QuEChERS-超高效液相色譜串聯質譜法測定雞蛋中甲硝唑和地美硝唑藥物殘留量

摘 要：建立了QuEChERS結合超高效液相色譜串聯質譜法測定雞蛋中甲硝唑和地美硝唑殘留量的方法。樣品經乙腈提取，QuEChERS凈化后，使用Agilent Eclipse Plus C18柱分離，以乙腈和0.1%甲酸水溶液為流動相進行洗脫，多反應監測模式下檢測，外標法定量。結果表明，甲硝唑和地美硝唑的質量濃度在0～50 ng·mL-1時線性關系良好（r2＞0.999），檢出限分別為0.002 μg·kg-1、0.007 μg·kg-1；在低、中、高3個添加水平下甲硝唑和地美硝唑的加標回收率分別為95.79%～97.80%、95.66%～100.10%。該方法前處理簡單、重現性好、靈敏度高，適用于雞蛋中甲硝唑、地美硝唑的測定。

關鍵詞：雞蛋；甲硝唑；地美硝唑；QuEChERS；超高效液相色譜串聯質譜法

Determination of Metronidazole and Dimetridazole Residues in Eggs by QuEChERS Combined with Ultra-High Performance Liquid Chromatography Tandem-Mass Spectrometry

WANG Yi

（Guangdong Huizhou Quality and Measuring Supervision Testing Institute， Huizhou 516000， China）

Abstract： A QuEChERS combined with ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry method was established to determine the residues of metronidazole and dimetridazole in eggs. The sample was extracted with acetonitrile， purified with QuEChERS， and separated using an Agilent Eclipse Plus C18 column. The mobile phase was eluted with acetonitrile and 0.1% formic acid aqueous solution， and detected under multiple reaction monitoring mode. The external standard method was used for quantification. The results showed that the mass concentrations of metronidazole and dimetridazole were linear in the range of 0～50 ng·mL-1?（r2＞0.999）， and the detection limits were 0.002 μg·kg-1 and 0.007 μg·kg-1; under low， medium and high addition levels， the recoveries were 95.79%～97.80%， 95.66%～100.10% respectively. The method is simple， reproducible and sensitive， and is suitable for the determination of metronidazole and dimetridazole in eggs.

Keywords： eggs; metronidazole; dimetridazole; QuEChERS; ultra-high performance liquid chromatography tandem-mass spectrometry

雞蛋含有非常豐富的卵磷脂、脂肪、蛋白質、微生物、礦物質、微量元素等營養成分，被譽為“全營養”食品[1]，現已成為日常飲食中的重要組成部分。

甲硝唑、地美硝唑是人工合成的硝基咪唑類藥物，主要用于治療或者預防家禽的厭氧菌感染、滴蟲病感染以及生殖系統疾病等[2]，但該藥物對人體會產生較大危害。根據《食品安全國家標準 食品中獸藥最大殘留限量》（GB 31650—2019），甲硝唑和地美硝唑可以作為治療使用，但不可以在動物性食品中檢出[3]。但部分養殖戶對此類藥物的毒副作用了解不全面，在飼養過程中超量使用，帶來了藥物殘留問題[4]。

近幾年，我國制定、發布了一些針對硝基咪唑類等藥物的檢驗檢測標準[5-7]，但是針對雞蛋中硝基咪唑藥物殘留的檢測標準較少。超高效液相色譜-串聯質譜法具有靈敏度高、特異性好以及穩定的優點，現已成為檢測這些藥物的首選方法[8]。在前處理環節，常用的凈化方式有固相萃取凈化法、分子印跡凈化法等[9]，但存在操作較復雜、試劑消耗量大、檢測耗時長、容易損失等問題。QuEChERS法具有快速、簡單、廉價、高效、可靠和安全的特點[10]，目前在獸藥殘留分析中已逐漸推廣和應用。

本文結合QuEChERS法，通過超高效液相色譜-串聯質譜法對雞蛋中甲硝唑、地美硝唑進行測定，有效縮短了實驗分析時間，同時提高了實驗回收率、節約了檢測成本。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞蛋，市售；甲硝唑（MNZ）、地美硝唑（DMZ）標準品，純度＞99%，購于DR；甲醇、乙腈（色譜純，默克）；甲酸（色譜純，阿拉丁）；實驗用水為純水機制備的一級水。

1.2 儀器與設備

LC1290超高效液相色譜儀、QQQ-6470液質聯用儀（安捷倫）；KQ-600DV數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；TurboVap氮吹儀（Biotage）；BC-1000多管渦旋混合儀（深州逗點生物技術有限公司）；H1750R冷凍離心機（湖南湘儀實驗儀器開發有限公司）；UPL-Ⅱ-40U落地式超純水機。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準溶液的配制

標準儲備液（1 000 mg·L-1）：分別精密稱取甲硝唑、地美硝唑10 mg，用甲醇稀釋并定容至10 mL，配制成濃度為1 000 mg·L-1的甲硝唑、地美硝唑標準儲備液。

混合標準中間液：吸取甲硝唑、地美硝唑標準儲備液，用甲醇稀釋至終濃度為1.0 mg·L-1。

基質標準工作液：分別稱取6份5 g不含甲硝唑、地美硝唑的雞蛋樣品于50 mL塑料離心管，分別準確加入混合標準中間液，使得最終濃度為0 ng·mL-1、1 ng·mL-1、5 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、50 ng·mL-1，其余操作同上。

1.3.2 樣品處理

（1）樣品制備。取有代表性的樣品約500 g，敲入足夠大的容器中，用組織搗碎機混勻后分裝入潔凈容器中，待處理[11]。

（2）樣品的提取。稱取5 g上述已制備好的樣品于50 mL塑料離心管中，加入20 mL乙腈，再加入緩沖鹽包（安譜dSPE定制獸藥緩沖鹽包），渦旋10 min，超聲波提取5 min后，9 000 r·min-1離心

5 min，得到上清液待凈化。

（3）凈化和濃縮。將上述提取液轉移至凈化管（安譜dSPE定制獸藥凈化管），渦旋5 min，9 000 r·min-1離心5 min。取5 mL上清液于10 mL玻璃試管中，40 ℃下氮吹至近干狀態，加入10%乙腈水溶液復溶，過0.22 μm濾膜，待測定。

1.4 測定條件

1.4.1 色譜條件

流動相A為0.1%甲酸水溶液，B為乙腈；流速為0.4 mL·min-1；進樣量為5 μL；色譜柱為Agilent Eclipse Plus C18（3.0 mm×100 mm，1.8 μm）；柱溫為40 ℃；洗脫方式為梯度洗脫，洗脫程序見表1。

1.4.2 質譜條件

離子源AJS-ESI；毛細管電壓3 500 V；干燥器溫度300 ℃；鞘氣溫度300 ℃；鞘氣流量12 L·min-1；干燥氣流量13 L·min-1；霧化氣壓力35 psi；多重反應監測（Multiple Reaction Monitoring，MRM）。

2 結果與分析

2.1 凈化方式和復溶劑的選擇

分別使用固相萃取小柱（混合型強陽離子交換反向固相萃取柱）和QuEChERS對樣品進行處理，選擇高效凈化雞蛋的方法。結果顯示，使用QuEChERS凈化的回收率高于固相萃取小柱，綜合考慮固相萃取小柱需要活化以及洗脫、溶劑使用量大、效率較下等因素，本文選用QuEChERS法凈化樣品。

前期實驗采用10%乙腈水溶液、50%乙腈溶液以及純乙腈溶液進行復溶。結果顯示，使用10%乙腈水時目標物的離子響應強度最高，峰型以及分離度最佳，故本文選用10%乙腈水溶液進行復溶。

2.2 質譜條件的選擇

對濃度為0.1 mg·L-1的甲硝唑、地美硝唑標準溶液進行SCAN全掃描，確定母離子、定性離子和定量離子，在多反應檢測模式下對碰撞電壓、碰撞能量進行優化，最終確定質譜條件，詳見表2。

2.3 流動相的選擇

考察流動相體系中加入甲酸、乙酸銨和甲酸銨對目標物的分離效果以及離子響應強度的影響。結果表明，當流動相體系加入甲酸后，目標物離子響應強度增大，峰型對稱尖銳，分離效果好；加入乙酸銨和甲酸銨后，目標物離子響應強度下降，色譜峰存在展寬、拖尾的現象，故本文選用0.1%甲酸水和乙腈作為流動相。

2.4 基質效應

基質效應（Matrix Effects，ME）是保證定量結果準確的關鍵控制點，本次研究使用溶劑標準曲線斜率和基質標準曲線斜率的比值對基質效應進行判定。當ME=1時，基質對目標化合物沒有基質效應；當ME＞1時，基質對目標化合物有增強效應；當ME＜1時，基質對目標化合物有抑制效應。本次實驗結果顯示，甲硝唑和地美硝唑的ME分別為1.71、2.31，表明雞蛋對兩個目標化合物均有較強的基質效應，故選用基質標準溶液曲線對待測物進行定量。

2.5 標準曲線

按1.4項條件進樣，以標準溶液峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，分別繪制標準曲線。回歸方程、相關系數如表3所示，在0～50 ng·mL-1，峰面積與目標物濃度線性關系良好，相關系數均大于0.999。

2.6 方法檢出限與定量限

分別以3倍和10倍信噪比計算檢出限和定量限，結果見表3。甲硝唑和地美硝唑的檢出限分別為0.002 μg·kg-1、0.007 μg·kg-1，定量限分別為0.007 μg·kg-1、0.023 μg·kg-1，此方法檢出限較低，滿足測定要求。

2.7 精密度和加標回收率

按1.3.2項下方法對樣品進行處理，進行低、中、高3個水平加標回收實驗，計算甲硝唑、地美硝唑的回收率和相對標準偏差。由表4可知，甲硝唑加標回收率在95.79%～97.80%，RSD在2.22%～4.16%；地美硝唑加標回收率在95.66%～100.10%，RSD為2.17%～3.65%。

2.8 樣品分析

隨機抽取市售雞蛋共20批次，采用本方法進行檢測。結果表明，這20批次雞蛋中均未檢出甲硝唑和地美硝唑。

3 結論

本研究建立了雞蛋中甲硝唑和地美硝唑殘留量的QuEChERS-超高效液相色譜串聯質譜法檢測方法。樣品經過乙腈提取，QuEChERS凈化濃縮后供UPLC-MS/MS檢測，該方法操作簡單、靈敏度高、重現性好，可以為雞蛋質量安全監測提供一定的技術支持。

參考文獻

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[2]王艷，王淼，劉菊才，等.超高效液相色譜-串聯質譜法同時檢測雞蛋中甲硝唑與地美硝唑及其代謝物殘留[J].現代農業科技，2020（22）：191-193.

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作者簡介：王易（1997—），女，浙江寧波人，本科，工程師。研究方向為食品方向。