微小RNA-148a-3p靶向核心1β13-半乳糖基轉移酶1增強肺腺癌細胞的放療敏感性的研究

申 霖, 任 粵, 鄧一洲, 殷旭東, 陳 勇

(揚州大學附屬醫院 腫瘤科, 江蘇 揚州, 225000)

肺癌是全球范圍內最常見的惡性腫瘤之一,其發病率和病死率居高不下。2020年全球新增了220萬例肺癌病例和180萬例肺癌致死病例,分別排所有惡性腫瘤中的第2位和第1位[1]。在中國,最新數據[2]顯示肺癌病死率居所有惡性腫瘤之首。肺癌的預后不容樂觀,全球大多數國家的肺癌患者5年生存率不超過20%[3]。放射治療是肺癌治療的重要手段,約60%的肺癌在疾病過程中接受放射治療,但放射治療的抵抗性限制了臨床療效。

微小RNA(miRNA)是一類由21～25個核苷酸組成的非編碼RNA分子,其主要與靶基因mRNA的3′非翻譯區(3′UTR)結合,在轉錄后水平抑制基因的翻譯或穩定性,從而降低蛋白的表達水平[4]。研究[5]表明,微小RNA-148a-3p(miR-148a-3p)在多種腫瘤中存在異常表達,并具有重要的生物學調控作用。CHEN Y S等[6]研究發現, miR-148a-3p低表達與腎細胞癌患者的遠處轉移及不良預后有關。LIANG L等[7]研究發現, miR-148a-3p能夠通過抑制絲裂原活化蛋白激酶9(MAP3K9)的表達來抑制肺腺癌細胞的增殖、遷移、侵襲和細胞上皮-間質轉化。

本課題組前期研究[8]發現, miR-148a-3p在肺癌組織中的表達顯著低于正常肺組織, miR-148a-3p可通過負調控Wnt1的表達來抑制肺癌細胞的遷移和侵襲; 肺癌放療抵抗的A549R和H358R細胞中miR-148a-3p的表達顯著低于A549和H358細胞株, miR-148a-3p可以通過抑制SOS2的表達增加肺癌細胞對放療的敏感性。本研究以肺腺癌組織芯片及肺癌細胞為研究對象,結合miRNA的靶點預測分析肺腺癌細胞中miR-148a-3p對核心1β13-半乳糖基轉移酶1(C1GALT1)的調控作用及其與放療敏感性的關系,現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 肺腺癌組織芯片

肺腺癌組織芯片HLug-Ade180Sur-01和HLugA180Su07購自上海芯超公司, 2張組織芯片中包含來自于76例相同患者的肺腺癌組織。

1.2 細胞培養

293T細胞、肺腺癌A549細胞株由本實驗室保存,置于含10%的胎牛血清的DMEM培養基中,在37 ℃、5%CO2培養箱中培養。

1.3 試劑

3′UTR Luciferase質粒(3′UTR-NC質粒、3′UTR-C1GALT1質粒、3′UTR-MUT質粒和3′UTR-TRAF6質粒)、miRNA質粒(miR-148a-3p過表達質粒或miRNA-NC質粒)、Renilla質粒以及陽性對照miRNA-146b過表達質粒均購自吉凱基因。雙DIG標記LNATMmiRNA-148a-p探針購自Exiqon公司; X-tremeGene HP轉染試劑購自Roche公司; LipofectamineTM3000轉染試劑購自Thermo Fisher Scientific公司; Dual-Luciferase?Reporter Assay System購自promega公司; 免疫組化所用兔抗人C1GALT1一抗購自Atlas Antibodies公司; 蛋白印跡所用兔抗人C1GALT1一抗購自Abcam公司; 兔抗人GAPDH一抗購自Abcam公司; FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司; Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix購自諾唯贊公司; 免疫組化試劑盒購自中杉金橋。

1.4 肺腺癌組織芯片miR-148a-3p的原位雜交(ISH)

HLug-Ade180Sur-01肺腺癌組織芯片進行miR-148a-3p的ISH操作步驟參照DONNEM T等[9]報道的實驗方法進行。具體操作步驟為: 組織芯片70 ℃下拷片30 min, 經過二甲苯脫蠟5 min×3次; 梯度酒精水化(無水乙醇5 min×2次; 96%乙醇5 min; 70%乙醇5 min), 磷酸鹽緩沖液(PBS)處理3 min。用1×蛋白酶K溶液在37 ℃下處理50 min后, PBS洗滌2次。組織芯片在含有miR-148a-3p LNA探針的1×雜交液中進行雜交, 60 ℃、1 h, 檸檬酸緩沖液洗滌(5×檸檬酸緩沖液5 min×1次; 1×檸檬酸緩沖液5 min×2次; 0.2×檸檬酸緩沖液5 min×3次),封閉液室溫封閉15 min, 與anti-DIG-AP抗體(1∶800)室溫孵育60 min, PBST洗滌3 min×3次,在含有NBT/BCIP的堿性磷酸酶底物溶液中30 ℃避光孵育2 h, KTBT緩沖液洗滌5 min×2次后中止反應。自來水洗滌1 min×2次,核固紅染色1 min, 自來水沖洗10 min; 70%乙醇5 min, 96%乙醇5 min, 無水乙醇5 min×2次; 二甲苯5 min×3次后中性樹膠封片,采用玻片掃描影像分析系統掃描高清圖保存。miRNA-148-3p的ISH信號染色強度得分為: 陰性為0分,弱陽性為1分,中度陽性為2分,強陽性為3分。染色細胞的強度為0～1分定義為miR-148a-3p低表達,染色細胞的強度為2～3分定義為miR-148a-3p高表達[10-11]。

1.5 肺腺癌組織芯片C1GALT1免疫組化染色

C1GALT1的免疫組化染色按照試劑盒操作說明進行。具體流程為: 將HLugA180Su07組織芯片70 ℃拷片30 min; 二甲苯脫蠟; 梯度酒精水化; 去離子水3 min×2次; EDTA抗原修復; PBS洗3 min, 使用兔抗人C1GALT1一抗(1∶100)4 ℃過夜, PBS緩沖液沖洗3 min×3次,HRP標記的羊抗兔二抗37 ℃孵育20 min; PBS緩沖液沖洗3 min×3次; 加入新鮮配制的DAB顯色液,室溫孵育5 min; 自來水沖洗; 蘇木素染色液孵育20 s結束后自來水沖洗5 min; 脫水透明; 中性樹膠封片,采用玻片掃描影像分析系統掃描高清圖保存。C1GALT1免疫組化染色評分為: 陰性為0分,弱陽性為1分,中度陽性為2分,強陽性為3分,其中0～2分為C1GALT1低表達, 3分為C1GALT1高表達。

1.6 實時定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)

使用TRIzol試劑提取了肺腺癌細胞總RNA, NanoDrop-1000進行RNA定量后,取500 ng總RNA, 使用ReverAid First Strand cDNA試劑盒進行逆轉錄。采用SYBR qPCR Master Mix檢測miR-148a-3p的表達。內參采用U6, PCR條件為: 95 ℃下30 s, 95 ℃下5 s, 60 ℃下30 s, 循環40次。miR-148a-3p和U6的所用引物由Azenta公司合成,其中miR-148a-3p RT特異引物為5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACAAAG-3′; qPCR引物: miR-148a-3p上游引物為5′-ATGCTCAGTGCACTACAGA A-3′, 下游引物為5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′;U6上游引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′, 下游引物為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。miR-148a-3p的相對表達采用2-△△Ct方法計算。

1.7 細胞克隆形成實驗

A549細胞轉染質粒24 h后,消化計數并稀釋,以每孔2 000個細胞的密度接種到6孔板中。細胞接種24 h后,給予2 Gy X射線照射劑量,繼續培養14 d, 采用PBS清洗后多聚甲醛固定20 min, 結晶紫染色,自然晾干后統計>50 個細胞的克隆數。

1.8 雙熒光素酶報告基因檢測實驗

將對數生長期的293T細胞以每孔1×105個細胞的密度接種在24孔板中培養。將0.1 μg Luciferase質粒(3′UTR-NC質粒、3′UTR-C1GALT1質粒、3′UTR-MUT質粒)、0.4 μg miRNA質粒(miR-148a-3p過表達質粒或miRNA-NC質粒)和0.02 μg Renilla質粒使用X-tremeGene HP轉染試劑進行共轉染。質粒轉染48 h后,使用雙熒光素酶測定法檢測螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶活性。使用miRNA-146b過表達質粒和3′UTR-TRAF6質粒作為陽性對照。

1.9 Western Blot分析

使用RIPA裂解液提取細胞中的總蛋白質并進行蛋白定量。取20 μg的總蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳后,將蛋白轉至PVDF膜, 5%脫脂牛奶封閉液封閉1 h后,加入一抗, 4 ℃過夜孵育。其中,一抗分別為兔抗人GAPDH抗體(1∶10 000), 兔抗人C1GALT1抗體(1∶10 000)。1×TBST溶液室溫洗膜3次,每次10 min, 加入辣根過氧化酶標記的山羊抗兔二抗(1∶20 000), 室溫下孵育1 h, 1×TBST洗膜3次,每次10 min。采用ECL試劑盒進行發光反應并進行圖像采集與分析。

1.10 統計學分析

2 結 果

2.1 肺腺癌組織中miR-148a-3p的表達與患者臨床病理及預后的關系

對76例患者癌組織進行ISH檢測分析,結果顯示,肺腺癌組織中miR-148a-3p的表達與淋巴結轉移顯著相關, miR-148a-3p低表達患者的淋巴結轉移率高于miR-148a-3p高表達的患者,差異有統計學意義(χ2=6.362,P=0.012), 見表1、圖1。miR-148a-3p高表達患者的預后優于miR-148a-3p低表達患者,差異有統計學意義(Log-rank test=8.05,P=0.005), 見圖2。單因素預后分析顯示, miR-148a-3p表達、T分期及淋巴結轉移是肺腺癌患者預后的影響因素; 多因素預后分析顯示, miR-148a-3p表達、T分期及淋巴結轉移是患者預后的獨立影響因素, miR-148a-3p高表達患者死亡風險是miR-148a-3p低表達患者的0.546倍(P=0.039), 見表2。

表1 miR-148a-3p表達與肺腺癌患者臨床特征的關系

A: miR-148a-3p高表達; B: C1GALT1低表達; C: miR-148a-3p中表達; D: C1GALT1中表達; E: miR-148a-3p低表達; F: C1GALT1高表達。圖1 肺腺癌組織中miR-148a-3p及C1GALT1的表達(放大倍數400倍)

圖2 肺腺癌患者不同miR-148a-3p表達水平的生存曲線

表2 預后影響因素的單因素及多因素分析

2.2 miR-148a-3p對肺腺癌A549細胞放療敏感性的影響

肺腺癌A549細胞轉染miR-148a-3p過表達質粒后, qRT-PCR檢測結果顯示,轉染miR-148a-3p過表達質粒后,細胞中miR-148a-3p的表達水平顯著高于轉染對照質粒細胞[對照細胞為(1.094±0.504), 過表達細胞為(123.798±16.765),t=12.67,P=0.000 2]; 2 Gy照射后的對照組細胞和過表達miR-148a-3p組細胞克隆形成實驗結果顯示,過表達miR-148a-3p組細胞的克隆形成數顯著低于對照細胞的克隆形成數[對照組細胞為(288.00±8.89), 過表達細胞組為(212.00±6.00),t=12.28,P=0.000 3]。見圖3。

A: A549細胞過表達miR-48a-3p后,qRT-PCR檢測miR-48a-3p的表達; B: 過表達miR-48a-3p A549細胞接受2 Gy放療后克隆形成能力。圖3 miR-148a-3p對A549細胞放療敏感性的影響

2.3 miR-148a-3p對C1GALT1蛋白的表達調控

應用Targetscan數據庫對miR-148a-3p進行靶基因的預測,結果顯示C1GALT1的3′UTR區域存在miR-148a-3p的結合位點。對76例肺腺癌組織中miR-148a-3p與C1GALT1表達的相關性分析顯示, miR-148a-3p與C1GALT1的表達具有顯著負相關性(r=-0.261,P=0.023), miR-148a-3p低表達組C1GALT1蛋白高表達的患者比率越高, miR-148a-3p表達越高, C1GALT1的表達越低。Western Blot結果顯示, miR-148a-3p過表達細胞中C1GALT1蛋白表達水平顯著低于對照細胞(t=6.263,P=0.003 3)。雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示,陽性對照實驗組共轉染TRAF6-3′UTR和miRNA-146b細胞的熒光素酶報告基因活性較共轉染TRAF6-3′UTR和miRNA-NC細胞的熒光素酶報告基因活性顯著下降(t=31.47,P<0.000 1)。實驗組中共轉染C1GALT1-3′UTR-野生和 miRNA-148-3p細胞的熒光素酶報告基因活性較共轉染NC-3′UTR和miRNA-148-3p細胞熒光素酶報告基因活性顯著下降(t=11.69,P=0.000 3), 共轉染C1GALT1-3′UTR-突變和miRNA-148-3p細胞的熒光素酶報告基因活性較共轉染C1GALT1-3′UTR-野生和miRNA-148-3p組細胞的熒光素酶報告基因活性顯著增加(t=9.97,P=0.000 6), 提示 miR-148a-3p能夠通過結合C1GALT1的3′UTR來抑制C1GALT1蛋白的表達。見圖4。

A: 生物信息學預測C1GALT1 3'-UTR區的結合位點; B: 組織芯片中miR-148a-3p與C1GALT1的表達呈負相關; C: A549細胞中miR-148a-3p能夠抑制C1GALT1蛋白的表達; D: 雙熒光素酶分析miR-148a-3p對C1GALT1表達的調控機制。圖4 miR-148a-3p對C1GALT1表達的調控及機制

2.4 miR-148a-3p靶向抑制C1GALT1的表達促進A549細胞放療增敏

為進一步分析miR-148a-3p在肺腺癌中放療增敏的機制, Western Blot結果顯示,過表達miR-148a-3p后A549細胞的C1GALT1蛋白表達水平顯著低于對照組(t=6.465,P=0.002 9), 共轉染miR-148a-3p和C1GALT1過表達質粒后A549細胞的C1GALT1蛋白表達水平較過表達miR-148a-3p組顯著增高(t=7.622,P=0.001 6)。克隆形成實驗中,共轉染miR-148a-3p過表達質粒A549細胞2 Gy的照射后細胞克隆形成數顯著少于對照組[(121.667±14.571)與(240.667±10.214),t=11.58,P=0.000 3], 共轉染miR-148a-3p和C1GALT1過表達質粒A549細胞的克隆形成數顯著高于過表達miR-148a-3p組[(209.667±6.027)與(121.667±14.571),t=9.666,P=0.000 6], 提示miR-148a-3p能夠增加A549細胞的放療敏感性,而C1GALT1能夠拮抗miR-148a-3p對A549細胞的放療增敏作用,表明miR-148a-3p通過抑制調控C1GALT1的表達提高A549細胞的放療敏感性。見圖5。

A: C1GALT1部分逆轉A549細胞miR-148a-3p的放療增敏作用; B: 過表達C1GALT1能夠逆轉miR-148a-3p對C1GALT1表達的抑制作用。圖5 miR-148a-3p對A549細胞放療敏感性調控的機制

3 討 論

放射療法被廣泛用于肺癌的治療,其通常與手術、化療或免疫療法等其他治療手段聯合使用,以提高治療效果。miRNA在腫瘤的發生和發展中起著關鍵作用, miRNA可以通過調節靶基因的蛋白表達來影響腫瘤細胞對放射治療的敏感性。本研究發現肺腺癌組織中miR-148a-3p低表達與患者淋巴結轉移和不良預后顯著相關,同時miR-148a-3p也顯著增加了A549細胞對放射治療的敏感性, miR-148a-3p通過抑制C1GALT1蛋白的表達來增加肺癌細胞對放射治療的敏感性。

研究[12]顯示,腫瘤中異常改變的miR-148a-3p廣泛參與了多種惡性腫瘤的發生發展和治療抵抗等重要過程。XU C等[13]研究發現miR-148a-3p在膀胱癌組織中低表達, miR-148a-3p能夠靶向抑制ROCK1的表達,抑制膀胱癌細胞的增殖和遷移,促進細胞的凋亡。SONG M等[14]研究發現胃癌miR-148a-3p通過抑制細胞遷移誘導透明質酸酶1(CEMIP)的表達而抑制了胃癌細胞的增殖能力。OUYANG C L等[15]發現miR-148a-3p在結腸癌中表達下調, miR-148a-3p能夠靶向抑制HDAC5的表達,抑制結腸癌細胞的遷移和侵襲。多項研究[7, 8, 16-18]顯示miR-148a-3p在肺癌組織和肺癌細胞中低表達,且miR-148a-3p能夠通過多種作用機制抑制肺癌細胞的多種生物學行為,如增殖、遷移侵襲以及放療敏感性。在前期研究的基礎上,本研究進一步分析HLug-Ade180Sur-01和HLugA180Su07肺腺癌組織芯片中共有的76例腫瘤組織后發現, miR-148a-3p低表達患者的淋巴結轉移率顯著高于miR-148a-3p高表達的患者, miR-148a-3p高表達患者的死亡風險顯著低于miR-148a-3p低表達患者,提示miR-148a-3p與肺腺癌的生物學行為密切相關。

為了研究miR-148a-3p顯著增加A549細胞對放療的敏感性的可能機制,本研究應用Targetscan數據庫對miR-148a-3p進行靶基因的預測,結果顯示C1GALT1的3′UTR區域存在miR-148a-3p的結合位點,提示miR-148a-3p可能調控C1GALT1的表達。C1GALT1又稱為T-合酶(T-synthase), 參與核心1型O聚糖為基礎的O-糖基化修飾,其在血管生成、血小板生成、卵泡基底層結構維持和腎臟發育等多種生物學過程中發揮重要的作用[19]。研究[20]顯示, C1GALT1與惡性腫瘤的發生發展密切相關。C1GALT1在肝細胞癌、胃癌、肺癌、頭頸部癌、胰腺癌、乳腺癌、膀胱癌及食管癌中高表達并抑制細胞的增殖、遷移、侵襲以及對放療的敏感性[21]。TAN Z Q等[22]研究發現膀胱癌組織中C1GALT1高表達與不良預后密切相關,抑制膀胱癌YTS-1細胞C1GALT1的表達后,細胞增殖與侵襲轉移能力受到明顯抑制。DONG X X等[23]研究發現, C1GALT1的表達與肺癌患者的預后顯著相關,且C1GALT1能夠促進肺癌A549和H1299細胞的增殖。

本研究對組織芯片進行ISH和免疫組化染色結果分析顯示, miR-148a-3p在肺腺癌組織中的表達與C1GALT1蛋白的表達呈負相關, miR-148a-3p通過結合到C1GALT1 mRNA的3′UTR抑制C1GALT1蛋白的表達,提示miR-148a-3p在肺癌中的放療增敏作用可能是通過抑制C1GALT1的表達而發揮的。研究[24-25]顯示C1GALT1能夠通過促進整合蛋白的O-糖基化修飾來降低食管癌細胞(ECa109)和喉癌細胞株(Hep-2min)放療敏感性,促進細胞的放療抵抗。本研究在過表達miR-148a-3p的A549細胞中過表達C1GALT后,細胞克隆形成實驗結果顯示C1GALT1可以部分逆轉miR-148a-3p介導的放療增敏效應,提示miR-148a-3p可通過調控C1GALT1的表達提高肺腺癌細胞的放療敏感性。

綜上所述,肺腺癌組織中miR-148a-3p低表達與患者淋巴結轉移及不良預后顯著相關, miR-148a-3p過表達可提高肺腺癌A549細胞對放療的敏感性,其作用機制可能與抑制C1GALT1蛋白的表達有關。miR-148a-3p的高表達是改善肺腺癌預后和放療增敏的重要因素,并且可能成為調控腫瘤細胞放療敏感性的潛在靶點。