基于高通量測序分析天麻種植土壤的真菌變化

陳 瑞,楊德強,趙長林

(1.西南林業大學生物多樣性保護學院,昆明 650224;2.云南國誠農業發展有限公司,云南 昭通 657000)

【研究意義】天麻(GastrodiaelataBlume)又名定風草,為蘭科天麻屬多年生共生草本植物。天麻主產于中國陜西、四川、云南、貴州、湖南、湖北等省份,其中云南省彝良縣、永善縣等地為公認的道地藥材天麻產區[1-3]。天麻有鎮靜、抗衰老的作用,臨床醫學上主治肝陽上亢所致的頭痛眩暈、驚厥抽搐等癥[3]。天麻被廣泛用于藥食領域,其塊莖中獨有的天麻素、香莢蘭醇、酚性化合物等化學成分具有鎮痛、抗抑郁、抗衰老、增強細胞免疫力等作用[4-6]。然而,天麻栽培一直受連作障礙的困擾,其機理與藥用植物連作障礙相似,連作產生的化感自毒物質引起土壤微生態的變化是天麻發生連作障礙的重要原因[7-9]。藥用植物栽培中的連作障礙問題嚴重影響了中藥材的規范化種植,隨著天麻栽培面積的不斷擴大及中藥材規范化種植的推行,連作障礙已成為限制天麻高產、優產的重要因素[8-14],因此研究消除或減輕天麻連作障礙的方法具有重要現實意義?！厩叭搜芯窟M展】近年來,中國農作物與藥用植物連作障礙問題備受關注,其中土壤微生物在連作障礙問題中扮演重要角色,更多學者致力于植物種植土壤微生態研究,當土壤中營養成分、微生物組成結構改變,導致土壤中病原菌的大量繁殖,有益微生物的生長受到抑制,植株將無法正常生長發育[13-16]。土壤中微生物生存數量巨大、種類繁多,是土壤生態系統的組成部分,亦存在緩解作物連作障礙及其他土壤障礙因子的重要因素,如重茬大豆土壤中病原真菌鐮刀菌是導致大豆生長發育障礙的主要原因之一,而木霉菌可用作拮抗菌研究[11,17-18]。土壤中微生物的種類和數量受土壤類型、季節變化、土層厚度等因素影響,大量研究結果表明植株發病率或發病指數與土壤中病原微生物數量呈正比,在農作物重茬種植土壤中,主要病原菌增多[15,18-20]。高通量測序技術在土壤微生物群落結構研究、土壤微生物多樣性研究及土壤生態功能研究方面有較大的影響,土壤真菌群落結構組成及其多樣性對植物根際生態系統的平衡起著重要作用[21]。崔紀超等[22]基于高通量測序技術分析苧麻根際土壤真菌物種多樣性;勞承英等[23]基于高通量測序技術分析黃連病株和健株根際土壤真菌,揭示黃連根際土壤真菌組成關系;蔣靖怡等[24]基于高通量測序分析紫花丹參、白花丹參根際土壤真菌群落結構與差異物種組成?！颈狙芯壳腥朦c】目前對天麻連作障礙研究較少,因此,本研究從天麻種植土壤微生物變化著手,采集天麻種植前后及方竹修復后的土樣進行研究?！緮M解決的關鍵問題】基于高通量測序方法揭示天麻種植土壤真菌的群落結構,為明晰天麻連作障礙產生的原因及開發解除或減輕天麻連作障礙的生物菌劑提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗地點位于云南省彝良縣蕎山鎮(104°16′14′′ E,27°39′33′′ N),為昭通地區天麻主產地,該鎮平均海拔1650 m,年均氣溫11 ℃,年均降水量860 mm,土壤呈酸性或微酸性,富含腐殖質,氣候和土壤條件皆適宜天麻生長[9]。本研究分別于2020年、2021年分批次采樣,每年10月收獲商品麻時進行采樣。分別在種植天麻前和收獲天麻后采集菌塘土壤,樣本以“Z”形狀采集,用取樣鏟將天麻及菌材全部挖出,去除土塊與雜物,使用康寧離心管(50 mL)進行分裝,樣本低溫保藏帶回實驗室后置于-80 ℃冰箱中保存。采樣區域為天麻原始土、天麻一年土和方竹修復土[9],每種土樣設置3個重復(表1)。

表1 采集土壤樣品編號及分組Table 1 Soil sample number and assigned group

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取 使用TGrinder H24組織研磨均質儀 (OSE-TH-01,6 m/s的速度振蕩30 s,間隔30 s,共2個循環)將樣本與緩沖液充分混勻,用特定的DNA提取試劑盒 (Magnetic Soil And Stool DNA Kit)提取樣本的總基因組,用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取的DNA。

1.2.2 PCR擴增、產物檢測、純化和定量 采用通用引物ITS1-1F-F和ITS1-1F-R對樣本真菌進行PCR擴增[16],具體擴增區域如表2所示。

表2 PCR擴增引物信息Table 2 Primer information amplified by PCR

1.2.3 高通量測序及數據分析 首先使用 Trimmomatic v0.33軟件對測序得到的 Raw reads進行過濾[25];然后使用cutadapt 1.9.1軟件進行引物序列的識別與去除,得到不包含引物序列的Clean reads;使用 Usearch v10軟件,通過overlap對每個樣品的Clean reads 進行拼接[26],然后根據不同區域的長度范圍對拼接后數據進行長度過濾[27];使用 QIIME2 2020.6軟件中的dada2方法進行去噪并去除嵌合體序列[28],得到最終有效數據(Non-chimeric reads),用于后續的ASVs (Amplicon sequence variants)劃分、多樣性分析以及差異分析[29-33]。

2 結果與分析

2.1 土樣真菌OTU組成與分析

通過去噪得到的各個樣本真菌ASV,由圖1可知,一麻壤樣本Zhaochangl 017真菌ASV最大,為312,原壤樣本Zhaochangl 019真菌ASV最小,為132,樣本的真菌總ASV為720。

圖1 各樣本ASVFig.1 ASV number of each sample

將豐度小于0.001的ASV過濾后,比較3組樣本真菌ASV (圖2),3組樣本共含真菌ASV 49個,基于3組特有真菌ASV分析結果顯示,一麻壤charlle002特有真菌數量最多,達28個;其次是方壤charlle006,有20個,二者均高于原壤charlle001特有真菌數量。上述研究結果表明:一麻壤中特有真菌數目明顯高于原壤,且方壤特有真菌數量高于原壤低于一麻壤;經天麻種植后,一麻壤真菌ASV明顯上升,然而一麻壤經種植方竹后,方壤真菌ASV數量高于原壤,但低于一麻壤。

圖2 3組樣本ASV花瓣圖Fig.2 ASV petal maps of three groups

3組樣本真菌系統發育分類階元上相對豐度分析表明 (圖3),3組樣本真菌按門分為Ascomycota、Basidiomycota、Mortierellomycota;按綱分為Agaricomycetes、Eurotiomycetes、Leotiomycetes、Mortierellomy-cetes、Sordariomycetes和Tremellomycetes;按目分為Agaricales、Chaetothyriales、Filobasidiales、Helotiales、Hypocreales、Mortierellales、Polyporales、Sordariales和Xylariales;按科分為Bolbitiaceae、Ceratobasidiaceae、Clavicipitaceae、Herpotrichiellaceae、Hyaloscyphaceae、Hydnangiaceae、Hypocreaceae、Leotiaceae、Meruliaceae、Mortierellaceae、Sordariaceae、Strophsrisceae、Tricholomataceae和Xylariaceae;按屬分為Cadophora、Camarophyllopsis、Cladophialophora、Clavaria、Clavulinopsis、Conocybe、Deconica、Gorgomyces、Hyaloscypha、Laccaria、Metapochonia、Neurospora、Rosellinia、Scopuloides、Thanatephorus和Trichoderma。

圖3 樣本真菌系統發育樹Fig.3 The phylogenetic tree of the sample fungi

由圖3中餅圖色塊和大小可知隸屬于Mortierellomycota的Mortierellomycetes、Mortierellales、Mortierellaceae和Mortierella真菌在charlle001 (原壤)中占比極高,隸屬于子囊菌門 (Ascomycota)的Eurotiomycetes、Chaetothyriales和Sordariomycetes、Xylariales真菌在charlle002 (一麻壤)中占比極高,隸屬于擔子菌門 (Basidiomycota)的Tremellomycetes在charlle006 (方壤)中占比極高。科水平下:Tricholomataceae、Sordariaceae在charlle001中豐度極大,在charlle002和charlle006中豐度極小;Bolbitiaceae、Xylariaceae在charlle002中豐度極大,在charlle001和charlle006中豐度極小;Hydnangiaceae、Meruliaceae在charlle006中豐度極大,在charlle001和charlle002中豐度極小。屬水平下:Camarophyllopsis、Clavaria、Deconica和Neurospora在charlle001中豐度極大;Conocybe、Metapochonia和Rosellinia在charlle002中豐度極大;Laccaria、Thanatephorus和Trichoderma在charlle006中豐度極大。

2.2 土樣真菌群落結構及相對豐度

將豐度低的樣本合并為Others作單個樣本在科水平及種水平的樣本豐度 (圖4～5),分析結果表明,樣本豐度按科等級,除未注釋到科的類群外,樣本真菌主要隸屬于Clavicipitaceae、Xylariaceae、Leotiacene、Hydnangiaceae、Tricholomataceae、Ceratobasidiaceae、Hyaloscyphaceae、Herpotrichiellacene、Hypocreacene、Piskurezymaceae、Mortierellaceac、Clavariaceae和Helotiales fam Incertae sedis,其中每組土樣的優勢菌科有所差異。注釋到種水平的真菌主要隸屬于Clavulinopsis、Hyaloscypha、Mortierella、Spirosphaera、Cadophora、Trichoderma、Rosellinia、Clitocybe和Solicoccozyma屬,各樣本中優勢菌存在差異,原壤中Clitorybetrulliformis在Zhaochangl 021組占據優勢地位,一麻壤中Rosellinienecatrix、Spirospheeracaricigraminis和Solicoccozymaterricola分別在Zhaochangl 015、Zhaochangl 016和Zhaochangl 017 3個樣本中明顯占據優勢地位,Trichodermarifaii在方壤的Zhaochangl 032樣本中占據優勢地位。

圖4 科水平單個樣本相對豐度Fig.4 Relative abundance of a single sample(family)

圖5 種水平單個樣本相對豐度Fig.5 Relative abundance of a single sample (species)

物種豐度與樣本相互關系圖通過Circos繪制[33],其篩選相對豐度大于1%的物種以family水平繪圖,揭示各分組樣本中不同物種所占的比例及物種在不同分組中的比例關系。由圖6可知,3組土樣優勢菌組成較為相似,均以Agaricales、Cantharellales、Chaetothyriales、Filobasidiales、Helotiales、Hyporeales、Mortierellales、Pezizales、Polyporales、Sordariales、Trechisporales和Xylariales為優勢菌,且各優勢菌相對豐度存在差異。charlle001科水平相對豐度較大優勢菌有8類,依次為Helotiales>Agaricales>Mortierellales>Sordariales>Chaetothyriales>Filobasidiales>Hyporeales>Pezizales;charlle002科水平相對豐度較大優勢菌有11類,依次為Helotiales>Agaricales>Trechisporales>Chaetothyriales>Filobasidiales>Xylariales>Hyporeales>Mortierellales>Sordariales>Cantharellales>Pezizales;charlle006科水平相對豐度較大優勢菌有9類,依次為Helotiales>Agaricales>Cantharellales>Hyporeales>Polporales>Sordariales>Chaetothyriales>Filobasidiales>Pezizales。Helotiales和Agaricales真菌豐度在3組土樣中占比都較大,在charlle001和charlle006內Helotiales真菌豐度均為35%,charlle002為20%;Polyporales真菌為charlle006獨有,charlle002中真菌種類明顯多于charlle001和charlle006,結合取樣點信息推斷一麻壤charlle002中真菌種類變多,且其豐度也有所改變,分析其原因與種植過一年天麻有直接關系;一麻壤經過種植方竹后,方壤charlle006比一麻壤charlle002真菌種類減少,分析其原因可能種植方竹不利于天麻病原菌生存和生長。

圖6 樣本與物種豐度circos圖 (科)Fig.6 Circos plots of samples and species abundance(family)

基于科水平Heatmap聚類分析 (圖7),在熱圖聚類結果中,顏色代表物種豐度;分析結果顯示,方壤中Hydnangiaceae、Meruliaceae、Rickenellaceae、Psathyrellaceae和Sebacinaceae 5個科類群真菌在Zhaochangl 033樣本中占比極高,Cantharellales fam Incertae sedis、Ceratobasidiaceae、Helotiales fam Incertae sedis和Hypocreaceae 4個類群在Zhaochangl 032樣本中占比極高。一麻壤charlle002組3個樣本Zhaochangl 015、Zhaochangl 016和Zhaochangl 017占比較高的類群不同,分別為Zhaochangl 015:Xylariaceae和Ascobolaceae,Zhaochangl 016:Atheliaceae和Diaporthaceae Chactosphacriaceae;Zhaochangl 017:Bolbitiaceae、Pezizales fam Incertae sedis和Piskurozymaceae。原壤charlle001組Zhaochangl 019占比較高的類群有Coniochaetaceae、fam Incertaesedis、Pyronemataceae和Sordariaceae Sordariales,Zhaochangl 020占比較高的類群有Entolomataceae、Mortierellaceae、Strophariaceae和Tricholomataceae 4個類群,Hyaloscyphaceae則在Zhaochangl 021中占比較高,上述結果表明不同土樣的組內差異較大。

圖7 物種相對豐度聚類熱圖 (科)Fig.7 Clustering heatmap of relative species abundance(family)

2.3 土樣真菌群落多樣性分析

樣本Alpha多樣性指數采用Qiime2[25]軟件進行評估。

由表3可知,不同處理土壤真菌多樣性指數覆蓋率分別在99%以上,說明土壤樣本測序數據足夠真實,可反映其真菌群落的多樣性。Observed species結果顯示原壤charlle001物種數最少,僅166個,一麻壤charlle002中樣本物種數最多,分析真菌群落多樣性Shannon指數和Simpson指數發現,原壤charlle001和一麻壤charlle002樣本真菌多樣性較高,方壤charlle003多樣性指數最低,該結果表明方竹輪作修復后,土壤真菌多樣性降低。Chao1指數和Ace1指數在一麻壤charlle002中表現最高,原壤charlle001中表現最低,該結果表明天麻種植后真菌物種豐富度會增加,方竹輪作后會降低土壤真菌物種豐富度但仍高于原壤。

表3 樣本真菌 Alpha 多樣性指數統計Table 3 Statistics of the fungal Alpha diversity index of the samples

運用R語言ggplot2包繪制PCA散點圖(圖8),PCA分析結果表明,原壤charlle001、一麻壤charlle002和方壤charlle003此3組樣本組內土壤真菌差異較小,而組間土壤真菌差異較大。

圖8 樣本PCA散點圖Fig.8 PCA scatter plot of samples

由圖9可知,Ascomycota、Basidiomycota和Mortierellomycota 3門真菌豐度較大,為所有樣本中的主要優勢菌,其中Ascomycota真菌豐度普遍最大。原壤3個樣本Zhaochangl 019、Zhaochangl 020、Zhaochangl 021中Mortierellomycota門真菌豐度明顯高于一麻壤內3個樣本,推測Mortierellomycota真菌可能是天麻種植土壤中的有益真菌。原壤、一麻壤、方壤各樣本均分別聚為一支,表明各組樣本真菌的組成與豐度較相似;方壤2個樣本聚一支,其樣本中Ascomycota真菌豐度最大。

圖9 UPGMA樣本聚類樹分析 (門)Fig.9 Clustering tree analysis of UPGMA sample(phylum)

2.4 樣本真菌差異分析

基于屬水平組間Welch’st-test檢驗,原壤(charlle001)、一麻壤(charlle002)、方壤(charlle006)3組樣本兩兩比較做組間物種差異分析圖(圖10～15,圖中左邊為組間差異物種豐度展示,右邊為組間差異置信度展示)。由圖10可知,原壤(charlle001)和一麻壤(charlle002)組間真菌Camarophyllopsis和Conocybe相對豐度差異顯著,Camarophyllopsis內真菌在charlle001中豐度更高,而Conocybe內真菌在charlle002中豐度更高。

圖10 樣本微生物群落差異比較charlle001 vs charlle002 (屬)Fig.10 Comparison of microbial community differences between charlle001 and charlle002 (genus)

由圖11可知,原壤(charlle001)和方壤(charlle006)差異物種分析表明,Camarophyllopsis內真菌組間相對豐度差異顯著,在charlle001中豐度極高,兩組樣本均有Trimmatostroma。

圖11 樣本微生物群落差異比較charlle001 vs charlle006 (屬)Fig.11 Comparison of microbial community differences between charlle001 and charlle006 (genus)

由圖12可知,一麻壤charlle002和方壤charlle006組間物種差異分析揭示,Byssonectria和Solicoccozyma內真菌相對豐度差異顯著,Byssonectria在charlle006中豐度更高,而Solicoccozyma在charlle002中豐度更高。

圖12 樣本微生物群落差異比較charlle006 vs charlle002 (屬)Fig.12 Comparison of microbial community differences between charlle006 and charlle002(genus)

基于種水平組間Welch’st-test檢驗,原壤(charlle001)、一麻壤(charlle002)、方壤(charlle006)3組樣本兩兩比較作組間物種差異分析圖。一麻壤(charlle002)和方壤(charlle006)組間物種差異分析揭示 (圖13),在一麻壤和方壤中均表現為Solicoccozyma>Byssonectria,但Byssonectria和Solicoccozyma在一麻壤和方壤中相對豐度存在顯著差異,Byssonectria表現為charlle006>charlle002,Solicoccozyma表現為charlle002>charlle006。

圖13 樣本微生物群落差異比較charlle006 vs charlle002 (種)Fig.13 Comparison of microbial community differences between charlle006 and charlle002 (species)

由圖14可知,原壤(charlle001)和一麻壤(charlle002)組間被孢霉屬真菌相對豐度存在差異,Mortierellaalpina和M.simplex兩組樣本中相對豐度均表現為charlle001>charlle002,且土壤中高山被孢霉M.alpina相對豐度高于M.simplex。

圖14 樣本微生物群落差異比較charlle001 vs charlle002 (種)Fig.14 Comparison of microbial community differences between charlle001 and charlle002(species)

由圖15可知,原壤(charlle001)和方壤(char lle006)差異物種分析表明,Mortierella和Penicillium相對豐度差異顯著,且高山被孢霉M.alpina和M.simplex在charlle001中豐度極高,顯著高于charlle006,而Penicilliumlineatum相對豐度較其他2種真菌低,在原壤和方壤中表現為charlle006>charlle001。

圖15 樣本微生物群落差異比較charlle001 vs charlle006 (種)Fig.15 Comparison of microbial community differences between charlle001 and charlle006 (species)

3 討 論

連作障礙在農業生產中已成為農業經濟可持續發展的無形障礙,研究表明農作物連作障礙會提升致病真菌數量和使真菌群落發生顯著增加,如豌豆[34]、大蒜[35]、大豆[36]、黃瓜[37-38]、燕麥[39]、馬鈴薯[40]等;藥用植物連作障礙導致真菌數量顯著增加,如人參[41]、西洋參[42]、太子參[43]、丹參[44]、半夏[45-46]、三七[47-48]、白術[49]、地黃[50-52]等,因此搞清天麻種植土壤微生物變化,是破除天麻連作障礙基礎且必要的前提工作,本研究旨在揭示天麻種植土壤真菌群落組成結構,天麻種植前后土壤真菌群落結構的變化及種完天麻種方竹后土壤真菌群落結構的變化,為研究天麻根際土壤微生態提供理論依據并為解決天麻連作障礙提供技術支持。李自博[41]基于高通量測序技術研究人參根際土壤真菌群落結構及多樣性,人參根際真菌群落以子囊菌門 (Ascomycota),接合菌門 (Zygomycota)和擔子菌門 (Basidiomycota)為主要群體,在人參連作土壤中,病原真菌顯著增加,被孢霉屬Mortierellasp.和鐮刀菌Fusariumsp.成為優勢真菌。太子參連作土壤微生物研究結果顯示連作土壤中有益細菌數量減少,真菌數量增多,其中具有致病作用或屬于病原體的真菌種 (屬)隨太子參連作年限增加而增加[43]。本研究采用高通量測序技術揭示3種類型天麻土壤 (原壤、一麻壤、方壤)真菌在種群組成、數量和分布上存在差異,一麻壤中真菌種類、數量明顯多于原壤和方壤,即種過一茬天麻后土壤中真菌數量增多。孫雪婷等[47]基于前人研究探討三七連作障礙研究進展,證明三七連作障礙產生的原因并非單一,主要與根際土壤微生物群落變化有關,此外還與土傳病蟲害的增加、化感物質的積累和三七本身的自毒物質有關,本研究主要聚焦天麻不同種植土壤的真菌群落結構,種過一年天麻后土壤中病原菌增多,再種植方竹呈現修復作用,但具體修復機制還有待后續深入研究。柏秋月[53]基于高通量測序技術研究病害天麻內生真菌群落變化,病株天麻的真菌OTU數量增多,主要為子囊菌門 (Ascomycota)和擔子菌門 (Basidiomycota)類群,病株天麻內致病真菌增加,而本研究通過開展天麻種植前后土壤真菌群落結構的變化,表明3組土樣中真菌主要類群為Ascomycota、Basidiomycota和Mortierellomycota 3門真菌,其中Ascomycota真菌豐度普遍最大,一麻壤、方竹壤和原壤3組樣本特有真菌OUT依次降低。大量中草藥連作土壤微生物研究顯示,病原菌增殖是導致作物連作障礙的主要元兇[41-52]。本研究中3組樣本真菌在門、綱、目分類水平下相對豐度差異較小,在科、屬分類水平下相對豐度差異較大,屬分類水平下天麻種植土壤原壤中優勢菌屬為Clitocybe、Solicoccozyma和Spirosphaera,一麻壤中優勢菌屬為Clavulinopsis和Rosellinia,方壤中優勢菌屬為Trichoderma;前人研究表明部分Rosellinia真菌易引起植物病害[54-55],而Trichoderma多用于生防菌株篩選,可有效抑制病原真菌的增殖[56],故推測種植天麻后種方竹有改善土壤病原菌增多的作用。

4 結 論

天麻土壤樣品中優勢真菌主要是子囊菌門 (Ascomycota)、擔子菌門 (Basidiomycota)和被孢霉門 (Mortierellomycota)3門真菌。對比3組樣本特有真菌OTU從大到小排序為一麻壤>方竹壤>原壤。各組樣本中優勢真菌存在差異,原壤中主要優勢菌為Clitocybesp.、Solicoccozymasp.和Spirosphaerasp.,一麻壤中主要優勢菌為Clavulinopsissp.和Roselliniasp.,方壤中主要優勢菌為Trichodermasp.。種植天麻后的土壤與原壤相比病原真菌成為優勢菌,且真菌種類及OTUs顯著高于原壤。