52份枇杷種質資源遺傳多樣性分析與DNA指紋圖譜構建

趙 科, 孫淑霞, 李 靖, 涂美艷, 王玲利, 何成勇, 徐子鴻, 江國良, 宋海巖, 陳 棟

(1.四川省農業科學院園藝研究所,成都 610066;2.農業農村部西南地區園藝作物生物學與種質創制重點實驗室,成都 610066)

【研究意義】四川大渡河流域是普通枇杷(EriobotryajaponicaL.)的發源地,枇杷栽培歷史悠久,種質資源豐富。近年來,隨著實生選種[1]、芽變選種[2]和雜交育種[3-4]工作的快速發展[5],生產中枇杷新品種明顯增多,研發快速準確的種質資源鑒定方法對枇杷產業的良性發展具有重要意義。前人基于表型和地理分布的枇杷種質資源鑒定和分類方式容易受栽培條件和生態環境等因素影響[6-7],而基于DNA序列差異開發的分子標記檢測技術具有準確度高、檢測高效和操作簡便等優勢[8],為研究植物表型與基因型之間的聯系提供了可靠工具?！厩叭搜芯窟M展】微衛星或簡單序列重復(SSR)標記因具有共顯性遺傳、重現性、相對豐度、廣泛的基因組覆蓋、染色體特定位置和高通量基因分型等優勢,在種質資源鑒定領域廣泛應用[9]。近年來,育種家們圍繞枇杷種質資源鑒定、倍性和果肉顏色等方面開發了系列分子標記。孫鈞等[10]利用genic-SSR引物對14份白沙枇杷地方種質資源進行鑒定,并與現有白沙枇杷地方品種建立品種鑒定圖(CID),為地方白肉枇杷種質資源的鑒定與產業化利用提供了依據;基于非整倍體材料基因劑量的不平衡效應,溫國[11]從枇杷基因組中開發出17個連鎖群的特異性非多態SSR標記,并結合qPCR技術準確檢測染色體的非整倍性;宋海巖等[12]基于不同果肉顏色枇杷EjPSY2A基因的序列差異開發出2對InDel分子標記,準確鑒別黃肉和白肉枇杷種質資源及其EjPSY2A位點的顯隱性,對指導白肉枇杷早齡選擇育種具有重要意義。但由于枇杷基因組數據公布較晚[13-14],許多與分子標記緊密連鎖的功能基因或片段未能被鑒定。DNA指紋圖譜技術是對不同種質資源基因組DNA序列的組成和長度進行識別,獲得其特有的圖紋組成[15],在種質資源鑒定和功能基因定位等方面應用廣泛[16]。目前已在枇杷中用于DNA指紋圖譜構建和遺傳多樣性分析的分子標記有SSR[17]、ISSR[18]和SCoT[19]等。EST-SSR是基于轉錄組數據中表達序列標簽(EST)集合開發的SSR標記,其開發成本低,功能基因識別率高,具備更高的使用價值[20-21],但目前關于枇杷EST-SSR標記開發和應用卻鮮有報道。【本研究切入點】國家西南特色園藝作物種質資源圃(成都)現保存有國內外枇杷屬種質資源200余份,是西南地區保存枇杷種質資源數量最多的綜合性園藝作物種質資源圃。本研究利用國家西南特色園藝作物種質資源圃(成都)枇杷育種與栽培創新團隊前期從黃肉洞庭枇杷及其白肉突變體果實發育期轉錄組數據中開發出的覆蓋全基因組的277對EST-SSR標記和1對果肉顏色相關Indel標記[12, 22],對資源圃內近年來收集保存的52份國內外種質和本團隊創制的雜交后代開展遺傳多樣性分析并構建DNA指紋圖譜?！緮M解決的關鍵問題】豐富枇杷種質資源鑒定的分子標記,為枇杷種質資源鑒定和功能基因發掘提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料與試驗地點

以國家西南特色園藝作物種質資源圃(成都)枇杷育種與栽培創新團隊(104°18′47″ E,30°37′09″ N,海拔489 m)保存的52份國內外枇杷種質資源及創制的雜交后代為試材,其中21份為我國枇杷主產區的主栽品種,4份為國外收集的枇杷品種資源,1份為野生枇杷資源(表1),所有種質資源為8～10年生,株行距4 m×5 m,常規栽培管理措施。2021年5月收集枇杷幼嫩葉片用于DNA提取以及后續的基因分型工作。

表1 供試材料Table 1 Tested materials

1.2 枇杷DNA提取和PCR擴增

根據國家西南特色園藝作物種質資源圃(成都)前期開發的覆蓋全基因組的277對EST-SSR標記和1對果肉顏色相關Indel分子標記設計并合成引物。用改良CTAB法提取枇杷gDNA,用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測‘大五星’‘艷紅’‘白沙’‘新白8號’4個主栽品種的分子標記多態性,用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳將篩選出條帶清晰、多態性良好的引物對52份枇杷種質資源中進一步驗證。PCR反應體系:1.0 μL DNA模板,12.5 μL 2×PCR Mix(擎科),1.0 μL 10 μmol/L正反向引物,加ddH2O至25.0 μL。PCR擴增程序:94 ℃預變性4 min;95 ℃變性1 min,55 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min,循環35次;72 ℃徹底延伸10 min。

1.3 數據分析

根據擴增數據建立原始矩陣,應用NTSYSpc 2.20v軟件計算Dice相似系數,根據各種質資源間的相似系數得到聚類分析圖。以數字代表引物,字母代表不同帶型,對不同引物擴增出的帶型記錄編號。使用WPS軟件將每份枇杷種質資源指紋圖譜上的數字或字母生成不同色塊,每一個色塊表示該枇杷種質資源對應引物擴增出的基因型,豎條表示該枇杷種質資源的指紋圖譜,橫條表示該引物擴增的全部基因型。

2 結果與分析

2.1 枇杷種質資源多態性引物篩選

利用‘大五星’‘艷紅’‘白沙’和‘新白8號’等4份材料,從278對引物中初步篩選出12對帶型清晰、穩定性和重復性好的引物,占4.32%,部分引物擴增效果如圖1所示,引物信息如表2所示。隨后將12對引物擴大到52份枇杷種質資源中篩選出擴增帶型穩定并且不同樣品之間具有明顯差異的9對引物,分別為Ej77、Ej79、Ej85、Ej90、Ej115、Ej168、Ej171、Ej187和PSY2A-2。利用這9對引物對52份枇杷種質資源擴增,共獲得765個條帶,每對引物擴增條帶數為2～5個,平均85個;多態性條帶比率為40.00%～100.00%,平均71.55%;多態性信息含量(PIC)為0.250～0.999,平均0.685,有7對引物的PIC大于0.550,可以用于后續聚類分析和DNA指紋圖譜的構建。

表2 篩選出的12對可用于構建指紋圖譜的分子標記Table 2 12 pairs of molecular markers screened for use in constructing fingerprints

2.2 枇杷種質資源聚類分析

52份枇杷種質資源的平均遺傳相似系數為0.791(圖2);在相似系數D1=0.668處,可以將52份枇杷種質資源分為2類,第Ⅰ類為2份西班牙種質資源(‘培優’和‘烏里拉’),遺傳相似系數為0.833,第Ⅱ類為剩余的50份枇杷種質資源。在相似系數D2=0.756處,可以將第Ⅰ類進一步劃分為3類,第ⅰ類為育成品種(包括‘艷紅’等)和創制的雜交后代(包括CB2-26等),共計38份種質資源;第ⅱ類包括櫟葉枇杷和CB4-14等7份種質資源;第ⅲ類包括‘早鐘6號’和W-4XC等5份種質資源,其中2份日本枇杷種質資源‘茂木’和日本紅肉的遺傳相似系數最大(0.977)。在相似系數D3=0.794處,可以將第ⅰ類種質細分為3類,第1類為育成品種(包括‘艷紅’等)和創制的雜交后代(包括CB2-26等),共計19份黃肉枇杷種質資源;第2類為‘大五星’、TBY(洞庭枇杷)、‘黃蜜’和‘大白梨’4份種質資源,這4份種質資源既有黃肉又有白肉類型,可能是栽培中較早出現果肉顏色分化的種質資源;第3類為‘香種11號’‘新白7號’‘西蜀3號’‘新白8號’‘香妃’‘貴妃’‘白早鐘7號’‘軟條白沙’‘陽光白’‘冠玉’‘TBW’‘內江白’‘78-1’和‘白早鐘5號’等14份白肉枇杷種質資源。果肉顏色一致或地理分布相近的枇杷種質資源被聚類到相近的分類單元中,可以準確將西班牙、日本與其他種質資源進行區分。此外,聚類分析結果表明西南特色園藝作物種質資源圃(成都)內現保存的枇杷種質資源遺傳多樣性豐富,但利用‘艷紅’‘黃豐’等創制的雜交后代之間遺傳相似系數較高。

圖2 52份枇杷種質資源的聚類分析Fig.2 Cluster analysis of 52 loquat germplasm resources

2.3 枇杷種質資源DNA指紋圖譜

將引物Ej77、Ej79、Ej85、Ej90、Ej115、Ej168、Ej171、Ej187和PSY2A-2分別命名為1、2、3、4、5、6、7、8和9號,根據帶紋遷移率不同進行分組,組內的不同帶紋以字母表示,缺失記為D。以8號引物Ej187為例(圖3),1、2、3號樣品分別讀作8A、8A和8AB。將每份種質資源的9對引物擴增帶型用上述方法記錄,構成指紋圖譜(表3)和色塊矩陣(圖4),24份枇杷種質資源可以通過指紋圖譜區分,其中Ej90和Ej171可以特異性鑒別櫟葉枇杷和‘茂木’。

1～52的材料名稱見表1。1-52 meaning material names are the same as table 1.圖3 8號引物Ej187的擴增結果Fig.3 Amplification results of primer No.8 Ej187

橫軸為種質資源名稱(同表1);縱軸為引物名稱;1.Ej77;2.Ej79;3.Ej85;4.Ej90;5.Ej115;6.Ej168;7.Ej171;8.Ej187;9.PSY2A-2。 The horizontal axis is the name of germplasm resources(the same as table 1); The longitudinal axis is the primer name;1.Ej77; 2.Ej79; 3.Ej85; 4.Ej90; 5.Ej115; 6.Ej168; 7.Ej171; 8.Ej187; 9.PSY2A-2.圖4 52份枇杷種質資源的DNA指紋圖譜色塊矩陣Fig.4 Color block matrix of DNA fingerprints of 52 loquat germplasm resources

表3 52份枇杷種質資源的數字DNA指紋圖譜Table 3 Digital DNA fingerprints of 52 loquat germplasm resources

3 討 論

DNA多態性是單一基因座等位基因變異性在群體水平的體現[23-24]。胡經煌[25]利用構建的群體開發多態性分子標記,發現1個新的抗白粉病基因Pm61。本研究篩選出擴增帶型穩定且不同品種之間具有明顯差異的9對引物。其中,Ej85是基于絲氨酸/蘇氨酸激酶基因Sapk1的表達序列標簽開發的分子標記,在櫟葉枇杷等13份種質資源中出現了不同的帶型,該基因在水稻[26]和黑麥草[27]等作物中被證實與抗逆性密切相關,表明不同枇杷種質資源中Sapk1基因可能存在不同等位基因并導致抗逆性差異。

聚類分析結果可以為枇杷種質資源的鑒定及核心種質篩選提供依據,平均遺傳相似系數越低表明樣本間的遺傳多樣性越豐富,樣本間遺傳相似系數越高親緣關系則越近[28-29]。范付華等[30-31]采用ISSR標記構建了39份貴州野生枇杷種質資源的指紋圖譜,供試材料的遺傳相似性系數為0.40～0.98,在相似系數為0.70時,可將供試材料分成五大類。胡文舜等[32]采用SSR標記構建了19份枇杷雜交新品種的指紋圖譜,供試材料的遺傳相似性系數為0.728～0.969,平均相似系數為0.852。本研究中,保存于國家西南特色園藝作物種質資源圃(成都)的52份枇杷種質資源的相似系數為0.462～1.000,平均相似系數(0.791)介于野生枇杷種質資源和育成品種之間,表明資源圃內現保存的西南地區枇杷種質資源遺傳多樣性豐富。但利用‘艷紅’和‘黃豐’等創制的雜交后代之間的平均遺傳相似系數分別為0.986和1.000,今后還需要繼續引進和收集國內外不同產區的枇杷種質資源豐富其遺傳背景。

本研究還將指紋圖譜進行數字化和圖像化處理,其中24份枇杷種質資源具備特異性DNA指紋圖譜,其余材料出現重復,這可能是由于本研究僅選擇EST-SSR分子標記且部分種質資源親緣關系較近。胡文舜等[32]利用6對枇杷EST-SSR引物、6對枇杷gSSR引物、6對蘋果gSSR引物和1對梨gSSR引物構建24個枇杷品種的SSR指紋圖譜,整合不同分子標記的鑒定結果后19個枇杷雜交新品種可以明確地相互區分。

4 結 論

52份枇杷種質資源的平均相似系數(0.791)介于野生枇杷種質資源和育成品種之間,表明西南地區枇杷種質資源具有豐富的遺傳多樣性。聚類分析結果顯示,果肉顏色一致或地理分布相近的枇杷種質資源被聚類到相近的分類單元,該結果可以準確地將西班牙、日本枇杷種質資源與其他種質進行區分。本研究豐富了枇杷種質資源鑒定的分子標記,為今后發掘分子標記緊密連鎖的功能基因或片段提供了研究基礎。