GmDHQ-SDH3分布在8號染色體上，分布在3號染色體上的基因最多，為GmDHQ-SDH4～GmDHQ-SDH11（圖1）。

圖1 大豆GmDHQ-SDHs基因染色體定位Fig.1 Chromosome localization of GmDHQ-SDHs gene in soybean

GmDHQ-SDH4、GmDHQ-SDH5、GmDHQ-SDH6、GmDHQ-SDH7、GmDHQ-SDH12以及GmDHQ-SDH13均含有上下游非編碼區域，GmDHQ-SDH1具有下游非編碼區域，而其他GmDHQ-SDHs家族成員不具備上下游編碼區域。同時，該家族成員所包含的內含子數量介于7～11 個之間，表明其在結構上很保守，其中，GmDHQ-SDH3的內含子最長（圖2）。

圖2 GmDHQ-SDHs基因家族染色體結構圖Fig.2 Chromosome structure of GmDHQ-SDHs gene family

2.3 二級結構和三級結構分析

大豆DHQ-SDH基因家族成員蛋白質的二級結構中含有α-螺旋、β-折疊、延伸鏈與隨機卷曲。所有成員均以α-螺旋為主，其中，GmDHQ-SDH9中的α-螺旋所占比例最大，為48.33%；隨機卷曲為第二主要結構，所占比例介于29.76%～34.84%之間（表2）。GmDHQSDH基因家族13 個家族成員的三級結構具有很高的相似性，而且均以α-螺旋為主（圖3）。GmDHQ-SDH1至GmDHQ-SDH13的模型氨基酸在最佳允許區和次允許區的比例介于97.7%～100%之間，所以構建的GmDHQ-SDH1～GmDHQ-SDH13的蛋白三級結構符合立體化學規則。

圖3 大豆DHQ-SDH基因家族三級結構預測圖Fig.3 The tertiary structure prediction map of DHQ-SDH gene family in soybean

表2 GmDHQ-SDHs基因家族二級結構Tab.2 Secondary structure of GmDHQ-SDHs gene family

2.4 大豆DHQ-SDH家族成員保守性分析

GmDHQ-SDHs家族成員共分為4個組（分別為Group1～Group4）。Group1中GmDHQ-SDH4和GmDHQSDH5親緣關系較近，GmDHQ-SDH8和GmDHQ-SDH9親緣關系較近；Group2中，GmDHQ-SDH7與GmDHQ-SDH11親緣關系較近；Group4中，GmDHQ-SDH12和GmDHQ-SDH13親緣關系較近。見圖4（A）。

圖4 GmDHQ-SDHs基因家族保守基序Fig.4 Conserved motifs of GmDHQ-SDHs gene family

GmDHQ-SDHs家族成員蛋白均包含Motif1～Motif6，而且Motif1～Motif6 共同組成了DHQas_1 結構域。同時，GmDHQ-SDH10、GmDHQ-SDH8、GmDHQ-SDH9、GmDHQ-SDH11和GmDHQ-SDH3不具有構成SDH_C結構域的Motif9，見圖4（B）、圖4（C）。

2.5 大豆DHQ-SDH家族進化分析

使用2個擬南芥DHQ-SDH蛋白序列、2個番茄DHQ-SDH蛋白序列與13個大豆DHQ-SDH蛋白序列構建系統發育樹（圖5）。其中，Group2 由At3g06350、Solyc01g067750、GmDHQ-SDH1、GmDHQ-SDH3、GmDHQSDH12、GmDHQ-SDH13構成，由此說明，這6條蛋白序列具有很高的保守性。而在Group3中，GmDHQ-SDH2、GmDHQ- SDH4、GmDHQ- SDH5、GmDHQ- SDH6、GmDHQ- SDH7、GmDHQ- SDH8、GmDHQ- SDH9、GmDHQ-SDH10、GmDHQ-SDH11聚在一起，說明這些蛋白序列親緣關系較近。

圖5 擬南芥、番茄、大豆DHQ-SDH基因家族進化分析Fig.5 Phylogenetic analysis of DHQ-SDH gene family in arabidopsis，tomato and soybean

2.6 大豆GmDHQ-SDHs家族基因的轉錄后調控分析

使用psRNATarget（https：//www.zhaolab.org/psRNATarget/home）在線軟件預測大豆GmDHQ-SDH基因的miRNA，結果得到127 對調控關系，共有2 種抑制靶基因的方式，分別為剪切和翻譯，其中，調控GmDHQ-SDH12與GmDHQ-SDH13的miRNA 均有23 個，為所有大豆GmDHQ-SDH基因中數量最多者。調控GmDHQ-SDH3、GmDHQ-SDH4、GmDHQ-SDH6、GmDHQ-SDH9和GmDHQ-SDH11的miRNA 數量均為7個；調控GmDHQ-SDH7、GmDHQ-SDH5的miRNA為6個；調控GmDHQ-SDH1、GmDHQ-SDH8和GmDHQ-SDH10的miRNA 均為8 個；調控GmDHQ-SDH2的miRNA 數量為10 個。將數學期望值設定為5.0，共篩選得到16 對GmDHQ-SDH12、GmDHQ-SDH13和miR9746 家族之間的調控關系，miR9746 家族成員共有8 個，分別為gma-miR9746a、gma-miR9746b、gma-miR9746c、gma-miR9746d、gma-miR9746e、gma-miR9746f、gma-miR9746g 以及gma-miR9746h，8 個家族成員分別與GmDHQ-SDH12和GmDHQSDH13有1對對應關系。見表3。

表3 靶向調控大豆GmDHQ-SDH基因的miRNATab.3 miRNA targeting GmDHQ-SDH gene in soybean

2.7 GmDHQ-SDHs家族成員啟動子區順勢作用元件分析

13個家族成員的順式作用元件無論在類別或數量上均存在差異，其中，光響應元件在所有元件中出現的頻率最高，據此推測大豆的DHQ-SDH基因在大豆生長發育響應光調控的過程中具有重要作用。此外，鑒定出的生長發育調控響應包括胚乳表達響應元件、分生組織表達響應元件和柵欄葉肉細胞響應元件。而且，在啟動子區鑒定出了逆境脅迫響應元件，其中包括低溫響應元件、干旱響應元件、厭氧感應元件，表明在受到這些脅迫時，響應元件會提高植株自身的抵抗能力。鑒定出的激素應答響應元件共有4種，數量由多至少依次為脫落酸響應元件、茉莉酸甲酯響應元件、生長素響應元件、水楊酸響應元件。見圖6。

圖6 GmDHQ-SDHs基因啟動子區順勢作用元件分析Fig.6 Analysis of cis-acting elements in the promoter region of GmDHQ-SDHs gene

3 討論與結論

DHQ-SDH可以促進莽草酸的合成［26］。據報道，煙草DHQ-SDH基因可能參與碳源向次生代謝的運輸［27］。筆者通過生物信息學方法共鑒定出13個大豆DHQ-SDH基因家族成員，大豆DHQ-SDH基因家族成員蛋白的理化性質和亞細胞定位分析顯示，GmDHQ-SDH 蛋白均屬于穩定蛋白，且大部分為疏水蛋白，分別位于葉綠體、過氧物酶體和胞液中，該結果與王梅等［28］在巨尾桉EuDQD/SDH5中發現的類似。保守基序分析表明，大豆DHQ-SDH基因家族成員共分為4 組，因為處于同一組中的家族成員親緣關系較近，所以猜測GmDHQ-SDH4和GmDHQ-SDH5親緣關系較近，GmDHQ-SDH8和GmDHQ-SDH9親緣關系較近，GmDHQ-SDH7與GmDHQ-SDH11親緣關系較近，GmDHQ-SDH12和GmDHQ-SDH13親緣關系較近，而且，該家族成員均包含DHQas_1 結構域，說明其保守性很高，與SINGH 等［12］的研究結果相同。但是有些成員不具備構成SDH_C 結構域的Motif9，說明GmDHQ-SDH也具有很高的功能多樣性。系統進化分析結果表明，At3g06350、Solyc01g067750、GmDHQ-SDH1、GmDHQ-SDH3、GmDHQ-SDH12、GmDHQ-SDH13位于同一組別，由此推測上述基因具有相似功能。基因結構分析表明，所有家族成員含有的內含子數量為7～11 個，其中，GmDHQ-SDH3的內含子最長。順式作用元件分析表明，大豆DHQ-SDH基因家族成員啟動子區的順式作用元件共分為4類（光響應元件、逆境脅迫響應元件、激素應答響應元件、生長發育調控響應元件），其中，光響應元件出現頻率最高，據此推測大豆GmDHQ-SDH基因在大豆植株成長時對光的變化能夠迅速地做出響應。與此同時，鑒定出了逆境脅迫響應元件，HAN等［13］研究發現，低溫可誘導淡水綠藻水綿DHQ-SDH基因家族成員上調表達。該家族成員具有的激素應答響應元件能夠響應茉莉酸甲酯、脫落酸、水楊酸、赤霉素以及生長素，推測GmDHQ-SDH可以通過響應以上激素應答，參與調控非生物脅迫，從而增加植株對逆境的耐受能力。張林等［11］在煙草中發現NtDHQ-SDHs除具備上述元件外，還具有組成型原件，所以推測DHQ-SDH基因具有更豐富的功能。