Hsa_circ_MIB1 在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達及臨床意義

羅伶俐,陳思敏

(1.湖南省兒童醫(yī)院 檢驗中心,湖南 長沙410007;2.湖南省益陽市中心醫(yī)院 檢驗科,湖南 益陽413099)

腦膠質(zhì)瘤(Glioma)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性腫瘤,具有高度侵襲性和較高的死亡率,容易復(fù)發(fā)且治療難度高[1-2]。環(huán)狀RNA(circRNA)是一種具有共價閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的新型非編碼RNA,circRNA與腫瘤、動脈粥樣硬化、糖尿病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等多種疾病相關(guān)[3-4]。CircRNAs也在神經(jīng)系統(tǒng)疾病(如膠質(zhì)瘤)中發(fā)揮重要作用,如circ_0079593可通過海綿吸附miR-324-5p而促進神經(jīng)膠質(zhì)瘤的進展[5-6]。本研究采用circRNA高通量測序技術(shù),篩選出膠質(zhì)瘤組織與正常腦組織中的差異表達circRNAs,并擬對在膠質(zhì)瘤中顯著低表達的circMIB1進行研究,揭示其與膠質(zhì)瘤患者臨床病理特征的相關(guān)性,報道如下。

1 資料與方法

1.1 組織樣本與細胞收集

在中南大學(xué)湘雅醫(yī)院神經(jīng)外科接受手術(shù)的患者標(biāo)本共93 例,其中包括76例神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的腦組織和正常腦組織17例。癌癥組所有患者均確診為神經(jīng)膠質(zhì)瘤,排除合并其他惡性腫瘤患者,男38例,女38例,年齡1～71歲。正常腦組織取自癲癇和海綿狀血管瘤患者,男12例,女5例,年齡6～73歲。所有組織標(biāo)本均由2名病理科醫(yī)生確認(rèn)。收集的組織標(biāo)本置-80℃凍存。所有患者在手術(shù)前均未接受任何抗腫瘤治療且簽署了知情同意書,此研究獲得了本院倫理委員會的認(rèn)可。神經(jīng)膠質(zhì)細胞系HEB和神經(jīng)膠質(zhì)母細胞瘤細胞系U87購于上海中國科學(xué)院,神經(jīng)膠質(zhì)母細胞瘤細胞系U251購于美國ATCC,神經(jīng)膠質(zhì)母細胞瘤細胞系SF126購于北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院細胞研究所。

1.2 總RNA的提取

參照Trizol試劑盒說明(Invitrogen,美國)提取樣本組織和細胞總RNA,采用紫外分光光度計測定樣本RNA在波長260 nm和280 nm的光密度值D260、D280,當(dāng) D260 /D280 比值在1.8 ～2.0之間時認(rèn)為樣本 RNA 純度合格。

1.3 circRNA高通量測序篩選差異表達基因

委托杭州聯(lián)川生物公司對4例正常腦組織和5例腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者組織進行高通量測序。測序完成后,通過Tophat 2進行序列比對,然后用 cufflinks 對所有基因進行定量;再使用EdgeR包進行差異分析,滿足Log2差異倍數(shù)絕對值≥1且P<0.05的基因被認(rèn)為是差異基因。

1.4 RT-qPCR檢測

hsa_circ_MIB1的表達采用瑞士羅氏公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒對總RNA進行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。采用日本TOYOBO公司的SYBR qPCR Mix Kit進行hsa_circ_MIB1的RT-qPCR檢測,以GAPDH作為內(nèi)參基因,以2-ΔΔCt作為hsa_circ_MIB1的相對表達水平。circRNA引物設(shè)計由生工生物工程(上海)股份有限公司完成,其中hsa_circ_MIB1上游引物序列為 5’-ACTGGCAGTGGGAAGATCAA-3’,下游引物序列為 3’-AGAAAGAACCTCCCTTGGCA-5’;GAPDH上游引物序列為 5’-ATGATCTTGAGGCTGTTGTCATA-3’,下游引物序列為 3’-ATGATCTTGAGGCTGTTGTCATA-5’。

1.5 circRNA穩(wěn)定性檢測

首先提取細胞RNA,將RNA分為RNase 消化組和非消化組,RNase消化組按1 μg RNA用1U的RNase的比例加樣,在37℃振蕩混勻15 min,然后用苯氯仿沉淀法提取消化產(chǎn)物,并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,通過qRT -PCR 檢測目標(biāo)circRNA及對應(yīng)線性 mRNA 的表達水平,以非消化組為對照。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 膠質(zhì)瘤組織及正常腦組織中circRNA差異表達分析

對4例正常腦組織、5例腦膠質(zhì)瘤組織進行circRNA高通量測序,結(jié)果發(fā)現(xiàn)有1248個差異表達的circRNA分子,其中在膠質(zhì)瘤中表達上調(diào)的circRNA分子有158個,表達下調(diào)的circRNA有1090個。聚類分析(圖1)結(jié)果顯示差異表達的circRNA能正確區(qū)分癌組織與正常腦組織。在測序結(jié)果中差異表達的circRNA中,隨機選擇7個表達上調(diào)的circRNA和5個表達下調(diào)的circRNA,在4例正常腦組織和5例腦膠質(zhì)瘤組織中進行實時熒光定量PCR來驗證分子測序的結(jié)果。結(jié)果如圖2所示,7個circRNA明顯表達上調(diào)(P<0.05)、5個circRNA明顯表達下調(diào)(P<0.001),驗證結(jié)果與測序結(jié)果基本一致,說明測序結(jié)果可靠。

圖1 膠質(zhì)瘤組織和正常腦組織中差異表達circRNAs的聚類熱圖

圖2 膠質(zhì)瘤組織中測序表達上調(diào)和下調(diào)的circRNA驗證

2.2 hsa_circ_MIB1結(jié)構(gòu)的鑒定

結(jié)果顯示hsa_circ_0000835(hsa_circ_MIB1)在觀察組中差異表達明顯下調(diào),且其在膠質(zhì)瘤中尚無相關(guān)研究,因此選為最終目標(biāo)circRNA進行進一步驗證。hsa_circ_MIB1由其親本蛋白MIB 1(E3泛素蛋白連接酶)第2、3、4、5、6號外顯子環(huán)化而成,長度為679 bp,定位在18號染色體的19345732-19359646位置(圖3A)。根據(jù)hsa_circ_MIB1特征設(shè)計了兩組引物,一組發(fā)散引物(divergent primers)用于擴增環(huán)狀轉(zhuǎn)錄物,而另一組收斂引物(convergent primers)用于檢測線性轉(zhuǎn)錄物。用PCR分析,發(fā)現(xiàn)發(fā)散引物能成功地從U251細胞的cDNA中成功擴增出hsa_circ_MIB1,而基因組DNA(gDNA)則不能。相反,用收斂引物只能從cDNA和gDNA中擴增出線性轉(zhuǎn)錄物MIB1(圖3B)。在兩種神經(jīng)膠質(zhì)母細胞瘤細胞系 U87和U251中,使用RNase R(核糖核酸外切酶)分別處理circRNA和其線性mRNA后,結(jié)果如圖3C所示,hsa_circ_MIB1在U87和U251細胞中的表達水平無顯著差異,但其線性親本基因線性 mRNA(MIB1)被RNase R破壞后表達顯著降低(P<0.0001),說明hsa_circ_MIB1不受外切酶影響,具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)。

圖3 hsa_circ_MIB1的鑒定

2.3 hsa_circ_MIB1在膠質(zhì)瘤組織和細胞中的表達情況

采用RT-qPCR法檢測了76 例神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的腦組織和17 例正常腦組織中的hsa_circ_MIB1水平。結(jié)果顯示:膠質(zhì)瘤組織中hsa_circ_MIB1的表達量(0.28±0.63)明顯低于正常腦組織(1.60±1.56),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.0001),見圖4A。檢測hsa_circ_MIB1在正常腦星形膠質(zhì)細胞系 HEB 及惡性腦膠質(zhì)瘤細胞系 U251、U87 及 SF126 中的表達,發(fā)現(xiàn)惡性膠質(zhì)瘤細胞系中的hsa_circ_MIB1表達水平均明顯低于正常腦星形膠質(zhì)細胞系中的表達水平(P<0.05),與測序結(jié)果一致(圖4B)。

圖4 膠質(zhì)瘤組織和細胞中hsa_circ_MIB1的表達情況

2.4 hsa_circ_MIB1的表達水平與臨床病理特征的相關(guān)性

選擇膠質(zhì)瘤組織中位表達水平作為分離閾值,將患者分為hsa_circ_MIB1低表達組(n=38)和hsa_circ_MIB1高表達組(n=38)。通過分析76例膠質(zhì)瘤患者hsa_circ_MIB1表達與年齡、性別和臨床分期的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)hsa_circ_MIB1的表達與膠質(zhì)瘤病人的年齡和性別差異無統(tǒng)計學(xué)意義,與臨床分期關(guān)系密切(χ2=7.930,P<0.005)。臨床分期越高,hsa_circ_MIB1的表達水平越低(表1)。Kaplan-Meier 生存質(zhì)量分析顯示hsa_circ_MIB1表達水平越低,膠質(zhì)瘤患者生存期越短,說明hsa_circ_MIB1水平與膠質(zhì)瘤患者的總生存時間之間存在正相關(guān)關(guān)系(P<0.0001),見圖5A。受試者工作特征曲線(ROC曲線)分析結(jié)果顯示,hsa_circ_MIB1診斷的臨界值為0.8289,其對應(yīng)的靈敏度和特異度分別為100.0%和82.89%,ROC曲線下面積為0.928,95%置信區(qū)間為0.855～0.9871,見圖5B。

表1 膠質(zhì)瘤患者hsa_circ_MIB1的表達與臨床病理特征的關(guān)系

圖5 hsa_circ_MIB1的表達水平與其臨床病理特征的相關(guān)性分析

3 討論

腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一,其惡性度高、難以完全切除。即使進行手術(shù)、放化療等綜合治療,仍有較高的復(fù)發(fā)率,導(dǎo)致腦膠質(zhì)瘤患者的五年生存率低,預(yù)后差[7]。目前膠質(zhì)瘤的發(fā)病機制尚不明確,尋找膠質(zhì)瘤的病因,可以早期明確診斷、控制疾病進展,并提高膠質(zhì)瘤患者的治療效果。因此,深入研究膠質(zhì)瘤發(fā)病的原因,篩選與神經(jīng)膠質(zhì)瘤相關(guān)的生物標(biāo)志物和治療新靶點尤為必要。在過去的二十年中,腫瘤發(fā)生和腫瘤發(fā)育中非編碼 RNA 的異常表達和(或)功能已成為最重要的科學(xué)發(fā)現(xiàn)之一,如miRNA,lncRNA和circRNA[8]。circRNA是一種具有閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的新型非編碼 RNA,是由mRNA 前體特殊剪接、外顯子序列首尾連接構(gòu)成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。與線性 RNA 相比,circRNA具有不易被降解的穩(wěn)定性與時空特異性,更有潛力成為診斷癌癥的理想生物標(biāo)志物[9]。circRNA可以作為miRNA的內(nèi)源性競爭RNA來影響轉(zhuǎn)錄后調(diào)控,能與相關(guān)的miRNA、mRNA 相互作用來調(diào)控疾病的進展來發(fā)揮其生物學(xué)功能[10]。近年來,大量研究證實,circRNA在乳腺癌、胃癌、宮頸癌等多種惡性腫瘤中存在異常表達,通過上調(diào)原癌基因或抑癌基因進而發(fā)揮抑癌或促癌基因的作用[11-12]。新的證據(jù)表明,circRNAs在神經(jīng)元組織中普遍存在[13]。然而到目前為止,膠質(zhì)瘤中的大多數(shù)circRNA的確切功能仍不清楚。因此,關(guān)注circRNA在膠質(zhì)瘤發(fā)病過程中的表達及作用機制,從而為膠質(zhì)瘤的臨床干預(yù)及治療提供新的思路。

本研究采用了高通量測序?qū)? 例正常腦組織和5 例腦膠質(zhì)瘤組織進行了差異表達環(huán)狀RNA 的檢測,發(fā)現(xiàn)了1248 個差異表達的circRNA分子,其中表達上調(diào)的circRNA分子有158 個,表達下調(diào)的circRNA有1090 個。依據(jù)篩選標(biāo)準(zhǔn)找到了明顯差異表達的hsa_circ_0000835(hsa_circ_MIB1)。hsa_circ_MIB1是一種外顯子環(huán)化circRNA,由其親本蛋白MIB1(E3泛素蛋白連接酶)的第2、3、4、5、6號外顯子環(huán)化而成,長度為679bp,定位在18號染色體的19345732～19359646位置。MIB1是Notch通路激活所需的E3泛素連接酶,而Notch信號的失調(diào)與各種癌癥的細胞轉(zhuǎn)化和腫瘤發(fā)生有關(guān)。MIB1已被證實在多種疾病的發(fā)生發(fā)展中能夠扮演重要的角色,例如肺癌[14]、胰腺癌[15]和先天性心臟病[16]等,但在膠質(zhì)瘤中鮮有研究。因此預(yù)測hsa_circ_MIB1可能與腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。隨后通過RT-qPCR擴大樣本量進行驗證,發(fā)現(xiàn)腦膠質(zhì)瘤組織中的 hsa_circ_MIB1表達水平比正常腦組織明顯下調(diào),且具有較強的診斷效能(ROC 曲線AUC =0.928),靈敏度和特異度分別為100.0%和82.89%,具有作為膠質(zhì)瘤生物診斷標(biāo)志物的潛力。同樣的,腦膠質(zhì)瘤細胞系中的hsa_circ_MIB1表達水平也比正常腦膠質(zhì)細胞明顯下調(diào)。結(jié)合臨床病理結(jié)果進行分析,發(fā)現(xiàn)其低表達與膠質(zhì)瘤患者的臨床分期顯著相關(guān),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.0001),與年齡、性別相關(guān)性差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),說明hsa_circ_MIB1表達水平能夠反映腫瘤的惡性程度。Kaplan-Meier生存質(zhì)量分析顯示hsa_circ_MIB1 表達水平越低,膠質(zhì)瘤患者生存期越短,提示hsa_circ_MIB1 可能具有抑制膠質(zhì)瘤進程的作用,但有待進一步的探索。同時還對hsa_circ_MIB1進行了穩(wěn)定性驗證,證實了hsa_circ_MIB1具備circRNA不易降解的特性,且成環(huán)性、穩(wěn)定性優(yōu)于鏈狀 RNA,從生物學(xué)角度分析更適合作為診斷膠質(zhì)瘤的生物標(biāo)志物。

綜上,本研究報道了hsa_circ_0000835(hsa_circ_MIB1)在膠質(zhì)瘤中的生物活性,hsa_circ_MIB1在膠質(zhì)瘤組織和細胞中均明顯表達下調(diào),且與臨床分期和總生存時間有關(guān)。hsa_circ_MIB1可能作為診斷膠質(zhì)瘤的分子標(biāo)志物,尤其是協(xié)助診斷膠質(zhì)瘤的臨床分期情況,并有很高的潛力成為治療膠質(zhì)瘤的潛在靶點。