五指毛桃飲片的質量標準研究*

梁永娟，韋禮校，蘇靜紅，李錦清，陳 清，林青華,，蔣 林,

（1.廣西中醫藥大學藥學院，廣西 南寧 530200；2.廣西中醫藥大學廣西壯瑤藥工程技術研究中心，廣西 南寧 530200）

五指毛桃始載于清代何克諫所著的《生草藥性備要》，時稱之“五爪龍”[1]，今又名土黃芪、五指牛奶、土五加皮、母豬奶、南芪，主要產銷于廣東、廣西，有“廣東人參”的美譽[2-4]，是嶺南地區常用的藥食同源類中藥[5-6]。五指毛桃為桑科植物粗葉榕Ficus hirta Vahl的干燥根，其味甘性平，歸脾、肺、胃、大腸、肝經，具有健脾益氣、行氣利濕、舒筋活絡的功效，用于治療脾虛浮腫、食少無力、肺癆咳嗽、盜汗、帶下、產后無乳、風濕痹痛、水腫、鼓脹、肝膽濕熱、跌打損傷[7-8]。現代研究表明，五指毛桃主要含有苯丙素類、黃酮類、萜類、甾醇類、揮發油類等多種化學成分，具有保肝、提高免疫力、止咳祛痰、抗氧化、抗菌、抗炎等多種藥理作用，廣泛應用于治療消化系統、循環系統、呼吸系統和生殖系統等多個系統疾病[9-10]。現已開發出的五指毛桃香雞、五指毛桃果凍等多種食用產品[11]，極具藥用、食用的開發價值。

中藥飲片作為中醫臨床療效的物質基礎，是直接用于臨床調配或制劑生產的原料藥[12-13]。因此，中藥飲片質量對于保障中醫臨床用藥的有效性、安全性，推動中醫藥事業發展具有重要意義[14-15]。然而，五指毛桃飲片并未被2020年版《中華人民共和國藥典》收載，現僅收載于廣東[16]、福建[17]、湖南[18]的地方炮制規范中。現有的五指毛桃飲片質量標準并不完善，這不利于五指毛桃飲片的質量控制及進一步開發。此外，五指毛桃飲片質量標準研究方面的文獻也未見報道，故本研究參照2020年版《中華人民共和國藥典》（四部）和《中藥配方顆粒質量控制與標準制定技術要求》[19]的相關規定，對不同產地的29批五指毛桃飲片進行研究，以期為完善五指毛桃飲片的質量標準提供參考和依據，同時也為五指毛桃配方顆粒及其相關制劑的研發奠定基礎。

1 材料

1.1 儀器 Waters 2695型高效液相色譜儀（美國Waters公司）；Direct-Q5UV超純水儀一體機（廣西南寧博美生物科技有限公司）；MS105DU型電子分析天平（瑞士梅特勒托利多儀器有限公司）；DMB-1223型數顯生物顯微鏡（麥克奧迪實業集團有限公司）；DHG-9140A型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海齊欣科學儀器有限公司）、SX2-4-10型馬弗爐（沈陽市節能電爐廠）；硅膠板G板（青島海洋化工有限公司）；HWS-28型恒溫水浴鍋（上海齊欣科學儀器有限公司）；KQ-500E超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 藥品和試劑 補骨脂素對照品（純度＞98%，批號：RP220515）、佛手苷內酯對照品（純度＞98%，批號：HR21513B1）均購于成都麥德生科技有限公司；色譜級甲醇[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]；甲醇、正己烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲酸、磷酸等均為分析純。

收集五指毛桃飲片共29批，經廣西中醫藥大學藥學院朱意麟教授鑒定為桑科植物粗葉榕Ficus hirta Vahl干燥根的加工品，樣品信息具體見表1。

表1 五指毛桃飲片樣品信息

2 方法與結果

2.1 外觀性狀鑒別 本品呈類圓形或不規則的厚片，直徑0.5~8.0 cm。表皮灰棕色至紅褐色，細縱紋明顯，可見橫向皮孔。木部寬廣，黃白色，密布同心性環紋，皮部薄而韌，易與木部相剝離。質硬而脆，斷面纖維性，氣微香，味微甘。（見圖1）

圖1 類圓形（A）及不規則形（B）的五指毛桃飲片

2.2 粉末顯微鑒別 本品粉末灰黃白色。石細胞散在或成群，直徑16~45 μm，孔溝明顯。草酸鈣方晶散在，直徑5~25 μm。淀粉粒眾多，多為復粒（2～5分粒），臍點圓點形，層紋不明顯，單粒呈類圓形或類橢圓形。木纖維多成束，壁厚。木栓細胞呈紅棕色，壁較厚。導管多為具緣紋孔導管。（見圖2）

圖2 五指毛桃飲片的粉末顯微圖

2.3 薄層鑒別 按2020年版《中華人民共和國藥典》（四部）的薄層色譜法（通則0502）操作要求，取五指毛桃粉末（過2號篩）1 g，加乙醇15 mL，超聲（功率500 W）處理40 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加乙醇1 mL使溶解，即得供試品溶液。另取補骨脂素對照品，加乙醇制成每1 mL含1.03 mg的溶液，作為對照品溶液。吸取上述兩種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（體積比為20：0.4：0.5：0.7）為展開劑，展開，取出，晾干，噴10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加熱至斑點顯色清晰，分別于日光和紫外燈（365 nm）下檢視。結果發現，供試品與對照品在薄層板相應位置上顯相同顏色的熒光斑點，且斑點清晰，分離度良好，但不同批次樣品斑點的大小及顏色的深淺略有不同。（見圖3）

圖3 五指毛桃飲片在日光下（A）和熒光下（B）的薄層色譜圖

2.4 檢查 按照2020年版《中華人民共和國藥典》（四部）的水分測定法（通則0832，烘干法）、灰分測定法（通則2302）、浸出物測定法（通則2201，熱浸法），對29批五指毛桃飲片進行測定，具體結果見表2。

表2 五指毛桃飲片水分、總灰分、酸不溶性灰分和水溶性浸出物檢測結果 （n=2）

結果表明，29批五指毛桃飲片水分、總灰分、酸不容性灰分及水溶性浸出物的含量范圍分別為5.67%~11.29%、1.90%~3.85%、0.06%~0.69%、5.71%~19.17%，其平均含量分別為8.02%、2.47%、0.23%和12.16%。按各檢測項平均值波動20%的原則[20-21]，并綜合考慮產地氣候、生長環境、采收加工、炮制加工、存儲條件等因素[22]的影響，擬定五指毛桃飲片的水分、總灰分和酸不溶性灰分分別不得超過12.0%、4.0%和0.7%，其水溶性浸出物不得低于6.0%。

2.5 含量測定

2.5.1 對照品溶液的制備 取補骨脂素、佛手柑內酯適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含補骨脂素100.4 μg、佛手柑內酯50 μg的溶液，即得。

2.5.2 供試品溶液的制備 取五指毛桃飲片粉末約0.5 g（過5號篩），精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加甲醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理40 min，放冷，再稱定質量，用甲醇補足損失質量，搖勻，濾過，取續濾液5 mL水浴揮干，殘渣加甲醇1 mL復溶，濾過，取續濾液，即得。

2.5.3 色譜條件 色譜柱為UltimateRXB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以甲醇為流動相A，以0.1%磷酸溶液為流動相B，梯度洗脫（0~10 min，40%A~50%A；10~18 min，50%A~54%A；18~30 min，54%A~80%A；30~35 min，80%A~95%A；35~40 min，95%A）；柱溫為30 ℃；流速為1 mL/min；檢測波長為245 nm；進樣量為20 μL。對照品及供試品的色譜圖見圖4。

圖4 對照品溶液（A）和供試品溶液（B）的HPLC 圖

2.5.4 方法學考察 （1）線性關系的考察：精密取對照品溶液1、3、5、7、10 mL，分別置10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，按“2.5.3”項下條件進樣，記錄峰面積。以對照品溶液濃度（X，μg/mL）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標繪制標準曲線，求得補骨脂素的回歸方程為Y=148 599X+61 866（R2=0.9 991），佛手柑內酯的回歸方程為Y=71 096X+17 836（R2=0.9R997），表明補骨脂素與佛手柑內酯分別在10.04~100.40 μg/mL和5~50 μg/mL范圍內線性關系良好。

（2）精密度試驗：取五指毛桃飲片（WT15）的供試品溶液，按“2.5.3”項下條件連續進樣6次，記錄峰面積。求得補骨脂素、佛手柑內酯峰面積的RSD值分別為0.18%、0.08%，表明儀器精密度良好。（見表3）

表3 精密度試驗考察結果

（3）重復性試驗：稱取五指毛桃飲片（WT15），按“2.5.2”項下方法平行制備供試品溶液6份，按“2.5.3”項下條件依次進樣，記錄峰面積。求得補骨脂素、佛手柑內酯峰面積的RSD值分別為2.08%、0.76%，表明該方法重復性良好。

（4）穩定性試驗：取五指毛桃飲片（WT15）的供試品溶液，按“2.5.3”項下條件分別于0、2、8、12、18、24 h進樣，記錄峰面積。求得補骨脂素、佛手柑內酯峰面積的RSD值分別為0.73%、0.60%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

（5）加樣回收率試驗：稱取已知補骨脂素、佛手柑內酯含量的五指毛桃飲片（WT15）9份，分別按補骨脂素、佛手柑內酯含量的80%、100%和120%加入相應對照品，按“2.5.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.5.3”項下條件進樣，記錄峰面積。求得補骨脂素、佛手柑內酯平均加樣回收率分別為101.23%和98.72%，RSD值分別為1.78%和2.12%，說明該方法準確度良好。（見表4）

表4 五指毛桃飲片中補骨脂素、佛手柑內酯的加樣回收率結果

2.5.5 樣品測定 按“2.5.2”項下方法制備各批次五指毛桃飲片的供試品溶液，按“2.5.3”項下條件分別進樣，記錄峰面積，按標準曲線法計算補骨脂素、佛手柑內酯的含量。結果表明，29批五指毛桃飲片中補骨脂素、佛手柑內酯的含量分別為0.01%~0.36%、0.01%~0.18%，平均含量分別為0.17%、0.05%。按平均含量下調20%的原則[20-21]，并在充分考慮中藥指標性成分（有效成分）量值差異懸殊的基礎上，擬定五指毛桃飲片中補骨脂素、佛手柑內酯的含量分別不得低于0.02%、0.01%。（見表5）

表5 五指毛桃飲片中補骨脂素和佛手柑內酯的含量測定結果 （n=2）

2.6 特征圖譜

2.6.1 對照品溶液的制備 同“2.5.1”項下方法。

2.6.2 供試品溶液的制備 同“2.5.2”項下方法。

2.6.3 色譜條件 同“2.5.3”項下色譜條件。

2.6.4 方法學考察 （1）精密度試驗：按“2.5.2”項下方法制備五指毛桃飲片（WT15）的供試品溶液，按“2.5.3”項下條件分別連續進樣6次，記錄峰面積。以4號峰為參照，求得11個共有峰相對保留時間、相對峰面積的RSD值均＜3%，說明儀器的精密度良好。

（2）重復性試驗：按“2.5.2”項下方法平行制備五指毛桃飲片（WT15）的供試品溶液6份，按“2.5.3”項下條件依次進樣，記錄峰面積。以4號峰為參照，求得11個共有峰相對保留時間、相對峰面積的RSD值均＜3%，說明該方法重復性良好。

（3）穩定性試驗：按“2.5.2”項下方法制備五指毛桃飲片（WT15）的供試品溶液，按“2.5.3”項下條件分別于0、2、8、12、18、24 h進樣，記錄峰面積。以4號峰為參照，求得11個共有峰相對保留時間、相對峰面積的RSD值均＜3%，說明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.6.5 特征圖譜的建立與共有峰的指認 按“2.5.2”項下方法制備29批五指毛桃飲片的供試品溶液，按“2.5.3”項下條件進樣，記錄色譜圖。將色譜圖導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012年版）》，以WT15色譜圖為參照，采用多點校正，以中位數法分別建立五指毛桃飲片的疊加圖譜和對照圖譜，共確定11個共有峰，通過與對照品溶液比對，指認4號、5號共有峰分別為補骨脂素和佛手柑內酯。（見圖5）

圖5 五指毛桃飲片的HPLC 疊加特征圖譜（A）、對照特征圖譜（B）和對照品溶液（C）的HPLC 圖

2.6.6 相似度評價 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012年版）》對29批樣品進行相似度評價。結果表明，29批樣品的相似度在0.917~0.998之間，說明29批樣品與對照特征圖譜相似度較高。（見表6）

表6 五指毛桃飲片特征圖譜相似度結果

3 討論

3.1 指標性成分 現代研究表明，五指毛桃含有多種化學成分[4,9]。其中以補骨脂素、佛手柑內酯為代表的苯丙素類成分備受學者關注，是評價五指毛桃質量的常見指標性成分[23-24]。此外，補骨脂素可測性好，能夠以原型入血，且具有保肝作用[9]；佛手柑內酯的抗衰老、抗炎作用與五指毛桃的藥理作用一致[25-27]。故本研究將補骨脂素和佛手苷內酯作為五指毛桃飲片含量測定的指標性成分。

3.2 薄層色譜 本研究采用超聲提取法分別考察了不同溶劑（甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚）對五指毛桃飲片展開效果的影響，結果發現甲醇、乙醇、乙醚作為提取溶劑對薄層斑點數量、斑點大小的影響差異不大。鑒于乙醚是管制溶劑，乙醇較甲醇經濟、安全，故選用乙醇作為制備薄層色譜供試品的溶劑。本研究比較了正己烷-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（體積比為20：0.4：0.5：0.7）[16]、正己烷-乙酸乙酯（體積比為4：1）[8]和環己烷-乙酸乙酯（5：2，V/V）[23]對供試品的展開效果，結果發現以正己烷-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（體積比為20：0.4：0.5：0.7）為展開劑時，供試品展開后的斑點更加清晰，故選其作為展開劑。

3.3 浸出物 中藥飲片質量標準的制定應以臨床應用為導向，建立并完善符合中醫藥特點的質量標準體系[28]。湯劑以水為溶媒，是我國傳統醫學中應用最早，也是目前中醫臨床中使用最廣泛的劑型[29]，故本研究測定五指毛桃飲片的水溶性浸出物。

3.4 含量測定

3.4.1 HPLC條件 本研究在確定HPLC流動相時，分別對有機相（甲醇、乙腈）和水相（水及不同比例的甲酸水、乙酸水、磷酸水）進行優選。結果發現，相較于甲醇，乙腈出峰多而雜，且分離難度大，故選擇甲醇為有機相；磷酸水作為水相時，分離效果明顯優于其他水相，且0.1%的磷酸水與0.2%的磷酸水對各峰分離效果無明顯差異，故最終選定甲醇、0.1%的磷酸水為HPLC的流動相。

3.4.2 供試品的制備 本研究首先考察了提取方法（超聲提取、回流提取）、提取溶劑（甲醇、乙醇）對HPLC圖的影響，結果發現甲醇的提取效果優于乙醇，且超聲提取法和回流提取法對色譜峰的數量及峰面積的影響無明顯差異。鑒于超聲提取法操作簡便，故本研究采用甲醇超聲法制備供試品。本研究繼而對甲醇濃度（50%、75%、100%）、提取時間（30、40、50、60 min）、料液比（20、50、100倍）、提取次數（1、2次）進行考察，結果發現高濃度甲醇比低濃度甲醇提取效果好，提取40 min后色譜峰數量及峰面積無明顯變化，50倍與100倍料液比、提取1次和提取2次的提取效果均無明顯差異。鑒于此，本研究最終選定供試品的制備方法為50倍量甲醇超聲提取40 min。由于供試品直接進樣，濃度偏低，故本研究采用濃縮、再復溶的方式對樣品進行處理（具體見“2.5.2”項下內容）。

3.5 特征圖譜 中藥是多成分、多靶點共同發揮藥效的復雜整體，單一指標或幾個指標的檢測不能全面反映飲片的質量。特征/指紋圖譜將中藥整體成分以一張圖譜的形式直觀地展現出來，具有信息量大、特征性強、整體性和模糊性的特點，特別適合中藥質量的整體性評價[30]。本研究建立了五指毛桃飲片的HPLC特征圖譜，確定了11個共有峰，為五指毛桃飲片的整體質量控制提供了參考。

3.6 現有標準與本研究制定標準的比較 五指毛桃曾被1977年版《中華人民共和國藥典》（一部）收載[13]，但其飲片的質量標準卻未曾記載。本研究制定的五指毛桃飲片質量標準與其現有標準相比（見表7），完善了質控指標，提高了質量標準。對于五指毛桃飲片的顯微鑒別，增加了淀粉粒的鑒別要求；優化了薄層色譜供試品的制備方法，用乙醇替代了管制溶劑乙醚；相較于廣東飲片炮制規范，提高了五指毛桃飲片水分、酸不容性灰分的質量標準；以中醫臨床應用為導向，制定了五指毛桃飲片水溶性浸出物的質量標準；新增了五指毛桃飲片的特征圖譜鑒定方法及其含量測定要求，從整體化學成分定性與指標性成分定量相結合的角度進一步完善了五指毛桃飲片的質量標準。

表7 制定的五指毛桃飲片標準與現有標準的比較

綜上所述，本研究以不同產地的29批五指毛桃飲片為研究對象，對其各項質控指標進行考察，完善了五指毛桃飲片的質量標準，為其質量的控制和評價提供了參考。