基于肌醇需求激酶1α/c-Jun氨基末端激酶信號通路探討膽寧片干預非酒精性脂肪性肝病的作用及機制*

徐美玲，茍小軍，曾曉丹，趙紫龍，鄭姣妮

（1.重慶市第四人民醫院·重慶市急救醫療中心·重慶大學附屬中心醫院，重慶 400014； 2.上海市寶山區中西醫結合醫院，上海 201999； 3.重慶醫科大學附屬璧山醫院·重慶市璧山區人民醫院，重慶 402760）

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是一種與胰島素抵抗（IR）和遺傳易感性密切相關的代謝應激性肝臟損害［1］，其基本病理生物學為氧化應激和脂質過氧化，氧化應激為良性過程，而脂質過氧化傾向于發展為晚期纖維化甚至肝硬化［2］。NAFLD 發病機制復雜，目前缺乏特效治療藥物。因此，早期干預和治療十分重要。內質網應激（ERS）在NAFLD 的發生、發展、轉歸過程中十分關鍵［3］，且肌醇需求激酶1α/ c - Jun 氨基末端激酶（IRE1α/ JNK）介導的ERS 信號通路參與了NAFLD 的發病及進展［4］，而JNK通路的激活可引起胰島素受體底物1（IRS1）絲氨酸307 位點（Ser307）發生磷酸化，阻礙胰島素信號傳導，抑制外周組織的胰島素生物學效應，形成IR［5］，IR又可導致NAFLD。激活的JNK可活化其下游靶標IRS1 在307 位點的絲氨酸，以減弱胰島素的敏感性［6］。膽寧片具有抗炎和抗結石作用，且可改善肝臟的脂肪變性，從而保護肝臟和膽囊免受傷害，已被廣泛應用于慢性膽囊炎、膽固醇結石等膽道疾病的治療，且其治療NAFLD的療效確切，能更好地改善肝功能，緩解臨床癥狀，無嚴重不良反應［2］，但其作用機制尚不明確。因此，本研究中探討了膽寧片基于IRE1α/JNK 信號通路干預NAFLD的作用及機制。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動物

儀器：BX53型生物顯微鏡（奧林巴斯北京銷售服務有限公司）；RM 2016 輪轉式切片機，819 型切片刀，均購自上海徠卡儀器有限公司；JT-12J 型電腦生物組織脫水機，JK - 6 型生物組織攤烤片機，JB - P5 型包埋機，均購自武漢俊杰電子有限公司；DYCZ-24DN 型垂直電泳槽，DYCZ - 40 型電泳儀，均購自北京六一儀器廠；TS-1 型水平搖床（江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司）；T8-1型磁力攪拌器（江蘇省常州市金壇區中大儀器廠）；mμlISKANMK3 型酶標儀（Thermo Fisher公司）；X 光膠片（銳珂<廈門>醫療器材有限公司，批號為6535876）；HI650 型離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）。

試藥：膽寧片（上海和黃藥業有限公司，國藥準字Z10910040，批號為051003，規格為每片0.36 g）；多烯磷脂酰膽堿膠囊（賽諾菲安萬特< 北京> 制藥有限公司，國藥準字H20059010，批號為DBJD042，規格為每粒228 mg）；苯甲基磺酰氟（PMSF，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號為P408676）；四甲基乙二胺（TEMED，國藥集團化學試劑有限公司，批號為80125336）；電化學發光（ECL）底物液（北京普利萊基因技術有限公司，批號為P1050）；兔多抗IRE1a（批號為A17940），兔多抗磷酸化IRS1（p-IRS1，批號為AP0552），均購自愛博泰克生物科技有限公司；兔多抗JNK1（批號為66210-1-Ig），辣根過氧化物酶（HRP）標記羊抗小鼠二抗（批號為RGAM001），均購自武漢三鷹生物技術有限公司；放射免疫沉淀試驗（RIPA）裂解液（批號為P0013B），磷酸酶抑制劑（批號為P1045 - 2），二辛可酸（BCA）蛋白濃度測定試劑盒（批號為P0012），HRP 標記羊抗兔二抗（批號為A0208），均購自碧云天生物技術有限公司。

動物：6 周齡SD 大鼠32 只，SPF 級，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，動物許可證號為SCXK（滬）2017-0005，動物合格證號為20170005068918。飼養于上海中醫藥大學實驗動物中心SPF 級動物房，自由飲水，控制溫度為20～26 ℃，相對濕度為30%～70%，每小時至少換氣8次，12 h/12 h明暗交替。

1.2 方法

分組、造模與給藥：將32 只SD 大鼠在SPF 級動物房飼養，給予普通飼料喂養1周，隨機分為正常組（A組，8 只）和高脂肪飼料組（24 只）。A 組大鼠以正常飼料喂養，高脂飼料組大鼠以高脂飼料（質量比為基礎鼠糧40%、豬油30%、酪蛋白22.3%、膽固醇1%、維生素1%、礦物質3.5%、纖維素2%、氯化鈉0.2%）喂養10 周造模。將造模成功的大鼠隨機分為模型組（B 組）、多烯磷脂酰膽堿組（C組）、膽寧片組（D組），各8只。C組和D組大鼠按0.5 mL/100 g體質量分別灌胃142.5 mg/（kg·d）多烯磷脂酰膽堿溶液和562.5 mg/（kg·d）膽寧片溶液。藥物溶液每周配制1 次，于2～8 ℃冰箱保存，分裝至50 mL離心管，給藥前充分混勻。A組和B組大鼠予相應劑量的滅菌生理鹽水。

血清生化指標檢測及肝組織病理形態觀察：給藥6周后，大鼠先禁食12 h，檢測空腹血糖；腹腔注射40 mg/kg 1%戊巴比妥，麻醉大鼠，心臟取血，4 ℃靜置30 min 后，離心收集上清液，- 80 ℃低溫保存。采集肝組織，用生理鹽水漂洗，去除血漬和污物，并剔除結締組織、脂肪組織等非研究所需組織類型，吸干，分為2 份。其中1 份放入10%中性福爾馬林緩沖液中固定，另1 份放入EP管中，液氮速凍后封口，- 80 ℃低溫保存。觀察大鼠的體質量和血糖。按相關試劑盒說明書檢測血清胰島素（INS）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、游離脂肪酸（NEFA）、丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）水平。采用蘇木精- 伊紅（HE）染色法觀察大鼠肝組織的病理形態變化，采用油紅染色法觀察肝組織的脂質沉積。

免疫印跡（Western blot）法檢測IRE1α，JNK1，p-IRS1蛋白表達水平：采用RIPA 裂解液提取肝臟組織蛋白，采用BCA 法測定總蛋白濃度。100 ℃溫度下煮沸，制備變性蛋白樣品。蛋白樣品經十二烷基硫酸鈉- 聚丙烯酰胺凝膠（SDS - PAGE）電泳，采用濕法將蛋白條帶轉移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，用5%牛血清白蛋白（BSA）或脫脂奶粉的三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽溶液（TBST）封閉2 h，一抗（β-actin 1∶5 000、IRE1a 1∶1 000、p - IRS1 1∶1 000、JNK1 1∶5 000）4 ℃孵育過夜。洗去多余一抗，采用TBST 稀釋相應的HRP 標記二抗1∶600 稀釋，使PVDF 膜浸泡于二抗孵育液中，室溫孵育2 h，洗膜后加入發光液，壓片，曝光，顯影。

1.3 統計學處理

采用SPSS 21.0 統計學軟件分析。計量資料以±s表示，行t檢驗；組間比較采用單因素方差分析，行LSD法檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 體質量、血糖和血清INS

與A組比較，B組大鼠血糖均顯著升高（P<0.01），胰島素分泌顯著減少（P< 0.01）；與B 組比較，C 組和D 組大鼠血糖顯著降低（P< 0.05），血清INS 顯著升高（P<0.01）。詳見表1。

表1 膽寧片對NAFLD模型大鼠體質量、血糖和胰島素的影響（±s，n=8）Tab.1 Effect of Danning Tablets on body weight，blood glucose and insulin of NAFLD model rats（±s，n = 8）

表1 膽寧片對NAFLD模型大鼠體質量、血糖和胰島素的影響（±s，n=8）Tab.1 Effect of Danning Tablets on body weight，blood glucose and insulin of NAFLD model rats（±s，n = 8）

注：與A組比較，*P < 0.01；與B組比較，#P < 0.05，△P < 0.01。表2、表3和圖3同。Note：Compared with those in group A，*P < 0.01；Compared with those in group B，#P < 0.05，△P < 0.01（for Tab.1 - 3 and Fig.3）.

INS（mU/L）37.92±2.54 26.58±3.77*36.59±3.68△41.17±2.93△組別A組B組C組D組體質量（g）612.36±33.92 656.58±57.93 676.22±52.05 652.81±51.70血糖（mmol/L）6.80±0.33 7.84±0.78*7.19±0.30#6.73±0.87△

2.2 血清生化指標

與A 組比較，B 組大鼠血清TC，TG，LDL - C，NEFA，ALT，AST 水平均顯著升高（P< 0.01），HDL - C水平顯著降低（P<0.01）；與B 組比較，C 組和D 組大鼠血清TC，NEFA，ALT，AST 水平均顯著降低（P<0.05），HDL-C水平均顯著升高（P<0.05）。詳見表2。

表2 膽寧片對NAFLD模型大鼠血清生化指標的影響（±s，U/L，n=8）Tab.2 Effect of Danning Tablets on serum biochemical indicators of NAFLD model rats（±s，U / L，n = 8）

表2 膽寧片對NAFLD模型大鼠血清生化指標的影響（±s，U/L，n=8）Tab.2 Effect of Danning Tablets on serum biochemical indicators of NAFLD model rats（±s，U / L，n = 8）

組別A組B組C組D組TC 1.94±0.30 4.02±0.55*3.55±0.49#2.69±0.28△TG 1.72±0.18 2.61±0.53*2.60±0.80 1.58±0.29△HDL-C 1.39±0.11 0.85±0.18*1.08±0.19#1.30±0.16△LDL-C 0.75±0.25 1.23±0.29*1.06±0.13 0.80±0.18△NEFA 0.40±0.09 0.70±0.12*0.57±0.14#0.54±0.05△ALT 4.72±0.96 6.90±0.98*6.06±0.47#4.43±0.71△AST 7.18±0.79 10.39±1.10*9.28±0.80#7.82±0.73△

2.3 肝臟組織形態及病理變化

喂養10 周時，A 組大鼠肝細胞形態規則，大小均勻，無腫脹和脂肪樣變，肝索排列整齊；B組大鼠肝索排列紊亂，肝臟出現脂肪樣變，部分肝細胞腫脹，肝細胞的細胞質內可見脂滴空泡。詳見圖1。喂養16 周時，與B 組大鼠比較，D 組大鼠較B 組脂肪變性程度及細胞腫脹明顯減輕，脂滴空泡體積縮小，數量減少。詳見圖2。

圖1 A組和B組大鼠喂養10周時的肝臟組織病理學蘇木精-伊紅染色圖（×200，n=8）Fig.1 HE staining of liver histopathology of rats in group A and group B after feeding for 10 weeks（×200，n = 8）

2.4 肝臟組織IRE1α，JNK1，p-IRS1 蛋白表達水平

與A 組比較，B 組大鼠肝臟組織的IRE1α，JNK1，p-IRS1表達水平均顯著升高（P<0.01）；與B 組比較，C組和D組大鼠肝臟組織的IRE1α，JNK1，p-IRS1表達水平均顯著降低（P<0.01）。詳見表3和圖3。

表3 各組大鼠肝臟組織IRE1α，JNK1，p-IRS1蛋白表達水平比較（±s，n=8）Tab.3 Comparison of IRElα，JNK1，and p - IRSI protein expression levels in liver tissues of rats in each group（±s，n = 8）

表3 各組大鼠肝臟組織IRE1α，JNK1，p-IRS1蛋白表達水平比較（±s，n=8）Tab.3 Comparison of IRElα，JNK1，and p - IRSI protein expression levels in liver tissues of rats in each group（±s，n = 8）

p-IRS1 0.238±0.030 0.724±0.041*0.464±0.005△0.468±0.021△組別A組B組C組D組IRE1α 0.321±0.038 0.730±0.031*0.538±0.023△0.542±0.009△JNK1 0.174±0.008 0.561±0.008*0.311±0.012△0.325±0.022△

3 討論

NAFLD 全球患病率為6%～35%［7］，約50%的患者經過4～13年后可發展為非酒精性脂肪性肝炎，40%的發展為肝纖維化［8-9］。預計2030 年我國NAFLD 患者會超過3 100 萬，將成為世界上患病人數最多、增長速度最快的國家［10-11］。臨床主要采用調脂和保肝治療，有一定療效，但胃腸道反應嚴重，導致患者依從性較差。西醫治療NAFLD以合理飲食、控制體質量、適當運動為主，但易反復；且部分患者合并有高脂血癥，單純控制體質量無效，加用他汀類調脂藥物又易引起新的肝功能損傷［12-13］。

復方中藥制劑成分眾多，具有多成分、多靶點、多途徑的獨特優勢［14］。中藥方劑由不同藥材組方，有助于治療發病機制復雜的NAFLD，且中藥治療NAFLD 具有不良反應少、前景廣闊的特點［15-16］。膽寧片由大黃、虎杖、青皮、白茅根、陳皮、郁金、山楂組方，具有清熱化濕、疏肝利膽的作用，用于治療急慢性膽囊炎、膽道感染、膽結石等。王卓媛等［2］的研究結果顯示，與單用西藥相比，膽寧片聯合西藥治療NAFLD的療效更佳，可明顯降低ALT，AST，TG，TC 水平。本研究結果顯示，與B 組比較，D 組大鼠的脂肪變性程度及細胞腫脹明顯減輕，脂滴空泡體積縮小，數量減少，提示給予膽寧片后，經高脂飲食喂養的NAFLD 模型大鼠的血糖、血脂水平均顯著下降，膽寧片對大鼠的肝臟功能、肝細胞脂肪變性均有防護作用。

NAFLD 確切的發病機制尚未完全闡明［17］，普遍認可的NAFLD 發病機制為“二次打擊學說”，主要包括以IR 為主的“一次打擊”和以氧化應激、肝細胞大量炎性壞死和纖維化為主的“二次打擊”。馮雯敏等［15］研究發現，NAFLD 的發生受ERS、腸道菌群紊亂、環境因素、遺傳易感性等“多重打擊”影響。也有研究認為，ERS 信號傳導與肝臟脂質代謝，炎癥，胰島素作用和凋亡密切相關［18-19］。高脂飲食、缺氧、饑餓、氧化應激、鈣離子穩態失衡、藥物、自由基侵襲等多種原因可導致ERS 的發生。IRE1 是介導ERS 信號轉導的跨膜蛋白之一。IRE1α是IRE1的主要結構，存在于內質網膜上，具備激酶和內切酶活性。當ERS 被誘發時，IRE1α 被激活。JNK 信號通路是絲裂原活化蛋白激酶家族中的重要成員，在IR 中起重要作用，有JNK1，JNK2，JNK3 3 種亞型，均屬絲氨酸/ 蘇氨酸蛋白激酶，主要存在于細胞質中［20］。其中，JNK1亞型參與了脂肪肝的發生、發展，其水平與脂肪肝程度呈正相關。KODOMA 等［3］通過敲除小鼠的JNK1 和JNK2 基因的對比實驗發現，相較于JNK2 基因敲除小鼠，JNK1基因敲除小鼠的肝臟脂肪病變明顯改善，有效逆轉了NAFLD 程度。徐嘉妤等［4］研究發現，IRElα/JNK介導的ERS 信號通路參與了NAFLD 的發病及進展。SUN 等［21］研究發現，IRE1α/JNK 途徑的活化是高果糖飲食小鼠肝臟中肝臟胰島素信號轉導受損的關鍵因素。吳鵬波等［22］探討了IRE1α/ JNK 通路對早期NAFLD 作用，發現IRE1α/JNK 通路通過調節自噬和凋亡對早期NAFLD 起保護作用。IRS1 是胰島素信號轉導通路中受體水平的重要信號蛋白，而JNK 通路的激活可引起IRS1 Ser307 位點發生磷酸化，阻礙胰島素信號傳導，抑制外周組織的胰島素生物學效應，形成IR［5］。本研究結果顯示，B 組大鼠肝臟組織的IRE1α，JNK1，p - IRS1 蛋白表達水平均較A 組顯著升高（P< 0.01），而D 組大鼠肝臟組織的IRE1α，JNK1，p - IRS1 蛋白表達水平均較B 組顯著降低（P<0.01），提示高脂飲食誘導的NAFLD 可激活大鼠脂肪組織ERS 信號通路，膽寧片對NAFLD模型大鼠肝臟組織ERS的激活有顯著的緩解作用。

綜上所述，膽寧片可能通過下調IRE1α/JNK 信號通路，減輕肝臟脂肪變性，從而改善NAFLD。