骨髓染色體聯(lián)合FISH技術(shù)在惡性血液病診斷中的應(yīng)用價值

李付廣,張曉靜,謝小雷,湯素環(huán),唐 江,吳愛娟,尹衛(wèi)國

(1.清遠市人民醫(yī)院 分子診斷中心·廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第六醫(yī)院,廣東 清遠511518;2.清遠市人民醫(yī)院 藥學(xué)部·廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第六醫(yī)院,廣東 清遠511518)

細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)在惡性血液病的發(fā)生、發(fā)展、診斷以及分型治療中發(fā)揮著重要作用,是對傳統(tǒng)的血液學(xué)檢查和骨髓涂片形態(tài)學(xué)檢查的重要補充[1]。隨著世衛(wèi)組織(WHO)對造血及淋巴組織腫瘤診斷分型標(biāo)準(zhǔn)的不斷修訂完善,染色體核型在惡性血液病診斷分型中的作用日益突出,已成為細(xì)胞形態(tài)學(xué)(Morphology,M)、免疫學(xué)(Immunology,I)、細(xì)胞遺傳學(xué)(Cytogenetics,C)和分子生物學(xué)(Molecular biology,M)分型(簡稱MICM分型)重要的組成部分[2]。然而,由于骨髓染色體標(biāo)本制備復(fù)雜,易受多種因素的影響,如何穩(wěn)定獲得形態(tài)良好、長度適宜、分散較好以及數(shù)目較多的中期骨髓染色體分裂相仍是細(xì)胞遺傳學(xué)研究中的一個難題[3]。各實驗室應(yīng)根據(jù)自身實驗條件對影響骨髓染色體制備的影響因素進行優(yōu)化,以達到最佳制備效果。本研究通過對骨髓細(xì)胞接種培養(yǎng)、收獲、顯帶方法等可能影響骨髓染色體制備的每一個環(huán)節(jié)進行了合理改良和優(yōu)化,進一步提高了骨髓染色體的制備成功率,改良方法在惡性血液病診斷中尤其在慢性粒細(xì)胞白血病(CML)的臨床應(yīng)用中具有重要價值,現(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

收集2019年1月至2022年6月來清遠市人民醫(yī)院就診的355例惡性血液病患者骨髓標(biāo)本(男性182例,女性173例),平均年齡58.8±14.5歲,中位年齡為60歲。結(jié)合臨床、MICM分型及張之南等[4]主編的《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》對患者進行診斷分型,包括99例急性髓系白血病(AML)患者,16例急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)患者,33例CML患者,13例慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)患者,82例多發(fā)骨髓瘤(MM)患者,53例骨髓增生異常綜合征(MDS)患者,27例非霍奇金淋巴瘤(NHL)患者,25例慢性骨髓增殖性疾病(CMPD)患者,7例慢性粒單細(xì)胞白血病(CMML)患者。本研究經(jīng)清遠市人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn),患者均已簽署知情同意書。抽取患者2～5 mL骨髓標(biāo)本注射到專用肝素鈉抗凝管,2 h內(nèi)送檢,無溶血、無凝血、未經(jīng)過高溫和冷凍且無污染樣本為合格標(biāo)本。

1.2 實驗方法

1.2.1改良骨髓染色體G顯帶 本研究首先抽取16例惡性血液病患者骨髓,根據(jù)文獻報道[3,5-7]和臨床實踐經(jīng)驗,在短期培養(yǎng)法的基礎(chǔ)上進行改良,分別對接種濃度、秋水仙堿濃度和作用時間、低滲、培養(yǎng)時間等因素進行優(yōu)化改良。接種濃度方面,將每例患者的骨髓標(biāo)本先經(jīng)有核細(xì)胞計數(shù),然后按照2.0×106/mL細(xì)胞密度接種;秋水仙堿方面,鑒于骨髓染色體對秋水仙堿較為敏感,將秋水仙堿使用液的濃度由10 μg/mL降為5 μg/mL,在終濃度為0.1 μg/mL條件下作用1 h;低滲液方面,將0.075 M KCl的低滲液改為0.075 M KCl與0.1%檸檬酸鈉溶液按3∶1新鮮混合的低滲液,作用30 min,進而增加染色體分散度;保持上述條件不變的情況下,對骨髓細(xì)胞的培養(yǎng)時間進行單因素分析,將每份標(biāo)本接種4瓶,根據(jù)培養(yǎng)時間不同分成A、B、C、D四組,培養(yǎng)時間依次為16 、20 、24和28 h,其余步驟同常規(guī)染色體方法。條件優(yōu)化后,所有標(biāo)本均按改良后的骨髓染色體G顯帶制備方法進行。

1.2.2鏡檢與核型分析 采用德國蔡司全自動染色體掃描分析儀對骨髓染色體進行鏡檢分析,每例標(biāo)本顯帶后計數(shù)20個核型分裂相,分析5個染色體核型,根據(jù)《人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名體制(ISCN)2016》描述染色體核型,如果可分析染色體分裂相數(shù)目不足時,則分析全部染色體分裂相,出現(xiàn)2個以上相同染色體結(jié)構(gòu)異?；驍?shù)目增加異常,或是3個染色體減少異常,則判為染色體異常,每例標(biāo)本有5個及以上可供分析的染色體分裂相即視為成功[5]。

1.2.3熒光原位雜交(FISH)檢測 為進一步提高CML患者診斷率,對初步診斷為CML的患者同時使用FISH檢測試劑盒進行融合基因BCR-ABL檢測,實驗方法均嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作進行,綠色熒光標(biāo)記為BCR(22q11.2)探針,紅色熒光標(biāo)記為ABL(9q34)探針,BCR/ABL1融合基因顯示黃色或紅綠疊加信號(F),正常信號模式為2G2R(G為綠色信號,R為紅色信號),熒光顯微鏡下觀察200個間期細(xì)胞熒光雜交信號,根據(jù)《人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名體制(ISCN)2016》對結(jié)果進行描述。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

使用IBM SPSS Statistics 25統(tǒng)計學(xué)軟件處理實驗數(shù)據(jù),多組實驗結(jié)果染色體分裂相均值分析采用單因素ANOVA檢驗,染色體分裂相組間兩兩比較采用t檢驗,骨髓細(xì)胞培養(yǎng)成功率多組比較采用卡方檢驗,Fisher確切概率法分析,P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 單因素實驗結(jié)果

改良前染色體形態(tài)欠佳、分辨率低、分散性差;改良后染色體形態(tài)、分辨率、分散性均明顯改善,可分析染色體分裂相增多(見圖1和圖2);單因素分析發(fā)現(xiàn)染色體分裂相均值差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),進一步兩兩對比發(fā)現(xiàn),染色體分裂相值B組高于D組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),其他組間染色體分裂相值兩兩比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);培養(yǎng)成功率方面四組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),進一步兩兩對比分析,B組的培養(yǎng)成功率顯著高于D組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),其他組間培養(yǎng)成功率兩兩比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1和表2。

表1 染色體分裂相數(shù)分析實驗結(jié)果

表2 染色體培養(yǎng)成功率分析實驗結(jié)果

圖1 改良前染色體核型圖

2.2 骨髓異常染色體檢出結(jié)果

采用改良后骨髓染色體制備方法的355例惡性血液病患者中,除12例患者不足5個染色體分裂相外,其余均一性培養(yǎng)成功,成功率為96.6%(343/355),異常染色體檢出率為40.3%(143/355),其中CML異常核型檢出率最高為93.9%(31/33),AML為41.4%(41/99),ALL為50%(8/16),CLL為15.4%(2/13),MM為19.5%(16/82)、MDS為64.2%(34/53),NHL為14.8%(4/27),CMPD為16.0%(4/25),CMML為42.9%(3/7)。染色體數(shù)目以+8、超二倍體(>48條)、亞二倍體(<44條)以及染色體多發(fā)異常為主,結(jié)構(gòu)異常以t(9;22)、t(15;17)、t(8;21)為主,t(15;16)、t(7;18)、t(11;22)、I(17)(q10)等比較少見。不同疾病類型異常染色體分布不同,AML以t(15;17)和t(8;21)等特征性結(jié)構(gòu)異常為主;CML以t(9;22)為主,ALL有3例t(9;22),2例+8異常,其余為多發(fā)異常;MM和MDS均以染色體多發(fā)異常為主,不同類型血液病異常染色體檢出率見表3。

表3 異常染色體檢出統(tǒng)計

2.3 CML檢出結(jié)果

33例CML患者經(jīng)FISH分析,檢出BCR-ABL融合基因陽性31例,染色體核型分析檢出Ph染色體t(9;22)陽性31例,兩者檢出率一致,檢出率均為94.3%。從CML病程上來看,25例慢性期患者中Ph染色體陽性23例,加速期和急變期Ph染色體陽性檢出率均為100%,出現(xiàn)額外染色體3例,分別為+8、+11、+mar。另有1例隱匿型易位t(5;22)(q35;q11.2),1例復(fù)雜隱匿型易位51,XXYY,t(1;9;22)(q25;q34;q11.2),+der(9)t(1;9;22),+11,+der(22) t(1;9;22),見表4。

表4 不同病程CML異常核型檢出結(jié)果

其中1例患者診斷為CML 5年,雙下肢疼痛、乏力3個月,雙腎囊腫、脾大,外周血白細(xì)胞升高(44.5×109/L),輕度貧血(HGB 96 g/L),骨髓涂片和流式細(xì)胞學(xué)均提示CML急髓變,其中骨髓涂片原始細(xì)胞占45%,骨髓活檢提示CML急髓變(MF-3級),FISH檢測BCR-ABL融合基因陽性nuc ish(ABL1×5,BCR×4)(ABL1 con BCR×2)[92/200],骨髓染色體核型結(jié)果為51,XXYY,t(1;9;22)(q25;q34;q11.2),+der(9)t(1;9;22),+11,+der(22) t(1;9;22),為復(fù)雜隱匿型易位合并額外染色體異常(圖3:BCR-ABL融合基因檢測結(jié)果;圖4:染色體核型分析圖)。

圖3 FISH檢測結(jié)果[nuc ish(ABL1×5,BCR×4)(ABL1 con BCR×2)[92/200],注.綠色(G)為BCR(22q11.2)探針,紅色(R)為ABL(9q34)探針,黃色或紅綠疊加(F)為BCR/ABL1融合基因]

3 討論

骨髓染色體核型分析對惡性血液系統(tǒng)疾病的診斷分型、治療、預(yù)后判斷及發(fā)病機制的探討具有重要意義,目前骨髓染色體的制備方法主要有直接法、即刻低滲法、短期培養(yǎng)法和同步化法,每一方法各有優(yōu)缺點,實踐表明短期培養(yǎng)法相對穩(wěn)定、染色體分裂相多,比較適合在臨床中推廣應(yīng)用[6]。然而骨髓染色體制備影響因素眾多,不可避免因細(xì)胞培養(yǎng)和染色體制備出現(xiàn)失敗。但不同實驗室在染色體制備時較難保持完全一致,且不同細(xì)胞類型疾病對制備條件也存在差異,因此在制備過程中各實驗室應(yīng)根據(jù)自身實驗條件進行優(yōu)化,以達到最佳制備效果,從而提高惡性血液病異常染色體核型的檢出率。

3.1 改良骨髓染色體制備方法分析

短期培養(yǎng)影響因素較多,本研究從接種濃度、秋水仙堿濃度和作用時間、低滲液和低滲時間等方面進行優(yōu)化改良,發(fā)現(xiàn)接種濃度在2.0×106/mL,秋水仙堿濃度為0.1 μg/mL作用1 h,0.075 M的KCl與0.1%的檸檬酸鈉3∶1新鮮配制的低滲液在37 ℃條件下作用30 min,此時制備的骨髓染色體效果較為理想。研究表明,骨髓染色體制備與培養(yǎng)時間具有相關(guān)性,短期培養(yǎng)法時間為24～48 h,因此本研究對培養(yǎng)時間進行了單因素分析。按培養(yǎng)時間分為四組,依次為16、20、24和28 h。發(fā)現(xiàn)染色體培養(yǎng)成功率和染色體分裂相數(shù)隨著培養(yǎng)時間延長呈先升后降趨勢,其中B組在染色體分裂相均值、成功率方面最優(yōu),與D組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.041,P=0.037),與A組或C組相比存在差異,但差異性不顯著,說明骨髓染色體培養(yǎng)在16～24 h之間為宜,20 h最為理想,不宜超過28 h,本實驗結(jié)果與文獻報道相一致[6-7]。本研究中采用改良后的骨髓染色體制備方法的355例惡性血液病患者,除12例不足5個染色體分裂相外,其余均一性培養(yǎng)成功,成功率高達96.6%(343/355),異常染色體核檢出率40.3%(143/355),很好的滿足了臨床對惡性血液病診斷分型的需求。

3.2 骨髓異常染色體檢出結(jié)果分析

惡性血液病是發(fā)生在骨髓中以造血干細(xì)胞異常為主的克隆性惡性疾病,其中大多數(shù)惡性血液病患者還伴隨著染色體的改變,染色體改變是影響白血病預(yù)后的獨立因素,染色體異常的類型直接關(guān)系著白血病患者的預(yù)后情況[8]。本研究發(fā)現(xiàn),355例惡性血液病患者異常染色體檢出率為40.3%,與馬娟等[9]報道惡性血液病異常染色體檢出率42.5%基本一致,其中CML、MDS、ALL、CMML和AML檢出率較高,分別為93.9%、64.2%、50%、42.9%和41.4%,而MM、CMPD、CLL和NHL檢出率較低,分別為19.5%、16.0%、15.4%和14.8%,異常染色體跟不同類型血液病明顯相關(guān),且具有一定的特異性。

研究表明,ALL出現(xiàn)t(9;22)比例高達20%～30%,常預(yù)后不良[10],本研究中的16例ALL患者中有7例出現(xiàn)異常染色體,其中t(9;22)檢出率為18.8%,與文獻報道的成人ALL出現(xiàn)t(9;22)約20%～30%接近[11]。AML異質(zhì)性較高,伴重現(xiàn)性細(xì)胞遺傳學(xué)異常約30%～40%,且為多發(fā)異常[12],本實驗AML異常染色體檢出率為41.4%(41/99),其中t(15;17)檢出率最高占AML的8.1%(8/99),為AML-M3診斷分型的遺傳標(biāo)志,而t(8;21)出現(xiàn)在AML-M2a中占4%(4/99),M2a患者伴t(8;21)對化療治療的敏感性及緩解率均較高,預(yù)后良好[13]。MDS與細(xì)胞遺傳、分子遺傳、免疫機制及骨髓微環(huán)境異常等相關(guān),極易向AML轉(zhuǎn)化[14-15],本研究MDS異常染色體核型檢出率為64.2%,染色體以多發(fā)異常以及不平衡異常為主[15-16]。MM染色體異常多為復(fù)雜異常,常提示預(yù)后不良,本研究中MM異常染色體核檢出率為19.5%(16/82),符合文獻報道 MM 初診時染色體異?？寺〉臋z出率18%～35%[17],16例異常染色體中以涉及多條染色體的結(jié)構(gòu)異常數(shù)目異常的復(fù)雜和高度復(fù)雜畸變?yōu)橹?其中3例為-13伴有其他染色體多發(fā)異常,預(yù)后不良。CMPD、NHL和CMML異常染色體檢出率分別為16.0%(4/25)、14.8%(4/27)和42.9%(3/7),NHL表現(xiàn)為多發(fā)異常,其中3例出現(xiàn)多個標(biāo)記染色體(mar),CMPD和CMML出現(xiàn)染色體異常以結(jié)構(gòu)異常為主,少見數(shù)目異常,缺少標(biāo)記性染色體異常,可能跟病例數(shù)較少有關(guān)。

3.3 CML分子遺傳和細(xì)胞學(xué)結(jié)果分析

CML是一種起源于造血干細(xì)胞的多系骨髓增生性腫瘤,其細(xì)胞遺傳學(xué)特征是t(9;22)形成一個縮短的22號染色體(Ph染色體),Ph染色體形成同時產(chǎn)生BCR-ABL融合基因,BCR-ABL是CML的重要診斷依據(jù)[18],Ph染色體不僅能夠?qū)τ糜趨^(qū)分MDS、CML和類白血病,CML根據(jù)有無Ph染色體又分為Ph+型和Ph-型,Ph-型為異質(zhì)性疾病,其中約50%出現(xiàn)BCR-ABL陽性,也屬于Ph+型CML,治療效果和預(yù)后均較差[19]。本研究33例CML患者通過兩種技術(shù)分別檢出Ph染色體和BCR-ABL融合基因31例,均為Ph+型和BCR-ABL陽性,CML中Ph染色體陽性率93.9%,與文獻報道的CML患者中Ph染色體檢出率的90%～95%一致[20],其中染色體核型分析發(fā)現(xiàn)3例額外異常染色體,FISH和染色體核型分析技術(shù)分別從分子遺傳和細(xì)胞遺傳學(xué)方面提供了不同的遺傳學(xué)信息,豐富了CML患者遺傳學(xué)改變的信息。

研究表明,CML患者Ph+伴額外染色體常預(yù)示著疾病向加速及急變期發(fā)展,預(yù)后較差[21]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)CML患者Ph+伴額外染色體其細(xì)胞生成和分子應(yīng)答率明顯降低,患者應(yīng)答時間延長,是伊馬替尼治療CML患者的不良預(yù)后因素之一[22]。本研究中慢性期患者無額外異常染色體,在加速期和急變期患者中,出現(xiàn)額外異常染色體3例,其中1例患者為CML急變期,FISH檢測BCR-ABL陽性,染色體核結(jié)果為復(fù)雜隱匿性Ph染色體合并額外染色體異常,該患者白細(xì)胞升高、輕度貧血、脾大,骨髓涂片、流式細(xì)胞學(xué)和骨髓活檢提示CML急髓變,臨床診斷為慢性粒細(xì)胞白血病急髓變,存在病情急劇進展可能,預(yù)后較差,需進一步聯(lián)合化療和骨髓移植治療,額外染色體的出現(xiàn)對病例惡化具有重要的預(yù)測價值,兩者聯(lián)合應(yīng)用可為臨床CML診斷分型提供了更加全面的參考依據(jù)[23]。

綜上所述,本研究通過優(yōu)化改良短期骨髓染色體培養(yǎng)方法,提高了骨髓染色體培養(yǎng)成功率及異常染色體檢出率,建立了適合推廣使用的骨髓染色體G顯帶制備方法;發(fā)現(xiàn)不同血液病染色體異常檢出率和類型也不相同,部分具有一定的特異性,骨髓染色體和FISH技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用為臨床對白血病診斷分型、治療及預(yù)后判斷提供了重要參考依據(jù)。

作者貢獻

李付廣,張曉靜等進行文章構(gòu)思、設(shè)計、實施、收集并整理數(shù)據(jù)、撰寫論文;湯素環(huán),唐江進行數(shù)據(jù)收集,統(tǒng)計學(xué)處理;吳愛娟進行數(shù)據(jù)質(zhì)量控制;謝小雷,尹衛(wèi)國進行論文的修訂、監(jiān)督管理。

本文不存在任何利益沖突。