基于網絡藥理學和分子對接探討姜黃、郁金藥對治療肝癌的作用機制*

唐芳婷，王 紅，張 靚，唐 萍，李躍軍

（1.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫藥大學附屬省直中醫醫院，湖南 株洲 412000）

原發性肝細胞性肝癌（以下簡稱“肝癌”）是指原發于肝細胞或肝內膽管的惡性腫瘤，是肝癌的主要組織學類型，占總病例數的90%左右[1-2]。肝癌是癌癥死亡的第三大主要原因[3]。全球發病率最高的地區是亞洲和非洲，其中我國是肝病大國。肝癌起病隱匿，早期癥狀不明顯，出現癥狀時往往已經屬于中晚期。這個時期治療方式主要以化療栓塞、局部消融、放療、全身化療、靶向治療、免疫治療等為主[4]。單一的治療方式療效有限，且存在一定的局限性，如不良反應多、易產生耐藥性、患者經濟負擔重等。須整合多學科優勢，進一步提高臨床療效，延長患者的生存時間。中醫藥在控制瘤體、減少毒副反應、延緩復發和轉移、改善臨床癥狀、提高生存質量、延長生存時間等方面具有一定的優勢。

肝癌的病機演變復雜，而肝失疏泄為病機演變的中心環節[4]。肝體陰而用陽，肝主疏泄，肝主藏血。肝疏泄正常，則血行暢達，而后能滋養臟腑[5]。然邪毒內侵，氣機郁滯，氣為血之帥，氣郁則血行瘀滯。《丹溪心法》言“氣血沖和，百病不生”。研究發現，郁金行氣作用強，姜黃祛瘀力強，故兩者合用可加強行氣祛瘀作用[6]。研究[7-8]發現，現代醫學聯合中醫藥治療肝癌具有更高的總生存率和無進展生存率，能提高患者的生活質量，減少腫瘤復發。中醫藥成方藥物繁雜，目前研究難以清晰地闡述姜黃、郁金藥對治療肝癌的作用機制，而網絡藥理學可以從多成分、多靶點、多途徑揭示藥物協同作用的機制。本研究通過網絡藥理學和分子對接的方法，探討姜黃、郁金治療肝癌的作用靶點及機制，旨在為篩選治療肝癌的藥物提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 姜黃和郁金有效成分篩選及靶點的獲取 在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺[9]（TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php）分別以“姜黃”“郁金”為關鍵詞進行檢索，以生物利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18為條件進行篩選[10]、整理，分別得到姜黃、郁金的有效成分和潛在靶點。將獲得的共同潛在靶點名稱在UniProt數據庫[11]（https://www.uniprot.org/）中限定條件“ Reviewed”“ Homo sapiens”，從而獲得靶點的官方名稱。

1.2 肝癌相關靶點的獲取 基于GeneCards[12]（https://www.genecards.org）、OMIM[13]（https://omim.org/）、PharmGKB[14]（https://www.pharmgkb.org/）、TTD[15]（https://db.idrblab.net/ttd/）、DrugBank[16]（https://www.drugbank.ca/）數據庫，以“ Liver cancer”“ Hepatocellular carcinoma”為關鍵詞進行檢索，整理獲得肝癌的靶點。

1.3 藥對作用于肝癌的靶點篩選 將“1.2”中獲得的對應靶點，去除重復靶點后，繪制韋恩圖，得到姜黃、郁金藥對干預肝癌的共同潛在靶點。

1.4 藥對-疾病-有效成分-靶點中藥復方調控網絡構建 借助Cytoscape 3.8.0[17]軟件進行可視化處理，構建藥對-疾病-有效成分-靶點中藥復方調控網絡。

1.5 蛋白相互作用網絡圖（protein-protein interaction，PPI）構建及核心靶點篩選 借助STRING數據庫[18]（http://cn.string-db.org/）查看基因之間是否存在蛋白互作關系，設置物種選擇為“ Homo sapiens”，交互分數>0.4，并去除單一蛋白，得到PPI網絡圖。在Cytoscape 3.8.0軟件中使用CytoNCA插件Centralities原則里的6個維度（BC、CC、DC、EC、LAC、NC）進行兩次打分過濾，將每個維度中大于中位值的核心靶點篩選出來。

1.6 藥物有效成分與疾病交集基因功能及通路的富集分析 利用R語言（Version 4.0.2）中的“ Bioconduct”包對有效成分和疾病交集基因進行GO和KEGG富集分析[19-21]，通過生物過程（biological process，BP）、細胞組成（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）3個模塊對基因功能進行分析。過濾條件：P值、Q值均≤0.05，輸出分析結果。

1.7 免疫細胞浸潤豐度分析 基于TIMER公開數據庫[22]（https://cistrome.shinyapps.io/timer/）Gene模塊，對姜黃、郁金核心靶點的表達水平和不同免疫細胞浸潤豐度之間的相關性進行分析，并獲取統計學P值。

1.8 核心靶點在腫瘤組織和癌旁組織的表達差異以及總生存期相關分析 基于GEPIA數據庫[23]Expression DIY模塊中的Boxplot及Survival模塊中的Survival Plots，通過TCGA數據庫中的肝癌樣本的表達譜，分析姜黃、郁金核心靶點在腫瘤組織和癌旁組織的表達差異及生存曲線相關分析（P≤0.05）。

1.9 分子對接

1.9.1 配體的篩選 將獲得的藥物活性成分網絡按照靶點數目活性成分最多的作為配體，從PubChem數據庫[24]（http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取配體對應的2D結構，使用ChemBio3D UItra 14.0軟件轉換為最小自由能的3D空間構象并進行結構優化。

1.9.2 靶點蛋白受體準備 選取PPI網絡中核心靶點作為受體，先從Uniprot數據庫中搜索靶點對應的蛋白名稱，然后從蛋白質數據庫（protein data bank，PDB）（http://www.rcsb.org/）中獲取該蛋白的三維結構，導入PyMOL 2.5.2軟件中去除水分子和小分子配體，使用AutoDockTools 1.5.7軟件對受體進行加氫并確定活性口袋，最后將準備好的配體與受體導入PyMOL 2.5.2軟件進行分子對接，獲得相互作用圖[25]。

2 結果

2.1 姜黃和郁金有效成分篩選結果 將姜黃和郁金這兩味中藥通過TCMSP數據庫共初篩出18個有效成分，其中姜黃有效成分3個，郁金有效成分15個；再將有效成分潛在的作用靶點通過篩選和收集，其中姜黃潛在靶點356個，郁金潛在靶點1 370個，繼續篩選得到姜黃有效成分對應的有效靶點41個，郁金有效成分對應的有效靶點78個。通過在Uniprot數據庫中限定條件“ Reviewed”“ Homo sapiens”以獲取最新的注釋文件，然后將基因全稱通過Strawberry Perl轉換為基因簡稱，最終通過篩選去重后得到姜黃有效靶點35個，郁金有效靶點66個。根據OB值列舉出姜黃和郁金的有效成分。（見表1）

表1 姜黃、郁金有效成分信息表

2.2 肝癌靶點的獲取 根據“1.2”的研究方法去除重復靶點后共獲得肝癌靶點14 187個，繪制韋恩圖，不同的顏色代表不同的數據庫，數字代表靶點數，重疊部分的數字代表各數據庫間重復靶點。（見圖1）

圖1 各個數據庫肝癌疾病靶點的交集韋恩圖

2.3 藥對-疾病作用靶點的交集 將藥對-疾病的作用靶點用R 4.0.2軟件選取交集并且繪制韋恩圖，獲得交集靶點70個，綠色圈代表姜黃、郁金的靶點，粉色圈代表肝癌的靶點，數字代表其對應部分的靶點數。（見圖2）

圖2 藥對靶點與疾病靶點的交集靶點韋恩圖

2.4 藥對-疾病-有效成分-靶點中藥復方調控網絡分析結果共有70個節點，98條邊，6個藥物有效成分，70個相關靶點。說明姜黃、郁金藥對治療肝癌是通過這6個有效成分和70個靶點發揮作用的。節點用3種不同顏色分別表示兩種藥物的有效成分和潛在靶點，藍色節點代表靶點，粉色節點為姜黃，紫色節點為郁金。節點的大小代表與基因相連的成分的數目，節點越大表示與該基因相關的成分越多，按照度值排序，排前3的有效成分是柚皮素、β-谷甾醇、豆甾醇。（見圖3）

圖3 姜黃、郁金有效成分與肝癌靶基因的網絡關系圖

2.5 PPI網絡圖構建及核心靶點篩選結果 圖中顯示的是蛋白互作關系，節點表示蛋白質，節點中間是已知的該蛋白的3D結構，連線表示功能關系，連線的粗細程度反映置信度高低。（見圖4）

圖4 姜黃、郁金與肝癌交集靶點PPI 網絡核心圖

將PPI網絡圖導入Cytoscape 3.8.0軟件，按CytoNCA插件中的6個維度進行評分，經過中位值過濾后最終獲得7個核心靶點，即ESR1、CASP3、PTGS2、JUN、AKT1、MAPK3、CAT。（見圖5）

圖5 PPI 核心靶點篩選流程

2.6 藥物成分-疾病交集基因功能及通路的富集分析

2.6.1 GO富集分析結果 將姜黃、郁金治療肝癌的作用靶點進行GO注釋及KEGG通路富集分析。結果顯示：GO注釋中，與生物過程（biological process，BP）相關的條目共有1485個，與細胞組分（cellular component，CC）相關的條目共有87個，與分子功能（molecular function，MF）相關的條目共有133個。分別選取前10個富集最相關的條目生成條形圖。結果表明姜黃、郁金藥對治療肝癌作用涉及多個生物途徑和通路。其中BP主要涉及細胞對營養水平的反應、細胞對藥物的反應、細胞對有機羥基化合物運輸、細胞對類固醇激素的反應、細胞對膜電位調節、細胞對金屬離子的響應等方面；CC主要涉及膜筏、膜微域、膜區等方面；MF主要涉及與酰胺結合、與藥物結合、與磷酸酶結合、G蛋白-偶聯胺受體活性等方面。圖中橫坐標表示富集數目，縱坐標表示富集的條目。（見圖6）

圖6 姜黃、郁金治療肝癌靶基因的GO 富集分析條形圖

2.6.2 KEGG富集分析結果 如圖所示，對70個核心靶點進行KEGG通路富集分析后（P≤0.05）的通路共有163個，排序篩選出前20條通路。橫坐標代表富集到此通路的基因數目，顏色代表q值，從藍色到紅色，表示q從小到大，富集越來越顯著。結果顯示姜黃、郁金藥對治療肝癌的機制涉及雌激素信號通路、甲狀腺激素信號通路、cAMP信號通路、VEGF信號通路、脂質和動脈粥樣硬化、人類免疫缺陷病毒1型感染、乙型肝炎、丙型肝炎等。圖中橫坐標表示富集的數目，縱坐標表示富集的通路類別。（見圖7）圖中紅色表示姜黃、郁金對肝癌作用的靶基因。（見圖8）

圖7 姜黃、郁金治療肝癌靶基因的KEGG 通路分析條形圖

圖8 肝癌信號轉導通路

2.7 有效成分與關鍵靶點的分子對接 通過以上結果分析顯示，柚皮素是預測靶點最多的有效成分，MAPK3、CASP3、JUN、AKT1、CAT、ESR1、PTGS2是PPI網絡中的核心靶點，并且藥對-疾病-有效成分-靶點中藥復方調控網絡分析結果顯示柚皮素與MAPK3、CASP3、AKT1、CAT、ESR1、PTGS2存在相互作用關系。因此，為進一步研究其分子層面的相互作用位點，選取柚皮素與MAPK3、CASP3、AKT1、CAT、ESR1、PTGS2分別作為分子對接的配體和受體。結果顯示，配體和受體對接結合能越低表示分子間結合越穩固，交互作用可能性越高。（見表2）分子對接結果顯示，柚皮素能分別穩定地對接到MAPK3、CASP3、AKT1、CAT、ESR1、PTGS2的活性口袋中。（見圖9）

圖9 柚皮素與關鍵靶點分子對接作用關系圖

表2 柚皮素與關鍵靶點對接結合能 （kcal/moL）

2.8 關鍵靶點與免疫細胞浸潤豐度相關性分析 本研究基于Timer數據庫，通過對肝癌樣本的表達譜進行分析，對關鍵靶點MAPK3、CASP3、AKT1、CAT、ESR1、PTGS2的表達水平和不同免疫細胞浸潤豐度之間的相關性進行分析。結果表明，MAPK3、CASP3、AKT1、CAT、ESR1和PTGS2的表達水平至少與兩種免疫細胞浸潤豐度相關（P≤0.05），如MAPK3、CASP3、AKT1的表達水平與B細胞、CD8+T細胞、CD4+T細胞、巨噬細胞、嗜中性粒細胞、樹突狀細胞等免疫浸潤相關；PTGS2的表達水平與肝癌腫瘤純度、B細胞、CD8+T細胞、CD4+T細胞、巨噬細胞、嗜中性粒細胞、樹突狀細胞等相關；CAT的表達水平與肝癌腫瘤純度、B細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞等相關；ESR1的表達水平與肝癌腫瘤純度、B細胞、巨噬細胞等相關。（見圖10）

圖10 關鍵靶點表達水平與免疫細胞浸潤的相關性

2.9 核心靶點在腫瘤組織和癌旁組織的表達差異分析 基于GEPIA數據庫，通過TCGA數據庫中的肝癌樣本的表達譜，對關鍵靶點在腫瘤組織和癌旁組織的表達差異分析。結果表明，MAPK3在腫瘤組織中的表達高于癌旁組織，提示該基因為癌基因；ESR1在腫瘤組織中的表達低于癌旁組織，提示該基因為抑癌基因。（見圖11）

圖11 關鍵靶點在腫瘤組織和癌旁組織中的表達差異

2.10 核心靶點與肝癌患者總生存期相關分析 基于GEPIA數據庫，通過對TCGA數據庫中的肝癌腫瘤樣本的表達譜進行分析。結果顯示，MAPK3、CAT、ESR1的表達與肝癌患者的總生存期相關（P≤0.05）。MAPK3表達水平高者，預后相對較差；CAT、ESR1表達水平高者，預后相對較好。結合差異表達結果提示MAPK3為癌基因，ESR1為抑癌基因，結果與上文相符。（見圖12）

圖12 關鍵靶點表達水平在肝癌患者總生存期中的預后價值

3 討論

肝癌在中醫學中屬于“肝積”“癥瘕”“積聚”“鼓脹”“黃疸”“痞氣”“癖黃”等范疇，肝失疏泄為病機演變的中心環節。肝失疏泄則氣血運行不暢，導致氣滯、血瘀，從而出現脅痛、脅腹積塊等癥狀[4]。姜黃、郁金均可化瘀血、消食積、去腫痛，且有行氣止痛的功效。作為常用的活血化瘀藥，姜黃、郁金多用于氣血瘀滯所致癥瘕痞塊、胸脅刺痛、經閉腹痛等癥狀。現代藥理研究[26-29]表明，姜黃、郁金不僅能抑制腫瘤生長，誘導細胞凋亡，緩解藥物性肝損傷，還能通過作用于AKT1等關鍵靶點阻止肝纖維化，調控信號通路，逆轉化療耐藥性，從而改善肝癌患者肝功能，保護肝臟，降低損害，提高免疫力。

本研究借助網絡藥理學相關研究方法，分析姜黃、郁金藥對治療肝癌作用靶點。結果顯示柚皮素、β-谷甾醇、豆甾醇等是姜黃、郁金治療肝癌的有效成分。研究[30]表明，柚皮素可上調肝癌細胞中的ULBP1、ULBP3等NKG2DL的表達，促進NK細胞的增殖，增加NK細胞對肝癌細胞的殺傷活性，從而達到抗腫瘤作用。β-谷甾醇可以通過PI3K/AKT途徑下調細胞凋亡基因的表達，誘導細胞凋亡，并可以減緩酒精性肝損傷[31-32]。豆甾醇可以通過PI3K/AKT/mTOR和TGFβ/S信號通路促使細胞凋亡，抑制肝癌細胞的增殖和轉移[33]。

富集分析結果提示，姜黃、郁金藥對治療肝癌通過雌激素信號通路、VEGF信號通路發揮抗腫瘤作用。研究[34-35]表明，雌激素通過新的雌激素受體Erα-36和雌激素相關受體γ（ERRγ）介導對肝癌的促進作用，而姜黃素可以通過下調雌激素生成代謝酶，從而改善體內高雌激素狀態。研究[36]證實，VEGFR2/AKT/mTOR通路的失活可以抑制腫瘤的進展，減少腫瘤免疫逃逸。姜黃素可以抑制血管生成，降低VEGF的表達[37]。

基于TCGA臨床病例的分析結果，姜黃、郁金抗腫瘤關鍵靶點MAPK3在腫瘤組織中的表達高于癌旁組織，ESR1在腫瘤組織中的表達低于癌旁組織。且MAPK3表達水平高者，生存預后相對較差；ESR1表達水平高者，生存預后相對較好。結果提示MAPK3為癌基因，ESR1為抑癌基因。且分子對接結果提示，姜黃、郁金有效成分柚皮素與相應靶點MAPK3和ESR1有結合潛能。研究結果表明，姜黃、郁金藥對可通過調控相關靶點影響腫瘤患者預后，對相關臨床研究分析具有潛在價值。

姜黃、郁金藥對可能通過調控CASP3、AKT1和CAT等靶點發揮抗腫瘤作用。CASP3可抗細胞凋亡[38]并調節血管生成。AKT激酶可調節細胞增殖與存活等過程，參與腫瘤侵襲、轉移和血管生成等重要過程[39-40]。CAT是構成氨基酸代謝的核心機制，能滿足癌細胞的代謝要求，并且有助于癌細胞適應機體的缺氧微環境[41]。

綜上所述，姜黃、郁金藥對可通過多成分、多途徑、多靶點協同發揮治療肝癌的作用，且能通過調控相關靶點影響腫瘤患者預后，為進一步的實驗和相關臨床研究提供了新的思路。