黃芪多糖調節HMGB1-RAGE信號通路對自身免疫性心肌炎大鼠心肌損傷的影響*

鄭 俏，狄 巖，岳思恩，張雯雯

（北京中醫藥大學東直門醫院，北京 100700）

心肌炎是一種心肌炎癥，可由自身免疫性疾病、感染和心臟毒性藥物誘發，往往伴隨著快速進行性心律失常、心力衰竭及心臟性猝死，是年輕患者因心肌病導致死亡的主要原因[1]。據統計約1/3的自身免疫性心肌炎（experimental autoimmune myocarditis，EAM）病例最終可導致心力衰竭，但目前尚未研究出有效的治療方法，因此尋找新的有效治療藥物勢在必行[2]。黃芪多糖（astragalus polysaccharide,AP）是從中藥黃芪中提取的有效成分，具有免疫調節、抗炎、促增殖等作用[3]。在病毒性心肌炎研究中，AP可通過抑制多種病理條件下炎癥基因的表達改善小鼠心肌損傷[4]。據報道，高遷移率族蛋白Box-1（high mobility group protein，HMGB1）是炎癥過程的重要細胞外介質，晚期糖基化終產物受體（receptor for advanced glycation endproducts，RAGE）是已知的HMGB1受體。兩者結合可促進促炎性細胞因子的釋放，參與炎癥性疾病的發展[5]，包括心肌炎[6]。本研究旨在探討AP對EAM心肌損傷的影響及相關機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 50只SPF級SD大鼠，雄性，7周齡，250～270 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，生產許可證號為SCXK（京）2019-0008，實驗動物合格證號：SYXK(京)2020-0013。將大鼠置于動物房中，控制條件為（25±2）℃，相對濕度為（60±5）%，光照-黑暗周期為12/12 h，不禁水食。本研究通過動物倫理委員會批準（批號：2021-00920）。

1.1.2 主要實驗試劑 注射用AP（批號：20220318，250 mg/瓶，天津賽諾制藥有限公司）；弗氏完全佐劑（批號：F-5881）、豬心肌肌球蛋白（批號：M0630）（美國Sigma公司）；增強化學發光試劑（批號：P0018A）、蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色試劑盒（批號：C0105）、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白檢測試劑盒（批號：P0012S）（上海碧云天生物技術有限公司）；重組高遷移率組蛋白B1（recombinant high mobility histone B1，rHMGB1）（批號：JN0259）（北京百奧萊博科技有限公司）；白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）ELLSA試劑盒（批號：ml064292）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELLSA試劑盒（批號：ml002859）（上海酶聯科技公司）；放射免疫沉淀法（radio immunoprecipitation Assay，RIPA）裂解緩沖液（批號：R0020）、Masson′s染色試劑盒（批號：G1340-100）（北京索萊寶科技公司）；HMGB1（批號：ab18256）、RAGE抗體（批號：ab216329）（美國Abcam公司）。

1.1.3 主要實驗儀器 Sonos 5500超聲儀（美國菲利普斯公司）；BX51光學顯微鏡（日本奧林巴斯公司）。

1.2 方法

1.2.1 EAM大鼠模型的制備及干預 參照文獻[7]進行制備EAM大鼠模型，首先制備抗原佐劑乳化液：將純化的豬心肌肌球蛋白溶解在0.01 md/L磷酸緩沖鹽溶液中，制備濃度為10 mg/mL的溶液，并用添加10 mg/mL結核分枝桿菌H37RA的等體積弗氏完全佐劑乳化，若豬心肌肌球蛋白完全乳化，則呈乳白色，將其滴入水平面后不會擴散。大鼠適應性喂養1周后，隨機分為對照組、EAM組、AP組、rHMGB1組、AP+rHMGB1組，每組10只。對照組大鼠用磷酸緩沖鹽溶液乳化的弗氏完全佐劑（0.1 mL）于實驗第0天及第7天分別給予左、右后足墊皮下注射，同時每天給予大鼠腹腔及尾部注射生理鹽水，連續3周；EAM組大鼠用上述抗原佐劑乳化液（0.1 mL）于實驗第0天及第7天分別給予左、右后足墊皮下注射，同時每天給予大鼠腹腔及尾部注射生理鹽水，連續3周；AP組大鼠用上述抗原佐劑乳化液（0.1 mL）于實驗第0天及第7天分別給予左、右后足墊皮下注射，同時每天給予大鼠腹腔注射30 g/kg AP，并進行尾部注射生理鹽水，連續3周[8]；rHMGB1組大鼠用上述抗原佐劑乳化液（0.1 mL）于實驗第0天及第7天分別給予左、右后足墊皮下注射，同時每天給予大鼠尾部注射rHMGB1，8 μg/kg，并進行腹腔注射生理鹽水，連續3周[9]；AP+rHMGB1組大鼠用上述抗原佐劑乳化液（0.1 mL）于實驗第0天及第7天分別給予左、右后足墊皮下注射，同時每天給予大鼠尾部注射rHMGB1，8 μg/kg，并進行腹腔注射AP，30 g/kg，連續3周。

1.2.2 心肌功能檢測 麻醉各組大鼠，將導管尖端通過右頸動脈引入左心室，使用Sonos 5500超聲儀檢測心率（heart rate，HR）、左心室射血分數（left ventricular ejection fraction，LVEF）和舒張末期內徑（end-diastolic diameter，LVEDs）。

1.2.3 炎癥因子水平檢測 從大鼠股動脈采集血液并制備血清，按照ELISA試劑盒測量炎癥因子（TNF-α、IL-6）水平。

1.2.4 心肌組織病理學檢測 分離各組大鼠心臟，將左半部分心臟固定在4%中性多聚甲醛中，在逐漸增加的乙醇濃度（70%、96%和100%）中脫水，在二甲苯中清洗，浸入石蠟中，制備5 μm厚的連續切片，然后經HE染色，光學顯微鏡下觀察組織變化，并對病理切片進行評分[10]：4分，切片病變區域≥50%橫切面；3分，切片病變區域≥10%且＜50%；2分，切片病變區域≥10%且＜10%；0分，心肌組織正常。

1.2.5 心肌組織纖維化檢測 取“1.2.4中”制備的組織切片，按照Masson′s試劑盒要求進行染色，隨機選取5個視野于光學顯微鏡觀察心肌組織纖維化。

1.2.6 Western blotting檢測HMGB1、RAGE蛋白表達 使用放射免疫沉淀試驗裂解緩沖液提取右半球部分心臟組織中總蛋白質，利用試劑盒對蛋白進行定量，使總蛋白通過煮沸變性，通過10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gelelectrophoresis，PAGE）分離蛋白質并轉移到膜上，在室溫下封閉1h，將膜與以下一抗一起溫育：HMGB1、RAGE（1：1 000），并在室溫下加入山羊抗兔IgG或山羊抗鼠（1：2 000），持續孵育2 h，隨后使用增強的化學發光試劑顯色，使用ImageQuant LAS 4000檢測化學發光發射的信號，并用ImageJ軟件定量分析，結果以β-肌動蛋白（β-actin）為內部標準。

1.2.7 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測心肌組織中HMGB1 mRNA、RAGE mRNA表達 將部分右半球心臟快速冷凍并儲存在-80 ℃，將組織在總RNA抽提試劑（Trizol）中勻漿，用苯酚-氯仿提取3次，并將總RNA溶解在10 μL無RNA酶的水中，利用逆轉錄試劑盒制備cDNA。使用SYBR Green Master Mix進行實時qRT-PCR反應，結果以β-actin為內部參考并通過2-ΔΔCT法分析HMGB1 mRNA、RAGE mRNA表達。引物序列如下：β-actin上游引物為5'-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3'，下游引物為5'-CTGGAAG GTGGACAGCGAGG-3'；HMGB-1上游引物為5'-GCAGATGACAAGCAGCCTTA-3'，下游引物為5'-TTTGCTGCA TCAGGCTTTCC-3'；RAGE 上游引物為5'-GACTCTTAGCTGGCACTTGGAT-3'，下游引物為5'-GGACTTC ACAGGTCAGGG TTAC-3'。

1.3 統計學方法 采用SPSS 27.0軟件分析實驗數據，計量資料以“均數±標準差”（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 AP對各組大鼠心功能指標的影響 與對照組比較，EAM組HR、LVEDs顯著增加，LVEF顯著下降（P＜0.05）；與EAM組比較，AP組HR、LVEDs顯著降低，LVEF顯著增加（P＜0.05），但rHMGB1組HR、LVEDs顯著增加，LVEF顯著下降（P＜0.05）；與AP組比較，AP+rHMGB1組HR、LVEDs顯著增加，LVEF顯著下降（P＜0.05）；與rHMGB1組比較，AP+rHMGB1組HR、LVEDs顯著降低，LVEF顯著增加（P＜0.05），提示AP可改善EAM大鼠心功能指標。（見表1）

表1 各組大鼠HR、LVEF 和LVEDd 比較 （±s）

表1 各組大鼠HR、LVEF 和LVEDd 比較 （±s）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與EAM組比較，bP＜0.05；與AP組比較，cP＜0.05；與rHMGB1組比較，dP＜0.05。

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2.2 AP對各組大鼠血清炎癥因子的影響 與對照組比較，EAM組TNF-α、IL-6水平顯著增加（P＜0.05）；與EAM組比較，AP組TNF-α、IL-6水平顯著降低（P＜0.05），但rHMGB1組TNF-α、IL-6水平顯著增加（P＜0.05）；與AP組比較，AP+rHMGB1組TNF-α、IL-6水平顯著增加（P＜0.05）；與rHMGB1組比較，AP+rHMGB1組TNF-α、IL-6水平顯著降低（P＜0.05），提示AP可抑制EAM大鼠炎癥反應的發展。（見表2）

表2 各組大鼠血清中TNF-α、IL-6 水平比較（±s，pg/mL）

表2 各組大鼠血清中TNF-α、IL-6 水平比較（±s，pg/mL）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與EAM組比較，bP＜0.05；與AP組比較，cP＜0.05；與rHMGB1組比較，dP＜0.05。

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2.3 AP對各組大鼠心肌組織病理學的影響 對照組心肌結構完整，炎癥細胞浸潤較少，但EAM組心肌結構紊亂，炎癥細胞浸潤較為嚴重；AP干預后，炎癥細胞浸潤等病理損傷明顯減少，rHMGB1干預后，病理損傷較EAM組進一步加重；但AP與rHMGB1聯合干預，病理損傷較AP干預加重，但較rHMGB1干預減輕。（見圖1）與對照組比較，EAM組病理評分顯著增加（P＜0.05）；與EAM組比較，AP組病理評分顯著降低（P＜0.05），但rHMGB1組病理評分顯著增加（P＜0.05）；與AP組比較，AP+rHMGB1組病理評分顯著增加（P＜0.05）；與rHMGB1組比較，AP+rHMGB1組病理評分顯著降低（P＜0.05），提示AP可改善EAM大鼠心肌組織病理損傷。（見表3）

圖1 HE 檢測心肌組織病理學變化 （×200）

表3 各組大鼠病理評分比較 （±s，分）

表3 各組大鼠病理評分比較 （±s，分）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與EAM組比較，bP＜0.05；與AP組比較，cP＜0.05；與rHMGB1組比較，dP＜0.05。

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2.4 AP對各組大鼠心肌纖維化的影響 對照組無顯著纖維化變性；EAM組纖維化變性較為明顯，有大量膠原纖維顯現；AP組心肌纖維化得到改善，但rHMGB1組纖維化變性較EAM組嚴重，AP+rHMGB1組纖維化程度與EAM組無明顯差異，提示AP可改善EAM大鼠心肌纖維化。（見圖2）

圖2 Masson′s 染色檢測心肌組織纖維化 （×200）

2.5 AP對大鼠HMGB1、RAGE蛋白表達的影響 與對照組比較，EAM組HMGB1、RAGE蛋白表達顯著增加（P＜0.05）；與EAM組比較，AP組HMGB1、RAGE蛋白表達顯著降低（P＜0.05），但rHMGB1組HMGB1、RAGE蛋白表達顯著增加（P＜0.05）；與AP組比較，AP+rHMGB1組HMGB1、RAGE蛋白表達顯著增加（P＜0.05）；與rHMGB1組比較，AP+rHMGB1組HMGB1、RAGE蛋白表達顯著降低（P＜0.05），提示AP通過抑制HMGB1、RAGE蛋白表達對EAM大鼠發揮保護作用。（見圖3、表4）

圖3 心肌組織HMGB1、RAGE 蛋白表達Western blotting 圖

表4 各組大鼠心肌組織中HMGB1、RAGE 蛋白表達的比較（±s）

表4 各組大鼠心肌組織中HMGB1、RAGE 蛋白表達的比較（±s）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與EAM組比較，bP＜0.05；與AP組比較，cP＜0.05；與rHMGB1組比較，dP＜0.05。

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2.6 AP對大鼠心肌組織HMGB1 mRNA、RAGE mRNA表達的影響 與對照組比較，EAM組HMGB1 mRNA、RAGE mRNA表達顯著增加（P＜0.05）；與EAM組比較，AP組HMGB1 mRNA、RAGE mRNA表達顯著降低（P＜0.05），但rHMGB1組HMGB1 mRNA、RAGE mRNA表達顯著增加（P＜0.05）；與AP組比較，AP+rHMGB1組HMGB1 mRNA、RAGE mRNA表達顯著增加（P＜0.05）；與rHMGB1 mRNA組比較，AP+rHMGB1組HMGB1 mRNA、RAGE mRNA表達顯著降低（P＜0.05），提示AP通過抑制HMGB1、RAGE表達對EAM大鼠發揮保護作用。（見表5）

表5 各組心肌組織中HMGB1、RAGE mRNA表達的比較 （±s）

表5 各組心肌組織中HMGB1、RAGE mRNA表達的比較 （±s）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與EAM組比較，bP＜0.05；與AP組比較，cP＜0.05；與rHMGB1組比較，dP＜0.05。

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3 討論

心肌炎是一種與自身免疫發展有關的心肌炎癥性疾病，EAM發病病理及病理特征多與擴張型心肌炎、病毒性心肌炎類似，是研究心肌損傷機制的有效動物模型[10]。本研究通過后足墊皮下注射抗原佐劑乳化液方法建立EAM大鼠模型，結果發現大鼠LVEDs、HR明顯升高，LVEF值下降，提示大鼠心功能惡化，EAM大鼠模型構建成功[11]。

天然產品由于其安全性、副作用小，在心血管疾病的治療中越來越受歡迎[12]。AP是黃芪的提取物，具有抗氧化、抗病毒、抗應激、免疫平衡和抗炎等作用[13]。研究證明AP能顯著降低糖尿病大鼠的血糖、游離脂肪酸，從而減輕心肌損傷[14]。LIU Y J等[15]研究證明AP可提高心肌抗氧化能力，減緩心肌纖維化發展，有望參與臨床治療擴張型心肌病。結合以往的研究結果，筆者推測AP在心肌炎治療方面具有很大潛力。EAM屬于免疫炎癥性疾病，可激活肥大細胞及T細胞等分泌TNF-α、IL-6等炎癥因子，引發心肌炎癥損傷，造成心肌纖維化，損害心功能[16]。HE及Masson′s染色結果顯示，EAM組心肌結構紊亂，炎癥細胞浸潤及纖維化較為嚴重。AP可改善EAM大鼠心肌病理損傷及纖維化。同時研究還發現AP可降低TNF-α、IL-6水平，提高心功能指標，提示AP可通過降低炎癥反應，抑制EAM心肌病理損傷及纖維化，防止EAM病情加重。

HMGB1是一種進化上保守的染色質結合因子。在創傷或感染刺激時，細胞外環境中就會被動釋放HMGB1，向周圍細胞發出危險信號，激活細胞免疫功能，并促進組織修復[17]。RAGE是一種具有黏附分子結構特征的跨膜受體，參與由HMGB1介導的多種病理過程，該通路在多種病理條件下表現出有希望的藥理學靶點[18]。本研究發現EAM大鼠心肌組織中，HMGB1、RAGE蛋白及mRNA表達顯著增加，提示激活HMGB1-RAGE信號通路促進了EAM進展。CHEN Q F等[19]研究證明抑制HMGB1表達可改善冠狀動脈微栓塞引發的心功能異常及心肌損傷。在EAM期間[20]，阻斷RAGE激活可減少炎癥反應，改善心臟功能。本研究結果顯示，AP干預后，HMGB1、RAGE蛋白及mRNA表達下調，改善了EAM大鼠心肌損傷。AP可能通過抑制HMGB1-RAGE信號通路發揮對EAM大鼠的心肌保護作用。為進一步驗證實驗推測，本研究以HMGB1激活劑-rHMGB1進行回復驗證，結果發現rHMGB1逆轉了AP對EAM大鼠的保護作用，表明AP可能通過抑制HMGB1-RAGE信號通路改善EAM大鼠心肌損傷。

綜上所述，AP可抑制EAM大鼠炎癥反應，改善心肌損傷，可能與抑制HMGB1-RAGE信號通路有關，但由于機制復雜，涉及上下游相關蛋白較多，后續將繼續開展相關機制探索。