基于UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS的芪龍壯兒口服液指紋圖譜研究*

崔小敏，董明芝，陳志永，魯文靜，胡 靜，李 寧，曲 彤，任 慧

（1.陜西省中醫藥研究院，陜西 西安 710061；2.西安正大制藥有限公司，陜西 西安 710043）

芪龍壯兒口服液是由著名中醫兒科專家午雪嶠主任醫師根據中醫理論，針對小兒脾腎兩虛所致疳積、五遲五軟、血虛之證擬定的中成藥。芪龍壯兒口服液為OTC甲類中成藥，以黃芪、黨參為君藥，熟地黃、當歸、阿膠、鹿角膠、龜甲膠為臣藥，龍骨、牡蠣、白術、山藥、雞內金、山楂和麥芽為佐使之藥。全方健脾補腎，益氣養血，填精充髓，消食和胃，臨床主要用于治療小兒佝僂病。

目前芪龍壯兒口服液的質量控制方法是采用薄層掃描法測定其中黃芪甲苷的含量[1]，難以全面反映和控制芪龍壯兒口服液的制劑質量。中藥及復方制劑化學成分復雜，質量控制是其研究的難點，檢測其中一種成分并不能代表整體質量。中藥指紋圖譜具有整體性和模糊性的顯著特點，能全面、定量反映中藥所包含的化學信息，為中藥質量控制最常見的有效手段[2]。課題組前期嘗試采用HPLC-UV法建立芪龍壯兒口服液指紋圖譜，發現HPLC-UV色譜圖化學信息量很少。UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS技術將超高效液相色譜對復雜樣品的高分離能力與質譜的高分辨率、高靈敏度及能提供化合物的元素組成及離子碎片信息等特點結合起來，可用于化合物的快速鑒定。該技術已被廣泛應用于中藥化學成分鑒定和指紋圖譜研究[3-4]。本研究利用UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS可以同時檢測正、負離子化合物的優勢，建立了芪龍壯兒口服液正、負兩種離子模式下的指紋圖譜，同時對10批樣品進行了相似度評價，對其中的共有峰進行了質譜鑒定，從正、負兩個維度較為全面地表征了該制劑的化學成分指紋特征，旨在為芪龍壯兒口服液的綜合質量評價和藥效物質研究提供科學依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器 UltiMate 3000系列高效液相色譜儀（美國戴安公司）；Thermo Fisher Q Exactive Focus型質譜儀，配有可加熱電噴霧離子源（HESI）及Xcalibur4.0數據處理軟件；KQ-400DE型超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）；BT25S型十萬分之一電子分析天平、BS210S型萬分之一電子分析天平（北京賽多利斯科學儀器有限公司）。

1.2 藥物與試劑 10批芪龍壯兒口服液[規格：10 mL/支；批號：211135（S1），211136（S2），211237（S3），211238（S4），211239（S5），211240（S6），211241（S7），2111242（S8），211243（S9），211244（S10）]由西安正大制藥有限公司提供。腺苷（批號：MUST-21070613）、鳥苷（批號：MUST-22021408）、異毛蕊花糖苷（批號：MUST-22030810）均購自成都曼思特生物科技有限公司；L-色氨酸（批號：wkq22011707）、毛蕊異黃酮苷（批號：wkq20010904）、黨參炔苷（批號：wkq17110203）、芒柄花苷（批號：wkq20060507）、毛蕊異黃酮（批號：wkq20010906）、芒柄花素（批號：wkq20062208）均購自四川省維克奇生物科技有限公司；3-羥基-9,10-二甲氧基紫檀烷（批號：HR2182W1）、白術內酯Ⅲ（批號：HS20913B1）、焦谷氨酸（批號：HR22271W2）、尿苷（批號：HS2175B1）均購自寶雞辰光生物科技有限公司；咖啡酸（批號：17122804）購自成都普菲德生物技術有限公司。以上對照品純度均≥98%。甲醇和甲酸為色譜純，均購自美國Fisher試劑公司，水為重蒸水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱為Thermo Accucore aQ RP18（2.1 mm×150 mm，2.6 μm）；流動相為甲醇（A）-0.1%甲酸水溶液（B）梯度洗脫（0~5 min，0%A；5~45 min，0%A~58%A；45~60 min，58%A~65%A）；柱溫為25 ℃，流速為0.3 mL/min，進樣量為2 μL。

2.2 質譜條件 Thermo UHPLC-Q-Exactive Focus型液質聯用儀，采用加熱電噴霧離子源（HESI），正、負離子同時檢測模式，負離子模式下的噴霧電壓設定為2 800 V，正離子模式下的噴霧電壓設定為3 500 V；碰撞電壓為階梯能量20、40、60 eV；掃描方式為一級全掃描/數據依賴型二級質譜掃描（full MS/dd-MS2），Full MS分辨率為70 000，dd-MS2分辨率為17 500，掃描范圍（m/z）為80~1 200，離子傳輸毛細管溫度為320 ℃，透鏡電壓為55 kPa，霧化室溫度為350 ℃，鞘氣和輔助氣流速分別為40、10 arb。

2.3 溶液的制備

2.3.1 對照品溶液的制備 分正、負兩種檢測模式制成兩組混合對照品溶液。分別取各對照品適量，加甲醇制備成含腺苷、鳥苷、L-色氨酸、毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、3-羥基-9,10-二甲氧基紫檀烷、芒柄花素、白術內酯Ⅲ質量濃度分別為86、37、15、144、46、55、18、25、19 μg/mL的混合對照品溶液Ⅰ（正離子模式）和含焦谷氨酸、尿苷、咖啡酸、毛蕊異黃酮苷、異毛蕊花糖苷、黨參炔苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素質量濃度分別為65、70、20、144、45、24、46、55、25 μg/mL的混合對照品溶液Ⅱ（負離子模式）。

2.3.2 供試品溶液的制備 精密量取芪龍壯兒口服液2 mL，置于15 mL離心管中，加入8 mL乙腈，于渦旋振蕩器中振蕩混勻5 min，于4 ℃靜置0.5 h后，2 500 r/min條件下離心20 min，取上清液1 mL，吹干溶劑，殘渣用30%甲醇-水溶解并定容至1 mL，振搖，0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.3.3 各單味藥樣品制備 根據各單味藥在處方中對應的處方量和配比取樣，制備單味藥材樣品溶液。

2.4 指紋圖譜方法學考察

2.4.1 精密度試驗 取供試品溶液（批號：211135）連續進樣6次，正離子模式以18號共有峰毛蕊異黃酮為參照峰，負離子模式以9號共有峰毛蕊異黃酮苷為參照峰，分別計算正離子模式下的24個共有峰和負離子模式下的17個共有峰與所選定參照峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD。結果RSD值分別小于0.62%和2.84%，表明該方法精密度良好。

2.4.2 穩定性試驗 取芪龍壯兒口服液2 mL（批號：211135），按照“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，分別在室溫放置0、2、4、8、12、24 h進樣分析。分別計算正離子模式下的24個共有峰和負離子模式下的17個共有峰與所選定參照峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD。結果RSD值均分別小于0.89%和3.16%，表明樣品制備成供試品溶液后在室溫放置24 h穩定性良好。

2.4.3 重復性試驗 取芪龍壯兒口服液2 mL（批號：211135），按照“2.3.2”項下方法平行制備6份供試品溶液并進樣分析。分別計算正離子模式下的24個共有峰和負離子模式下的17個共有峰與所選定參照峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD。結果RSD值分別小于0.55%和2.97%，表明該方法重復性良好。

2.5 指紋圖譜的建立和相似度評價

2.5.1 10批樣品指紋圖譜建立和相似度分析 取10批芪龍壯兒口服液（S1～S10），按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”和“2.2”項下色譜條件和質譜條件進樣分析。使用Xcalibar 4.0軟件將數據文件導出為“ txt”格式，采用2012版中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件進行全譜峰匹配，采用多點校正模式，平均數法（時間窗0.1 min）生成指紋圖譜。正離子模式指紋圖譜見圖1，確定共有峰24個；負離子模式指紋圖譜見圖2，確定共有峰17個。正離子模式下，S1～S10與對照指紋圖譜的相似度分別為0.995、0.995、0.995、0.993、0.997、0.986、0.989、0.993、0.994、0.986。負離子模式下，S1～S10與對照指紋圖譜的相似度分別為0.997、0.991、0.997、0.997、0.997、0.994、0.968、0.973、0.988、0.993。結果表明正、負離子兩種檢測模式下的10批樣品相似度均大于0.960，表明不同批次的芪龍壯兒口服液之間具有良好的一致性，其投料藥材質量及生產工藝比較穩定。

圖1 10 批芪龍壯兒口服液正離子模式下的指紋圖譜

圖2 10 批芪龍壯兒口服液負離子模式下的指紋圖譜

2.5.2 指紋圖譜中共有峰的歸屬 取供試品溶液、單味藥材、空白溶劑，按照“2.1”和“2.2”項下色譜條件和質譜條件進樣，記錄質譜總離子流基峰圖，比對色譜圖中各峰，將主要色譜峰進行藥材的歸屬。結果見表1~2。

表1 芪龍壯兒口服液在UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS 正離子模式下指紋圖譜共有峰鑒定

表2 芪龍壯兒口服液在UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS 負離子模式下指紋圖譜共有峰鑒定

2.5.3 指紋圖譜中共有峰的鑒定 根據高分辨質譜一級、二級數據和參考文獻，共鑒定了正離子模式下15個共有峰和負離子模式下的12個共有峰，結果見表1~2。其中正離子模式下有9個化合物采用對照品比對鑒定分別為腺苷（4號共有指紋峰）、鳥苷（5號共有指紋峰）、L-色氨酸（7號共有指紋峰）、毛蕊異黃酮苷（12號共有指紋峰）、芒柄花苷（17號共有指紋峰）、毛蕊異黃酮（18號共有指紋峰）、3-羥基-9,10-二甲氧基紫檀烷（21號共有指紋峰）、芒柄花素（23號共有指紋峰）、白術內酯Ⅲ（24號共有指紋峰）；負離子模式下有9個化合物采用對照品比對鑒定分別為焦谷氨酸（1號共有指紋峰）、尿苷（2號共有指紋峰）、咖啡酸（7號共有指紋峰）、毛蕊異黃酮苷（9號共有指紋峰）、異毛蕊花糖苷（10號共有指紋峰）、黨參炔苷（11號共有指紋峰）、芒柄花苷（12號共有指紋峰）、毛蕊異黃酮（14號共有指紋峰）、芒柄花素（16號共有指紋峰）。（見圖3）共有峰的質譜鑒定過程以異毛蕊花糖苷為例進行說明。異毛蕊花糖苷在負離子模式下的準離子峰為（m/z）623.198 1[M-H]-，經Xcalibar 4.0軟件擬合其分子式為C29H36O15，二級碎片離子有（m/z）461.167 1[M-H-C9H6O3]-和（m/z）161.024 4[M-H-C20H30O12]-，為咖啡酰鍵斷裂產生，（m/z）461.167 1[M-H-C9H6O3]-進一步失去一分子鼠李糖產生碎片（m/z）315.107 9[M-H-C9H6O3-Rha]-，（m/z）161.024 4[M-H-C20H30O12]-失去一分子CO產生碎片離子（m/z）133.029 5[M-H-C20H30O12-CO]-。根據以上裂解途徑，參考相關文獻[5]并通過對照品比對確定負離子模式下的化合物10為異毛蕊花糖苷，其可能的質譜裂解途徑見圖4。

圖3 混合對照品和芪龍壯兒口服液對照指紋圖譜的總離子流基峰圖

圖4 異毛蕊花糖苷的質譜裂解途徑

3 討論

本試驗分別考察了不同色譜柱[Thermo Accucore aQ RP18（2.1 mm×150 mm，2.6 μm）和Agilent Poroshell 120 ECC18（4.6 mm×150 mm，2.7 μm）]、不同流動相組合（甲醇、乙腈和水）及添加不同濃度的甲酸（0.1%和0.2%）對結果的影響。結果表明采用Thermo Accucore aQ RP18（2.1 mm×150 mm，2.6μm）色譜柱，以甲醇-0.1%甲酸水溶液作為流動相進行梯度洗脫，質譜響應值較高，色譜峰分離效果最佳、峰形最好。

正、負離子指紋圖譜中均有數個峰未進行鑒定，如正離子指紋圖譜中50 min以后的色譜峰和負離子指紋圖譜中50 min前后的色譜峰。經比對這些色譜峰為輔料甜菊苷或者空白溶劑本來就有的峰，因此未納入指紋圖譜共有峰當中。

芪龍壯兒口服液含有阿膠、鹿角膠、龜甲膠等富含氨基酸的膠類藥材。氨基酸類化合物在常規的HPLC-UV條件下直接檢測不到色譜峰[17-19]，且紫外檢測器只能檢測到含有紫外發光基團的化合物，具有一定局限性。質譜檢測器屬于通用型檢測器，對氨基酸類等無紫外吸收的化合物均有較好的響應信號[20]，因此本研究采用UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS技術建立了芪龍壯兒口服液正、負離子檢測模式下的兩種指紋圖譜，信息量豐富、分離效果好，從正、負兩個不同的維度較全面地反映了芪龍壯兒口服液的成分信息，且高分辨質譜可以直接利用其采集到的數據信息對化合物進行鑒定，對于建立科學、合理的芪龍壯兒口服液質量評價方法，提高其質量控制標準具有一定的參考意義。