曬田環(huán)境脅迫對(duì)克氏原螯蝦卵巢組織、卵黃蛋白原及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝的影響

袁 暢,李 蔚,黃玉英,何蘋(píng)萍,鄭玉斯,李 鑫,盧智發(fā),張圣杰,李文紅 , 彭金霞,王大鵬

(1.廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院/廣西水產(chǎn)遺傳育種與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南寧 530021;2.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,南寧 530004)

【研究意義】克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)又稱(chēng)小龍蝦,原產(chǎn)于北美洲,最早于1929年由日本傳入中國(guó)南京,已成為重要養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)蝦類(lèi)[1],但目前面臨苗種繁育能力低、品質(zhì)退化、提質(zhì)增效空間受限等問(wèn)題[2]。曬田通過(guò)環(huán)境脅迫影響生物生長(zhǎng)、繁殖、儲(chǔ)存等活動(dòng)的能量最佳分配[3],近年來(lái)在生產(chǎn)上使用較多,但目前該技術(shù)尚未標(biāo)準(zhǔn)化,曬田起始時(shí)間和曬田時(shí)長(zhǎng)主要依靠生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)。因此,了解曬田環(huán)境脅迫后的克氏原螯蝦卵巢組織學(xué)特點(diǎn)與體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)相關(guān)調(diào)節(jié)機(jī)制,可為生產(chǎn)操作的改進(jìn)提供參考依據(jù)。【前人研究進(jìn)展】目前對(duì)于克氏原螯蝦卵巢發(fā)育階段的研究較多,根據(jù)顏色和組織學(xué)特點(diǎn),國(guó)內(nèi)學(xué)者主要將卵巢發(fā)育分為7個(gè)(未發(fā)育期、發(fā)育早期、卵黃發(fā)生前期、卵黃發(fā)生期、成熟期、產(chǎn)卵后期和恢復(fù)期)[4]、6個(gè)(I期、II期、III期、IV期、V期和VI期)[5]、5個(gè)(卵黃發(fā)生前期、卵黃發(fā)生初期、卵黃發(fā)生中期、成熟期和產(chǎn)后恢復(fù)期)[6]或4個(gè)(卵黃發(fā)生前階段、早期卵黃發(fā)生階段、中期卵黃發(fā)生階段和成熟階段)[1]階段。卵黃積累是甲殼類(lèi)動(dòng)物卵母細(xì)胞發(fā)育成熟的必要前提,促使卵巢產(chǎn)生變化,進(jìn)入下一個(gè)發(fā)育階段[7]。卵黃發(fā)生可為卵母細(xì)胞生長(zhǎng)及胚胎發(fā)育供給所需的氨基酸、脂、鈣和能量等營(yíng)養(yǎng)和功能性物質(zhì),對(duì)生殖至關(guān)重要[8]。蝦蟹類(lèi)動(dòng)物胚胎以及開(kāi)口前仔體都屬于卵黃營(yíng)養(yǎng),作為卵黃主要成分,卵黃蛋白對(duì)維持早期蝦類(lèi)生命具有關(guān)鍵作用[9]。卵黃蛋白原是卵黃蛋白主要成分卵黃磷蛋白的前體,對(duì)于卵母細(xì)胞發(fā)育成熟具有重要意義[10]。不同環(huán)境脅迫下甲殼動(dòng)物體內(nèi)卵黃蛋白原濃度或mRNA水平存在差異。在鹽度脅迫脊尾白蝦(Exopalaemoncarinicauda)中,卵黃蛋白原濃度隨著鹽度升高呈先上升后下降趨勢(shì)[11];在農(nóng)藥阿特拉津脅迫克氏原螯蝦中,卵黃蛋白原濃度及mRNA水平隨阿特拉津濃度升高而下降[12];在重金屬鎘脅迫淡水蟹(Sinopotamonhenanense)中,卵黃蛋白原濃度及mRNA水平隨鎘濃度增加而下降[13];在4-壬基酚脅迫貽貝(Mytilusgalloprovincialis)和螃蟹(Carcinusaestuarii)中,卵黃蛋白原濃度隨著4-壬基酚濃度增加而上升[14]。卵黃蛋白原被稱(chēng)為卵巢發(fā)育的生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)物,但評(píng)價(jià)卵巢發(fā)育僅卵黃蛋白原這一個(gè)指標(biāo)并不充分。營(yíng)養(yǎng)代謝水平與卵巢發(fā)育相輔相成,也是評(píng)價(jià)水產(chǎn)動(dòng)物生長(zhǎng)與繁殖的重要指標(biāo),受環(huán)境脅迫影響會(huì)發(fā)生相應(yīng)變化。如高溫脅迫下,三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)血藍(lán)蛋白(Hem)含量低于低溫脅迫[15];凡納濱對(duì)蝦(LitopenaeusVannamei)在急冷與空氣暴露聯(lián)合脅迫下,隨著脅迫時(shí)間延長(zhǎng),乳酸(LA)和葡萄糖(Glu)均呈先上升后下降趨勢(shì)[16]。【本研究切入點(diǎn)】已有研究表明曬田環(huán)境脅迫可促熟克氏原螯蝦卵巢[17],但曬田脅迫期間的卵巢組織學(xué)特點(diǎn)及促使卵巢發(fā)育的卵黃蛋白原和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝相關(guān)情況尚未見(jiàn)報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】對(duì)比分析克氏原螯蝦在曬田環(huán)境脅迫期間的卵巢組織學(xué)特征、卵黃蛋白原和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝的變化過(guò)程,進(jìn)一步探索其變化機(jī)制,為曬田環(huán)境脅迫促進(jìn)克氏原螯蝦卵巢成熟這一生產(chǎn)操作的改良和標(biāo)準(zhǔn)化提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試克氏原螯蝦采自廣西來(lái)賓市興賓區(qū)的一個(gè)稻蝦養(yǎng)殖場(chǎng)。試驗(yàn)使用2個(gè)池塘,即曬田池塘和對(duì)照池塘。曬田池塘將池塘田面(300 m2)用塑料圍子和鐵管?chē)?防止逃逸,池內(nèi)所有試驗(yàn)蝦為曬田組。對(duì)照池塘不需要改造,池內(nèi)所有試驗(yàn)蝦為對(duì)照組。曬田池塘中克氏原螯蝦為穴居,在曬田脅迫開(kāi)始1～2 d內(nèi)掘穴,用刨出的泥土將洞口封住,在洞內(nèi)晝夜棲居。對(duì)照池塘中克氏原螯蝦白天在環(huán)溝底部隨機(jī)爬行或隱蔽,光照條件適宜時(shí)覓食。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 于2022年9月將2個(gè)池塘田面上水30～40 cm,分別選取50 kg克氏原螯蝦投至2個(gè)池塘田面,持續(xù)1周,正常養(yǎng)殖投喂。克氏原螯蝦雌雄比1∶1;2個(gè)池塘中隨機(jī)挑選30只蝦進(jìn)行測(cè)量與解剖,曬田池塘中克氏原螯蝦平均規(guī)格為(24.61±6.36)g,對(duì)照池塘中克氏原螯蝦平均規(guī)格為(23.56±5.67)g,二者規(guī)格接近。雌性克氏原螯蝦卵巢I期、II期、III期、IV期均有發(fā)現(xiàn)。正式試驗(yàn)開(kāi)始后,將曬田池塘的田面水排干,使田面自然曝曬,促使雌性克氏原螯蝦在田面掘穴并封口,正式試驗(yàn)開(kāi)始后停止投喂;對(duì)照池塘正常養(yǎng)殖,每天繼續(xù)投喂適量人工配合飼料。

1.2.2 樣品采集 曬田脅迫0、3、7、10 d時(shí)分別從2個(gè)池塘隨機(jī)采集30只雌性克氏原螯蝦,曬田池塘于采集當(dāng)天在田面使用鐵鏟挖掘蝦洞,將蝦鉗探入洞中捕捉采集,對(duì)照池塘于采集前一天在環(huán)溝中放置多個(gè)蝦籠,定時(shí)收籠起捕。將每個(gè)時(shí)間段的30只雌性克氏原螯蝦解剖,記錄卵巢顏色并拍照。曬田池塘與對(duì)照池塘每個(gè)時(shí)間段隨機(jī)取10只雌性克氏原螯蝦卵巢,制作石蠟切片及HE染色,分析其卵巢組織學(xué)特點(diǎn)并計(jì)算卵巢成熟率(卵巢生長(zhǎng)至IV期鑒定為卵巢成熟)。在曬田組與對(duì)照組中,每個(gè)采樣時(shí)間段隨機(jī)取5只蝦的組織作為一個(gè)混樣,并設(shè)置3個(gè)平行。將雌性克氏原螯蝦置于冰上,取出其肝胰腺和卵巢分別放入凍存管,所有組織均置于液氮保存?zhèn)溆谩?只雌性克氏原螯蝦的圍心腔各取1 mL血淋巴放入抗凝管,將其進(jìn)行混合,于4 ℃冰箱靜置20 min,4 ℃下2500 r/min離心10 min,取其上清液分裝至離心管,得到血清。進(jìn)一步檢測(cè)卵巢、肝胰腺和血清的卵黃蛋白原濃度及卵巢和肝胰腺mRNA表達(dá)水平,并檢測(cè)血清營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝水平。

卵巢成熟率(%)=IV期卵巢數(shù)量/總卵巢數(shù)量×100

組織表達(dá)量=該時(shí)間段組織(卵巢或肝胰腺)的mRNA相對(duì)表達(dá)量×該時(shí)間段組織(卵巢或肝胰腺)的平均質(zhì)量

組織表達(dá)總量=該組織的不同時(shí)間段組織表達(dá)量的總和

個(gè)體表達(dá)總量=不同組織的組織表達(dá)總量的總和

組織貢獻(xiàn)率=該組織的組織表達(dá)總量占個(gè)體表達(dá)總量的百分比

1.2.3 制作卵巢石蠟切片和HE染色 將各時(shí)間段采集的雌性克氏原螯蝦解剖,在各時(shí)間段雌性克氏原螯蝦中隨機(jī)采集10只蝦的卵巢,每個(gè)卵巢均利用4%多聚甲醛固定液固定24 h以上,通過(guò)75%～95%梯度酒精以及無(wú)水乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋以及切片等步驟制作組織切片,再脫蠟,使用蘇木素和伊紅進(jìn)行HE染色及脫水封片,經(jīng)顯微鏡鏡檢、測(cè)量和拍照。

1.2.4 卵黃蛋白原mRNA表達(dá)水平和濃度檢測(cè) 提取RNA:使用總RNA提取試劑盒(天根,DP419)從克氏原螯蝦卵巢和肝胰腺樣品中提取總RNA,測(cè)定樣品吸光度值(OD),通過(guò)260和280 nm的OD值確定RNA質(zhì)量,再進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),確定提取RNA的完整性和污染情況。RNA反轉(zhuǎn)錄:取200 ng 樣本RNA,添加RNase-free ddH2O至12 μL,加入3 μL 5×gDNA digester Mix,42 ℃孵育2 min,再加入5 μL 4×Hifair III SuperMix Plus,配出20 μL 反應(yīng)體系上機(jī)(PCR程序設(shè)置:25 ℃ 5 min,55 ℃ 15 min,85 ℃ 5 min),得到cDNA產(chǎn)物。

實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè):取10 μL SYBR Premix ExTaq(2×),加入正向引物(10 μmol/L)和反向引物(10 μmol/L)各1 μL,加入1 μL模板(cDNA),再添加ddH2O至20 μL,配出20 μL反應(yīng)體系上機(jī),設(shè)置兩步法熒光定量PCR擴(kuò)增條件(擴(kuò)增曲線(xiàn):95 ℃ 5 min,循環(huán)1次;95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,循環(huán)40次,72℃單點(diǎn)檢測(cè)信號(hào);熔解曲線(xiàn):95 ℃ 15 s,60 ℃ 60s,95 ℃ 15 s,連續(xù)檢測(cè)信號(hào)),下機(jī)得到CT值。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次,采用2-△△Ct法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行相對(duì)定量分析,獲得卵黃蛋白原mRNA相對(duì)表達(dá)量。使用18S基因作為內(nèi)參基因,18S基因與卵黃蛋白原基因的引物序列如表1所示。

表1 試驗(yàn)引物與序列Table 1 Experimental primers and sequences

卵黃蛋白原濃度采用江蘇晶美生物科技有限公司的ELISA 試劑盒檢測(cè),進(jìn)行3次重復(fù)。

1.2.5 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝水平檢測(cè) Hem和總蛋白(TP)采用江蘇晶美生物科技有限公司的ELISA試劑盒和BCA法蛋白含量試劑盒檢測(cè)。Glu采用高效液相法檢測(cè)。LA、甘油三酯(TG)和膽固醇(TC)采用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司試劑盒檢測(cè)。以上每個(gè)指標(biāo)檢測(cè)均進(jìn)行3次重復(fù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)整理分析使用Excel 2019、SPSS 26.0和GraphPad Prism 8.0.2軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 曬田環(huán)境脅迫下克氏原螯蝦卵巢組織學(xué)特點(diǎn)及成熟率變化

如圖1所示,根據(jù)形態(tài)和顏色,在曬田組與對(duì)照組雌性克氏原螯蝦中分別鑒定出4個(gè)卵巢發(fā)育階段,包括卵黃發(fā)生前階段(I期)、初級(jí)卵黃發(fā)生階段(II期)、次級(jí)卵黃發(fā)生階段(III期)、成熟階段(IV期)。I期卵巢為黃色,肉眼可觀(guān)察到細(xì)小顆粒,壁膜較厚(圖1-A);II期卵巢為橙色,外觀(guān)輪廓清楚,壁膜變薄,卵粒增大但不飽滿(mǎn),排列緊湊(圖1-B);III期卵巢為棕色,體積明顯變大,且卵粒飽滿(mǎn)(圖1-C);IV期為黑褐色,體積再次膨脹,卵粒更加飽滿(mǎn)且易脫落(圖1-D)。HE染色結(jié)果表明,鑒定的4個(gè)雌性克氏原螯蝦卵巢發(fā)育階段準(zhǔn)確性較高。I期卵母細(xì)胞小且接近圓形或橢圓形,直徑150～250 μm,細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)呈淡藍(lán)偏紫色(圖1-E);II期卵母細(xì)胞外形變化不大,直徑250～600 μm,出現(xiàn)卵黃顆粒,胞漿大部分為紫紅色,少許藍(lán)色(圖1-F);III期卵母細(xì)胞直徑大于600 μm,胞漿呈紫紅色且紅色程度增加,卵黃顆粒增加且體積變大(圖1-G);IV期卵母細(xì)胞直徑大于1000 μm,卵黃顆粒呈紫紅色且尺寸明顯增加,排列略微疏散(圖1-H)。如圖2所示,曬田脅迫0 d時(shí),曬田組與對(duì)照組雌性克氏原螯蝦卵巢成熟率相似;曬田脅迫10 d時(shí),曬田組的雌性克氏原螯蝦卵巢成熟率上升至96.67%,而對(duì)照組僅上升至60.00%。

A～D:卵巢外部形態(tài);A:I期;B:II期;C:III期;D:IV期。E～H:卵巢組織形態(tài)學(xué)HE染色;E:I期卵母細(xì)胞,F:II期卵母細(xì)胞,G:III期卵母細(xì)胞,H:IV期卵母細(xì)胞。A-D: External morphology of ovary; A: Phase I; B:Phase II; C:Phase III; D: Phase IV. E-H: Histomorphology HE staining of ovary; E: Phase I oocytes, F: Phase II oocytes, G: Phase III oocytes, H: Phase IV oocytes.圖1 克氏原螯蝦卵巢發(fā)育階段鑒定Fig.1 Identification of ovarian development stage of P. clarkii

2.2 曬田環(huán)境脅迫對(duì)克氏原螯蝦卵黃蛋白原mRNA表達(dá)水平和濃度的影響

如表2所示,曬田脅迫0、3、7和10 d時(shí),曬田組雌性克氏原螯蝦卵巢中卵黃蛋白原mRNA相對(duì)表達(dá)量、卵巢質(zhì)量、肝胰腺中卵黃蛋白原的mRNA相對(duì)表達(dá)量和肝胰腺質(zhì)量與對(duì)照組均不存在顯著差異(P>0.05,下同)。隨著脅迫時(shí)間增加,曬田組和對(duì)照組雌性克氏原螯蝦不同組織中卵黃蛋白原的mRNA相對(duì)表達(dá)量均呈上升趨勢(shì)。如表3所示,曬田脅迫0、3、7和10 d時(shí),曬田組雌性克氏原螯蝦卵黃蛋白原的卵巢表達(dá)量與對(duì)照組均不存在顯著差異;曬田脅迫0和10 d時(shí),曬田組雌性克氏原螯蝦卵黃蛋白原在肝胰腺的表達(dá)量與對(duì)照組不存在顯著差異;曬田脅迫3和7 d時(shí),曬田組雌性克氏原螯蝦卵黃蛋白原在肝胰腺的表達(dá)量顯著大于對(duì)照組(P<0.05,下同)。曬田組和對(duì)照組雌性克氏原螯蝦卵黃蛋白原在肝胰腺的表達(dá)總量均大于卵巢表達(dá)總量,肝胰腺貢獻(xiàn)率均大于卵巢貢獻(xiàn)率,2組肝胰腺貢獻(xiàn)率均大于60.00%,卵巢貢獻(xiàn)率均大于25.00%,且曬田組雌性克氏原螯蝦卵巢貢獻(xiàn)率低于對(duì)照組,肝胰腺貢獻(xiàn)率高于對(duì)照組。如圖3所示,曬田脅迫0、3、7和10 d時(shí),曬田組雌性克氏原螯蝦卵巢、血液中卵黃蛋白原濃度與對(duì)照組不存在顯著差異;曬田脅迫0、7和10 d時(shí),曬田組雌性克氏原螯蝦肝胰腺中卵黃蛋白原濃度與對(duì)照組不存在顯著差異;曬田脅迫3 d時(shí),曬田組雌性克氏原螯蝦肝胰腺中卵黃蛋白原濃度顯著大于對(duì)照組。隨脅迫時(shí)間增加,曬田組和對(duì)照組雌性克氏原螯蝦卵巢、肝胰腺和血液中的卵黃蛋白原濃度均呈上升趨勢(shì)。如表4所示,Pearson相關(guān)系數(shù)表明,肝胰腺卵黃蛋白原濃度與卵巢卵黃蛋白原濃度、肝胰腺卵黃蛋白原濃度與血清卵黃蛋白原濃度、卵巢卵黃蛋白原濃度與血清卵黃蛋白原濃度間呈極顯著正相關(guān)(P<0.01,下同),相關(guān)系數(shù)分別為0.985、0.954和0.918。

表2 不同曬田時(shí)間克氏原螯蝦卵巢與肝胰腺質(zhì)量以及該組織卵黃蛋白原的mRNA相對(duì)表達(dá)量Table 2 The mass of ovaries and hepatopancreas and the relative mRNA expression of vitellogenin in the tissues of P. clarkii at different sunning field time

折線(xiàn)上不同小寫(xiě)字母表示同一曬田時(shí)間下不同處理組間差異顯著(P<0.05),下同。Different lowercase letters on the polyline indicate significant differences between treatment groups at the same time (P<0.05). The same as below.圖3 不同曬田時(shí)間克氏原螯蝦各組織卵黃蛋白原濃度變化Fig.3 Changes of vitellogenin concentration in different tissues of P. clarkii at different sunning field time

表3 不同曬田時(shí)間克氏原螯蝦卵黃蛋白原在卵巢和肝胰腺中的表達(dá)量及貢獻(xiàn)率Table 3 The expression and contribution rate of vitellogenin in the ovary and hepatopancreas of P. clarkii at different sunning field time

表4 曬田環(huán)境脅迫下克氏原螯蝦各組織卵黃蛋白原濃度的相關(guān)性Table 4 Correlation of vitellogenin concentrations in various tissues of P. clarkii under sunning field environmental stress

2.3 曬田環(huán)境脅迫對(duì)克氏原螯蝦營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝的影響

如圖4所示,曬田脅迫0、3、7和10 d時(shí),曬田組雌性克氏原螯蝦血液中的Hem和TP含量與對(duì)照組不存在顯著差異,隨著脅迫時(shí)間增加,曬田組和對(duì)照組雌性克氏原螯蝦血液中Hem和TP含量均呈下降趨勢(shì),曬田組雌性克氏原螯蝦血液中Hem和TP含量下降幅度大于對(duì)照組。曬田脅迫0和3 d時(shí),曬田組雌性克氏原螯蝦血液中的TG含量與對(duì)照組不存在顯著差異;曬田脅迫7和10 d時(shí),曬田組雌性克氏原螯蝦血液中TG含量顯著大于對(duì)照組。曬田脅迫0、3和7 d時(shí),曬田組雌性克氏原螯蝦血液中TC含量與對(duì)照組不存在顯著差異,曬田脅迫10 d時(shí),曬田組雌性克氏原螯蝦血液中TC含量顯著大于對(duì)照組。隨著時(shí)間增加,曬田組和對(duì)照組雌性克氏原螯蝦血液中TG和TC含量呈上升趨勢(shì),曬田組TG與TC含量上升幅度大于對(duì)照組。曬田脅迫0、3、7和10 d時(shí),曬田組雌性克氏原螯蝦血液中LA含量與對(duì)照組不存在顯著差異。曬田脅迫0、3和7 d時(shí),2組雌性克氏原螯蝦血液中Glu含量不存在顯著差異;曬田脅迫10 d時(shí),曬田組雌性克氏原螯蝦血液中Glu含量顯著低于對(duì)照組。隨著脅迫時(shí)間增加,曬田組和對(duì)照組雌性克氏原螯蝦血液中LA和Glu含量呈下降趨勢(shì),曬田組雌性克氏原螯蝦血液中LA和Glu含量下降幅度大于對(duì)照組。

圖4 不同曬田時(shí)間克氏原螯蝦營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝指標(biāo)變化Fig.4 Changes of nutrient metabolism indexes of P. clarkii at different sunning field time

3 討 論

3.1 曬田環(huán)境脅迫對(duì)克氏原螯蝦卵巢發(fā)育分期及成熟率的影響

隨著卵母細(xì)胞增殖和卵黃及脂卵黃的攝取,克氏原螯蝦卵巢發(fā)育成熟,期間卵巢體積增大,顏色發(fā)生白色、黃色、棕色和深棕色的變化[1]。因此,根據(jù)形態(tài)和顏色可初步判斷克氏原螯蝦卵巢發(fā)育階段。在曬田脅迫期間發(fā)現(xiàn)4種不同顏色卵巢,分別為黃色的卵黃發(fā)生前階段(I)、橙色的初級(jí)卵黃發(fā)生階段(II)、棕色的次級(jí)卵黃發(fā)生階段(III)、黑褐色的成熟階段(IV),由黃色到黑褐色的變化過(guò)程中,卵巢體積不斷增大。本研究中曬田環(huán)境脅迫雌性克氏原螯蝦卵巢顏色與正常養(yǎng)殖下一致,但卻不同于Zhong等[1]正常養(yǎng)殖下的卵巢顏色,推測(cè)可能與地域環(huán)境條件有關(guān)。將采集的雌性克氏原螯蝦卵巢分為4個(gè)階段,與前人研究中的分期方法基本一致,而I～I(xiàn)V期卵母細(xì)胞直徑大小與其相應(yīng)階段的細(xì)胞大小有所差異,可能與卵巢成熟時(shí)間和成熟方式有關(guān)[1,9,18]。

本研究中,曬田脅迫10 d時(shí),對(duì)照組雌性克氏原螯蝦卵巢發(fā)育分期主要為III期和IV期,而曬田組雌性克氏原螯蝦卵巢發(fā)育分期主要為IV期,表明正常養(yǎng)殖下卵巢從III期發(fā)育至IV期還需較長(zhǎng)時(shí)間,而曬田環(huán)境脅迫僅需10 d即可將卵巢發(fā)育至IV期,大幅度提高卵巢發(fā)育成熟速度。曬田脅迫0 d時(shí),曬田組雌性克氏原螯蝦卵巢成熟率與對(duì)照組相似,曬田脅迫10 d時(shí),曬田組雌性克氏原螯蝦卵巢成熟率升至96.67%,但對(duì)照組雌性克氏原螯蝦卵巢成熟率僅升至60.00%。這也再次驗(yàn)證了生產(chǎn)上曬田環(huán)境脅迫可提高克氏原螯蝦卵巢發(fā)育成熟速度的結(jié)論。本研究雌性克氏原螯蝦卵巢成熟率結(jié)果與廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院王大鵬科研團(tuán)隊(duì)前期研究的曬田環(huán)境脅迫雌性克氏原螯蝦卵巢成熟率結(jié)果(7.5%～92.5%)有所差異,但曬田脅迫10 d時(shí)雌性克氏原螯蝦卵巢成熟率均在90%.00以上,推測(cè)是天氣狀況、暴曬情況及克氏原螯蝦種質(zhì)優(yōu)劣不同而導(dǎo)致雌性克氏原螯蝦卵巢成熟率有所差異。

3.2 曬田環(huán)境脅迫對(duì)克氏原螯蝦卵黃蛋白原的影響

甲殼動(dòng)物內(nèi)分泌系統(tǒng)的性類(lèi)固醇相關(guān)激素[19]、高血糖家族激素[20]、甲基法尼酯[21]以及蛻皮激素[22]都能影響卵黃蛋白原合成。本研究曬田組和對(duì)照組雌性克氏原螯蝦卵巢與肝胰腺卵黃蛋白原mRNA相對(duì)表達(dá)量及卵巢、肝胰腺和血液卵黃蛋白原濃度均隨脅迫時(shí)間增加呈上升趨勢(shì),表明曬田環(huán)境脅迫可影響內(nèi)分泌系統(tǒng)相關(guān)激素分泌,使克氏原螯蝦體內(nèi)不同組織卵黃蛋白原合成隨時(shí)間增加均得到不同程度提高。然而研究表明,隨著環(huán)境脅迫時(shí)間增加,機(jī)體的能量?jī)?chǔ)備消耗越發(fā)明顯[12],慢性脅迫可能導(dǎo)致水生無(wú)脊椎動(dòng)物糖原、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)作為最終能量被消耗[3],卵黃蛋白原作為成熟卵母細(xì)胞中主要蛋白質(zhì),將在慢性脅迫下發(fā)揮作用而被消耗[12],表現(xiàn)為濃度或mRNA水平降低。這與本研究結(jié)果存在差異,產(chǎn)生差異的原因推測(cè)為卵黃蛋白原在曬田環(huán)境脅迫下本身存在一定消耗,但消耗量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于合成量,因此在數(shù)據(jù)上表現(xiàn)為上升趨勢(shì)。此外,甲殼動(dòng)物卵黃蛋白原外源性合成部位為肝胰腺,內(nèi)源性合成部位為卵巢,血液僅具有運(yùn)輸功能[23]。關(guān)于克氏原螯蝦卵黃蛋白原合成部位的研究較少,相關(guān)報(bào)道顯示,克氏原螯蝦卵黃蛋白原合成器官僅涉及肝胰腺和卵巢,主要合成器官為肝胰腺,其貢獻(xiàn)率在80%以上[9]。本研究曬田組和對(duì)照組雌性克氏原螯蝦卵黃蛋白原的肝胰腺表達(dá)總量均大于卵巢表達(dá)總量,肝胰腺貢獻(xiàn)率均大于卵巢貢獻(xiàn)率,2組肝胰腺貢獻(xiàn)率均大于60.00%,卵巢貢獻(xiàn)率均大于25.00%,說(shuō)明曬田環(huán)境脅迫與正常養(yǎng)殖下雌性克氏原螯蝦卵黃蛋白原合成部位都以肝胰腺為主,卵巢為輔。然而曬田組雌性克氏原螯蝦卵巢貢獻(xiàn)率低于對(duì)照組,肝胰腺貢獻(xiàn)率高于對(duì)照組,表明曬田環(huán)境脅迫可增加外源性卵黃蛋白原合成,降低內(nèi)源性卵黃蛋白原合成。Pearson相關(guān)系數(shù)顯示,曬田組雌性克氏原螯蝦肝胰腺卵黃蛋白原濃度與卵巢和血淋巴呈極顯著正相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為0.985和0.954,表明曬田環(huán)境脅迫可促進(jìn)克氏原螯蝦肝胰腺向卵巢轉(zhuǎn)運(yùn)卵黃蛋白原。

3.3 曬田環(huán)境脅迫對(duì)克氏原螯蝦營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝指標(biāo)的影響

克氏原螯蝦具有特殊習(xí)性,當(dāng)生活環(huán)境發(fā)生巨大變化(如干旱、高溫酷暑等)時(shí),其種族延續(xù)與繁殖需求將變成生存下首要選擇,繁殖性能將發(fā)生變化,因此體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)能量將優(yōu)先供給繁殖相關(guān)活動(dòng)[24]。甲殼動(dòng)物卵巢發(fā)育及能量代謝所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)為糖類(lèi)、脂質(zhì)和蛋白[25]。TP和Hem可反映甲殼動(dòng)物蛋白質(zhì)代謝。TP在甲殼動(dòng)物體液免疫過(guò)程中起關(guān)鍵作用,是重要能量來(lái)源[26]。Hem具有載氧、酚氧化物酶活性、轉(zhuǎn)運(yùn)金屬離子、儲(chǔ)存蛋白質(zhì)、滲透壓調(diào)節(jié)、蛻皮激素載體、表皮固化等作用[27-28]。甲殼動(dòng)物將體內(nèi)富余蛋白質(zhì)以Hem形式儲(chǔ)存,作為存儲(chǔ)蛋白能量的有效途徑[29]。本研究曬田組和對(duì)照組雌性克氏原螯蝦Hem和TP含量均隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì),曬田組雌性克氏原螯蝦Hem和TP含量下降幅度大于對(duì)照組,表明與正常養(yǎng)殖相比,曬田環(huán)境脅迫下克氏原螯蝦體液免疫能力下降,機(jī)體對(duì)環(huán)境的防御反應(yīng)能力降低,同時(shí)存儲(chǔ)蛋白能量的效率降低,體內(nèi)富余蛋白質(zhì)減少,且對(duì)滲透壓、蛻皮激素等生理指標(biāo)的調(diào)控能力降低,推測(cè)是因?yàn)槭軔毫迎h(huán)境影響,克氏原螯蝦體內(nèi)能量?jī)?chǔ)備消耗較嚴(yán)重,同時(shí)供給繁殖相關(guān)活動(dòng)能量較多。

TC和TG可反映甲殼動(dòng)物脂質(zhì)代謝。TC是甲殼動(dòng)物體內(nèi)性類(lèi)固醇激素及多種激素合成的重要原料,可調(diào)控卵巢發(fā)育的重要營(yíng)養(yǎng)與能量物質(zhì),對(duì)性腺發(fā)育等功能活動(dòng)具有重要作用[30]。TG是甲殼動(dòng)物生殖和代謝過(guò)程中重要的營(yíng)養(yǎng)和能量來(lái)源,作為成體、卵和開(kāi)口前幼體能量貯存的主要方式,對(duì)促進(jìn)卵巢發(fā)育和繁殖具有關(guān)鍵作用[31-32]。本研究中,曬田組雌性克氏原螯蝦TG和TC含量上升幅度大于對(duì)照組,在曬田脅迫10 d時(shí),曬田組TG和TC含量顯高于對(duì)照組,表明曬田環(huán)境脅迫可增加克氏原螯蝦體內(nèi)能量貯存,用于合成卵巢發(fā)育相關(guān)激素,調(diào)控卵巢發(fā)育及繁殖相關(guān)活動(dòng)。

LA和Glu可反映甲殼動(dòng)物糖類(lèi)代謝。LA能刺激甲殼類(lèi)動(dòng)物分泌高血糖激素,將Glu輸送到血淋巴作為厭氧菌底物,影響無(wú)氧代謝水平[33]。Glu作為甲殼動(dòng)物代謝過(guò)程中主要的能量物質(zhì),可釋放大量能量,有利于應(yīng)對(duì)不同環(huán)境脅迫[34-35]。本研究中,曬田組和對(duì)照組雌性克氏原螯蝦LA和Glu含量隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì),在曬田脅迫10 d時(shí)達(dá)到最低值,曬田組下降幅度大于對(duì)照組,表明與正常養(yǎng)殖相比,曬田環(huán)境脅迫克氏原螯蝦可減少高血糖激素分泌,降低無(wú)氧代謝水平,且為應(yīng)對(duì)曬田環(huán)境脅迫,克氏原螯蝦將減少能量釋放,將能量?jī)?yōu)先供給繁殖活動(dòng)。這一變化可能與克氏原螯蝦特殊習(xí)性有關(guān)。

4 結(jié) 論

曬田環(huán)境脅迫期間共鑒定出4個(gè)克氏原螯蝦卵巢發(fā)育階段。隨脅迫時(shí)間增加,克氏原螯蝦不同組織卵黃蛋白原mRNA相對(duì)表達(dá)量及濃度均呈上升趨勢(shì),卵黃蛋白原在肝胰腺的貢獻(xiàn)率大于卵巢貢獻(xiàn)率。克氏原螯蝦體內(nèi)Hem、TP、LA和Glu含量降低,TG和TC含量升高,說(shuō)明曬田環(huán)境脅迫對(duì)卵巢發(fā)育具有積極作用。