電針對腦出血后偏癱痙攣大鼠脊髓頸膨大處GluR2表達的影響

任慧玲,盧旭東,趙慶林,趙大巍,郭榮彬,李常法,步 瑋

(河北醫(yī)科大學第三醫(yī)院,河北 石家莊 050051)

腦出血指原發(fā)性、非外傷性腦實質內血管破裂引起的出血,患者病死率高,而存活者普遍存在不同程度的后遺癥狀,不僅嚴重影響患者生活質量,且給個人與家庭、社會造成了沉重的經濟負擔[1-2]。既往研究證實,早期對腦出血患者進行電針治療有助于改善繼發(fā)性運動功能障礙[3-4],但繼發(fā)性運動功能障礙發(fā)生機制和電針作用機制尚不明確。隨著研究的逐步深入,發(fā)現腦出血患者血清與腦脊液中谷氨酸含量明顯升高,谷氨酸過度分泌能導致神經細胞在內的多種細胞受損,造成神經系統(tǒng)功能障礙,這與繼發(fā)性運動障礙密切相關[5]。谷氨酸AMPA受體是由4類R1-R4亞基四聚而成的配體門控離子通道,在快速信號傳導中起重要作用,參與興奮性突觸傳遞[6-7],其中谷氨酸受體2(GluR2)在AMPA受體的信號傳遞中起到關鍵作用[8]。本實驗通過觀察電針對腦出血大鼠脊髓頸膨大處AMPA受體GluR2表達的影響,探究了電針經穴治療腦出血繼發(fā)性運動障礙的機制,以期為針刺治療腦出血后痙攣性癱瘓?zhí)峁嶒炓罁?/p>

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 健康雄性SPF級SD大鼠45只,體重250～280 g,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司,飼養(yǎng)于河北醫(yī)科大學第三醫(yī)院動物實驗中心,動物許可證號:SYXK(京)2021-0006。所有大鼠實驗前均適應性飼養(yǎng)1周,飼養(yǎng)溫度25 ℃,相對濕度50%,12 h/12 h明暗周期,自由飲食飲水,每4只大鼠置于1個鼠籠(485 mm×350 mm×200 mm)。本實驗研究獲得河北醫(yī)科大學第三醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準(NO.Z2022-020-1)。

1.2主要試劑與儀器 Actin抗體(AB0035,美國ABWAYS公司),GluR2抗體(ab206293,英國abcam公司),磷酸化GluR2(p-GluR2)抗體(YP1227,美國immunoway公司),山羊抗兔二抗(BE0101,深圳易瑞生物技術有限公司),山羊抗兔二抗(A23220,美國Abbkine公司),DAB染色試劑盒(DA1015,北京索萊寶);立體定向儀(深圳,瑞沃德),低頻電子脈沖治療儀(17682,上海華誼),曠場箱(上海,欣軟),VisuTrack分析軟件(上海,欣軟),高速離心機(德國,Eppendorf公司),低溫離心機(德國,Eppendorf公司),Purelab Plus去離子水儀(美國,PALL公司)。

1.3分組與造模方法 采用隨機數字表法將大鼠隨機分為假手術組9只、模型組18只、電針組18只。模型組和電針組大鼠參照戴如飛等[9]操作方法進行立體定向腦出血造模:采用1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠,將大鼠俯臥位固定于立體定向儀上,調節(jié)立體定向儀,使門齒鉤平面較耳間線平面低2.4 mm,調節(jié)耳間線,固定耳桿使大鼠頭部無法移動,保持前囪和后囪位于同一平面上。剪去頭頂毛發(fā),以0.5%碘伏消毒液消毒手術區(qū)皮膚,在雙耳間線與雙眼間線之間取2 cm正中切口。切開至皮下,鈍性分離皮下筋膜和骨膜,暴露前囟及“人”字縫。參照《大鼠腦立體定位圖譜》[10]確定內囊位置(前囟后3.3 mm,矢狀縫右側旁開3.1 mm,垂直顱骨表面向下8 mm)后,鉆直徑約2 mm小孔,不要傷及硬腦膜及腦組織。用40 ℃溫水清洗鼠尾使其充血,消毒后剝離尾動脈,使用微量注射器取不抗凝動脈血50 μL,將微量注射器固定在立體定向儀上并通過孔洞進針8 mm至右側內囊。先將動脈血勻速注入10 μL,停針2 min,然后再次均勻緩慢地將動脈血注入40 μL,停針4 min,退針2 mm后再次停針4 min,之后將注射器緩慢地完全退出,縫合切口后用無菌棉球壓迫止血。自體血注射等待期間用無菌紗布包扎鼠尾止血。操作結束后將大鼠緩慢平穩(wěn)地從立體定向儀上移開,進行頭皮縫合并注意消毒。假手術組大鼠除不注射體尾血外,其他操作與造模2組相同。造模后2 h,大鼠自然醒來,按照Zea-longa評分[11]標準(無神經損傷癥狀為0分,不能完全伸展對側前爪為1分,向對側轉圈為2分,向對側傾倒為3分,不能自發(fā)行走且意識喪失為4分)和改良Ashworth肌張力評分量表[12](0級:無肌張力升高,大鼠活動自如;1級:肌張力輕度增高,抓握中被動屈伸至最后有小的阻力;1+級:輕度增高,抓握至一半運動半徑以上有輕度阻力增加;2級:在大部分運動半徑中肌張力都有明顯增高,但肢體被動運動容易;3級:肌張力明顯增高,被動活動困難;4級:受累部分肢體強直性屈曲或伸直)分別評估大鼠神經功能缺損程度和肌張力情況,將Zea-longa評分1～3分、改良Ashworth肌張力評分量表評分1～4分的大鼠視為腦出血造模成功[13],剔除不符合此條件大鼠,用同一批次造模成功的大鼠補足數量。將造模成功的大鼠按2只/籠進行常規(guī)飼養(yǎng),給予充足的水和鼠糧;對于Ashworth評分在4分和(或)Zea-longa評分在3分的重癥大鼠,將食物與水置于大鼠嘴邊,避免因進食進水不順等原因導致死亡。

1.4術后干預方法 電針組大鼠于造模成功后第2天開始進行電針干預。參照《實驗針灸學》[14]取曲池(在橈骨近端肘關節(jié)外側前方的凹陷處)和足三里穴(在后肢膝關節(jié)外下方當腓骨小頭下約5 mm處),其中曲池穴直刺4 mm,足三里穴直刺7 mm,采用疏密波,頻率2 Hz/100 Hz,電流強度逐漸調節(jié)至針刺部位出現有節(jié)律的收縮、顫動且大鼠不嘶叫、不掙扎為度,約為1 mA,每次30 min,每天最多1次。假手術組與模型組大鼠正常喂養(yǎng),自由進食進水,不施加任何干預措施。

1.5檢測指標及方法 術后第3天、第7天每組各取9只大鼠(假手術組只檢測1次)進行行為學檢測,檢測結束后處死各組大鼠,取脊髓頸膨大處組織,部分置于-80 ℃冰箱中凍存,部分制備石蠟切片備用。

1.5.1行為學 采用Zea-longa評分和改良Ashworth分級評分評估大鼠神經功能狀態(tài)和肌張力,然后在安靜、遮光的條件下于9:00—17:00進行曠場實驗。曠場實驗方法:實驗前30 min將大鼠置于檢測室內以適應環(huán)境,減少對實驗動物自主行為的影響。實驗期間將大鼠輕柔置于實驗箱中央區(qū)域,任其自由探索900 s,實驗箱正上方安裝攝像頭,其視野可覆蓋整個曠場內部,記錄15 min內大鼠的運動路程、運動速度、靜止時間并同步錄像。攝像頭跟蹤描繪動物運動軌跡,繪制每只大鼠實驗活動軌跡圖。每只大鼠測試結束后消毒、清洗實驗箱, 自然風干后放入下一只大鼠。

1.5.2脊髓頸膨大處GluR2蛋白表達情況 采用Western blot法檢測:取出凍存頸膨大組織,用裂解液研磨提取總蛋白,用BCA法測定蛋白濃度,配置蛋白樣本,煮沸變性,每孔加入20 μg上樣蛋白并采用SDS-PAGE法電泳。通過轉膜儀將蛋白轉移至PVDF膜,轉膜條件:電流120 mA,電壓60 V左右,轉膜時間60 min。封閉液封閉1 h,滴加GluR2(1∶1 000)、p-GluR2(1∶1 000)、Actin(1∶10 000)抗體4 ℃反應過夜。山羊抗兔二抗(BE0101,深圳易瑞生物技術有限公司)室溫孵育1 h后洗膜。采用Image J軟件分析目標條帶GluR2、p-GluR2及內參Actin的灰度值,計算出目標蛋白與內參的比值。

1.5.3脊髓頸膨大處GluR2陽性表達情況 采用免疫組織化學法檢測:將石蠟切片切片放于60 ℃烤箱60 min,二甲苯脫蠟3次,每次15 min。依次用無水乙醇、90%乙醇、70%乙醇、雙蒸水各洗脫3次,每次2 min;將切片置于pH為6.0的10 nmol/L檸檬酸鈉溶液中,95 ℃加熱30 min進行抗原修復,室溫冷卻后,蒸餾水水洗2次,2 min/次,后用PBS洗3次,5 min/次。于37 ℃溫箱血清封閉20 min后加一抗GluR2抗體(1∶300),4 ℃過夜,PBS洗滌3次。于室溫晾干,加入二抗山羊抗兔(1∶500;A23220,美國Abbkine公司),37℃孵育1h,PBS洗滌3次,5 min/次。滴加50 μL鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶,室溫孵育10 min,PBS洗滌3次;加入100 μL新配制的DAB溶液,室溫孵育3～10 min,光學顯微鏡下觀察,顯色完全后自來水沖洗切片,以終止顯色反應;之后蘇木素復染,梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹脂封片。每只大鼠選取100,200,400倍率的3張腦組織切片,在光學顯微鏡下觀察GluR2陽性表達情況。各組切片隨機選取400倍率下3個不重復的視野,用圖像分析軟件分析GluR2陽性表達平均光密度值,累加后取均值。

2 結 果

2.1各組大鼠Zea-longa評分和改良Ashworth評分比較 術后第3天、第7天,模型組Zea-longa評分和左前肢、左后肢的改良Ashworth評分均明顯高于假手術組(P均<0.05),電針組Zea-longa評分和左前肢、左后肢的改良Ashworth評分均明顯低于同期模型組(P均<0.05)。見圖1。

圖1 假手術組和腦出血各組大鼠Zea-longa評分和改良Ashworth評分

2.2各組大鼠曠場實驗結果比較 術后第3天、第7天,模型組大鼠運動總路程明顯短于假手術組(P均<0.05),平均速度明顯慢于假手術組(P均<0.05),靜止時間明顯長于假手術組(P均<0.05);電針組大鼠運動總路程明顯長于模型組(P均<0.05),平均速度明顯快于模型組(P均<0.05),靜止時間明顯短于模型組(P均<0.05)。見圖2。

圖2 假手術組和腦出血各組大鼠曠場實驗結果

2.3各組大鼠脊髓頸膨大處GluR2蛋白表達情況術后第3天、第7天,模型組脊髓頸膨大處GluR2蛋白相對表達量均明顯低于假手術組(P均<0.05),電針組GluR2蛋白相對表達量均明顯高于同期模型組(P均<0.05)。見圖3。

圖3 假手術組和腦出血各組大鼠脊髓頸膨大處GluR2蛋白表達情況

2.4各組大鼠脊髓頸膨大處GluR2陽性表達情況術后第3天、第7天,模型組脊髓頸膨大處GluR2陽性表達平均光密度值均明顯低于假手術組(P均<0.05),電針組GluR2陽性表達平均光密度值均明顯高于同期模型組(P均<0.05)。見圖4。

圖4 假手術組和腦出血各組大鼠脊髓頸膨大處GluR2陽性表達免疫組化染色表現和平均光密度值

3 討 論

腦出血是常見的腦血管疾病,2022年自發(fā)性腦出血患者管理指南[15]表明:腦出血早期病死率約為30%～40%,其中患者發(fā)病后30 d內病死率約為40%,1年內病死率約為54%,僅12%～39%的患者可以獲得長期的神經功能獨立。目前臨床研究表明,電針干預有助于改善腦出血患者的肌張力增高、偏癱痙攣等運動癥狀[3-4]。本實驗結果表明,大鼠腦出血造模后一般狀態(tài)差,Zea-longa評分和改良Ashworth評分明顯增高,說明腦出血導致神經功能損傷及病灶對側肌張力增高;電針組干預后Zea-longa評分和改良Ashworth評分明顯降低,說明電針早期干預能有效改善腦出血后患側肌張力增高和痙攣性偏癱癥狀。

運動功能和肌張力由位于紋狀體的錐體外系介導控制,紋狀體處于大腦皮質(谷氨酸能通路)和黑質(多巴胺能通路)興奮性控制之下。在某些神經退行性疾病發(fā)病過程中,興奮性毒性可能有重要作用[16]。如在運動神經元損傷疾病-肌萎縮側索硬化癥中觀察到由谷氨酸介導的興奮性毒性所引起的肌肉束顫電位和肌肉痙攣[17];尸檢和臨床前實驗也證明,神經元過度興奮會引起軸索甚至神經元本身的退化。這表明腦出血繼發(fā)痙攣性偏癱這類運動障礙可能與谷氨酸能通路有關。

谷氨酸α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異唑丙酸受體(AMPARs) 是由GluR1-4同質或異質亞基二聚后形成的二聚體之間二聚形成的四聚體配體門控離子通道,在中樞神經系統(tǒng)中參與興奮性突觸傳遞[6-7]。AMPA受體亞基二聚由其肽鏈氨基端驅動,GluR1、GluR3、GluR4亞基均優(yōu)先與GluR2進行異二聚,并且以GluR1/2和GluR2/3二聚體在大腦中占比最高[7],而含有GluR4的受體主要是GluA2/GluA4異源二聚體,在胚胎發(fā)育過程中表達突出,在出生后早期表達并較胚胎期急劇減少,且GluR4在中樞系統(tǒng)中含量較低。這說明GluA2亞基對于AMPA受體正常生理功能的形成與維持起關鍵作用。當前研究認為,不含有GluA2的AMPA受體對于Ca2+具有通透性,只有由RNA轉錄后修飾時發(fā)生修飾的GluA2參與組成的AMPAs受體對于Ca2+具有不通透性。AMPA對Ca2+通透性取決于RNA編輯、Q/R編輯,Q谷氨酰胺變?yōu)镽精氨酸,并且這種RNA修飾達到99%,這說明幾乎全部含有GluR2的AMPA受體對于Ca2+是不通透的[18-20]。相關研究發(fā)現,含有Ca2+通透性的AMPA受體神經細胞更容易產生興奮性毒性,可能的機制之一就是通過AMPA受體離子通道開放,使進入細胞的Ca2+增加,造成細胞內鈣超載,最終導致神經細胞死亡,從而導致腦出血后偏癱性痙攣狀態(tài)[21-22],這種現象被稱為鈣離子通透性AMPA受體介導的興奮性毒性[20]。在神經毒性研究中發(fā)現,亞基四聚組裝成AMPA受體過程中GluR2成分的減少,會產生不含有GluR2的AMPA受體,使AMPA受體保持Ca2+通透性狀態(tài),這也支持鈣透性受體增加與細胞死亡有關的假設[23]。細胞內Ca2+的持續(xù)增加不僅可導致神經變性和細胞死亡,還可引發(fā)其他反應,這其中包括氧化應激與神經炎癥反應。Ca2+通透性AMPA受體介導的細胞內過多的Ca2+被線粒體迅速吸收,隨后線粒體釋放活性氧(ROS),且Ca2+積累越多,ROS產生越多,大量的氧自由基造成氧化損傷,介導神經元的死亡,破壞腦組織[24-25]。另外腦出血后,病灶周圍即出現炎癥反應,隨后包括腫瘤壞死因子-α(TNF-α)在內的多個炎癥因子釋放,造成細胞炎性死亡[26-27]。本實驗結果顯示,模型組術后第3天、第7天脊髓頸膨大處GluR2表達量顯著下降,說明內囊部位腦出血導致腦部皮質脊髓束下行神經元即脊髓頸膨大運動神經元死亡;電針組干預后GluR2表達量回升,GluR2的存在使得AMPA受體對于Ca2+的通透性降低,從而有利于阻止AMPA受體介導的興奮性毒性。

綜上所述,電針刺激曲池和足三里穴可以顯著改善腦出血大鼠痙攣性癱瘓癥狀,緩解肌張力增高,推測與上調脊髓頸膨大處AMPA受體GluR2表達,阻止AMPA受體介導的興奮性毒性有關,而GluR2的上游分子與相關機制有待進一步探索研究。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。