楊葉肖槿內生真菌多樣性和抑菌活性研究

宋靜靜,陸柳琳,黎俊杰,趙天義,彭春艷,曹宏明,邱清華,賈紀鑫,龔 斌

(1.廣西北部灣海洋生物多樣性養護重點實驗室,廣西 欽州 535011;2.北部灣大學,廣西 欽州 535011;3.欽州市農業技術推廣中心,廣西 欽州 535099)

【研究意義】紅樹林是一組生長在熱帶和亞熱帶潮間帶河口地區的耐鹽植物物種,具有獨特的生態系統,可分為紅樹和半紅樹植物[1-2]。楊葉肖槿(Thespesiapopulnea)是錦葵科(Malvaceae)肖槿屬(Thespesia)的一種半紅樹藥用植物[3],具有抗菌[4]、抗氧化[5]、抗糖尿病[6]、抗高血脂[7]、抗腫瘤[8]、保護肝臟[9]等多種藥理活性。內生真菌是植物微生態系統的重要組成部分,廣泛存在于植物的健康組織中,能誘導植物系統抗性[10]。紅樹林內生真菌能夠耐受多種脅迫,并通過產生大量具有特殊生物功能的代謝物而表現出較強的生物活性[11-12]。根據特殊生境植物生長特點分析其內生真菌的多樣性,篩選出優勢菌株和特有菌株,是挖掘具有生防作用及其他功能性作用菌株的基礎。基于楊葉肖槿傳統藥用價值研究其內生真菌資源,并篩選出具有生物防治潛能的內生真菌,可豐富天然化合物及工程微生物資源,為現代農業高質量發展提供理論參考。【前人研究進展】研究表明,來自特殊生態位的內生真菌具有特定種類和功效,開發潛力巨大[13]。目前已從紅茄苳(Rhizophoramucronata)[14]、海蓮(Bruguierasexangula)[15]、木欖(B.gymnorhiza)[16]、紅海蘭(Rhizophorastylosa)[17]、秋茄(Kandeliacandel)[18]等紅樹植物中分離到多種具有抑菌活性的內生真菌。其中,紅茄苳內生真菌對植物病原真菌腐皮鐮刀菌(Fusariumsolani)有較強的抑菌活性[19];海蓮內生真菌對植物病原菌灰葡萄孢(Botrytiscinerea)和煙草疫霉(Phytophthoranicotianae)均表現出較強的抗真菌活性[20];從木欖中分離出對金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)具有抑菌活性的內生真菌[16];從紅海欖中分離到對銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌(Escherichiacoli)和白色念珠菌(Canidiaalbicans)有較強抑菌活性的內生真菌[17];從秋茄中分離獲得對大腸桿菌和銅綠假單胞菌有抑菌活性的內生真菌[18]。在半紅樹植物中,從黃槿(Hibiscustiliaceus)中分離出對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有抑菌活性的內生真菌[21];在闊苞菊(Plucheaindica)中分離獲得對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)和醋酸鈣不動桿菌(Acinetobactercalcoaceticus)具有抗菌作用的內生真菌[22];從苦檻藍中篩選到的內生真菌對尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)、炭疽菌(Colletotrichum)等植物病原真菌有明顯的抑制作用[23-25]。楊葉肖槿是一種傳統半紅樹藥用植物,目前對其內生真菌及活性物質的研究非常有限。肖勝藍等[26]從楊葉肖槿中篩選到8株內生真菌,其中1株對大腸桿菌表現出較強抑菌活性;林愛玉等[27]從楊葉肖槿中篩選到12株內生真菌,其中有2株對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌有較強的抑菌活性;Tang等[28]從楊葉肖槿中篩選到的內生真菌TM-Y1-1對香蕉炭疽病菌有抑制活性。【本研究切入點】前人對楊葉肖槿內生真菌的鑒定主要是依據形態學特征,采用分子生物學方法對楊葉肖槿內生真菌多樣性進行的分類研究鮮見報道,且目前對楊葉肖槿內生真菌抑菌活性的報道不多,僅有少量研究表明其對大腸桿菌、金黃色葡萄球、白色念珠菌和香蕉炭疽病菌有抑菌活性,對其他病原菌的抑菌活性研究鮮見報道。【擬解決的關鍵問題】采用形態學和分子生物學相結合的方法對楊葉肖槿內生真菌進行多樣性分析,并用8種指示菌對其進行抑菌活性篩選,為紅樹林內生真菌抗菌藥物的開發及其在農業病害防治上的應用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集和預處理

樣品采自廣西欽州市欽州港區仙島公園(108°60′ E,21°76′ N)。采集楊葉肖槿植物的莖、葉和樹皮組織,用自來水洗去表面的泥土和灰塵,然后在無菌操作臺上進行表面消毒。首先將樣品浸泡于75%酒精3～5 min,放進3%～5%次氯酸鈉溶液30 s,再用無菌水沖洗干凈,待洗凈后在無菌操作臺上放入干燥滅菌的培養皿中晾干備用。

1.2 培養基制備

PDA 培養基(真菌培養):去皮馬鈴薯200.0 g,加800 mL蒸餾水煮30 min,加葡萄糖20.0 g,氯霉素0.1 g,瓊脂15.0 g,定容至1 L,調pH 至6.0。

LB培養基(細菌培養):稱取蛋白胨10.0 g,酵母膏5.0 g,NaCl 10.0 g,蒸餾水定容至1 L,調pH 至7.0。

1.3 內生真菌培養及分離純化

將處理過的莖、葉和樹皮組織用無菌剪刀剪成5 mm×5 mm小塊,各選出3個組織塊印在PDA培養基上,作為陰性對照。然后將組織塊分別貼于PDA培養基上,置于28 ℃的恒溫培養箱倒置培養10～15 d,定期觀察培養基生長情況,篩選生長良好的菌株。待植物組織的切口處有菌絲出現時,挑取生長良好菌絲的邊緣部分,轉接到純化培養基上進行培養,經過多次分離純化后得到的菌株接種于PDA斜面作為保種,4～8 ℃冰箱保存備用。

1.4 菌株鑒定

將菌株接種至PDA培養基上,置于28 ℃培養箱中培養。于菌株生長的最佳時期觀察菌落顏色、大小、性狀、生長情況、菌絲體、孢子的形態特征和表面特征,結合《真菌鑒定手冊》[29]進行鑒定。

1.5 內生真菌DNA提取

將分離純化得到的內生真菌接種到斜面PDA培養基上,活化后接種至液體PDA培養基中,置于28 ℃的搖床培養6～7 d,取出后裝進離心管中,12 000 r/min離心5 min,取200 mg菌絲,用研磨棒研磨成勻漿狀。根據真菌DNA提取試劑盒(Solarbio)參照說明提取楊葉肖槿的內生真菌DNA。

1.6 ITS rDNA序列分析

使用通用引物ITS1/ITS4(ITS1:5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′; ITS4: 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)擴增真菌ITS rDNA序列[30]。PCR擴增反應體系:2×TaqMix 25.0 μL,DNA模板2.0 μL,ITS1/ITS4引物各1.0 μL,ddH2O補足至50.0 μL。擴增程序:94 ℃預變性3 min;94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,進行30次循環;72 ℃延伸10 min。擴增完成后,每個樣品取3 μL進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。將正確擴增的PCR產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。測序得到的ITS rDNA序列通過NCBI數據庫中BLASTN進行同源性檢索,通過對比得出與其相似性最高的核酸序列,下載相似性較高的核酸序列,用MEGA 7.0軟件構建系統發育進化樹。

1.7 內生真菌多樣性數據分析

通過分離率(Isolation frequency,IF)對楊葉肖槿組織樣品中內生真菌的豐度進行分析,以Shannon-Wiener多樣性指數(H′)和Margalef豐富度指數(R)進行多樣性分析, 使用均勻度指數(E)對菌群分布的均勻程度進行分析。相關計算公式如下:

IF=內生真菌菌株數/菌株總數

H′ =-∑Pi×lnPi

R=(S-1)/Log2(N)

E=H′/ln(S)

式中,Pi為某種內生真菌菌株數占全部內生真菌菌株數的比例,S為樣品中菌種總數,N為個體總數。

利用Excel 2021和IBM SPSS Statistics等軟件對數據進行統計和分析。用單樣本T檢驗(S)對楊葉肖槿不同部位的IF、H′、R和E進行分析。

1.8 內生真菌的抗菌活性篩選

1.8.1 內生真菌抗真菌活性篩選 選用從柿樹、核桃、荔枝分離的炭疽菌(Colletotrichum)、香蕉枯萎病菌尖孢鐮刀菌古巴專化型FOC1(Fusariumoxysporumf.sp.cubense1)和FOC4(Fusariumoxysporumf.sp.cubense4)、黃瓜瓜鏈格孢菌(Alternariacucumerina),以及白骨壤內生真菌鏈格孢菌(Alternariaalternata)作為指示菌,在35 ℃恒溫箱中,用LB培養基通過平板對峙法[31]對內生真菌提取物進行抗真菌活性篩選。采用十字交叉法[32]測定指示菌單獨培養的菌落半徑(Rc)和對峙培養的趨向半徑(Rp),計算抑菌率,得出內生真菌對指示菌的抑制效果。

抑菌率=(Rc-Rp)/Rc×100%

黃瓜瓜鏈格孢菌、白骨壤內生真菌鏈格孢菌由北部灣海洋微生物實驗室分離保藏;柿樹炭疽菌、核桃炭疽菌、荔枝炭疽菌和香蕉枯萎病菌FOC1和FOC4由廣西農業科學院植物保護研究所提供。

1.8.2 內生真菌抗細菌活性篩選 選用羅非魚海豚鏈球菌(Streptococcusiniae)為指示菌,通過濾紙片法[33]對楊葉肖槿內生真菌提取物進行抗細菌活性篩選。先活化指示菌,采用接種針挑取單菌落接種至小瓶培養基中,置于搖床中培養1 d,用涂布器將細菌菌液均勻涂布于培養基上,再以直徑6 mm的濾紙片蘸取內生真菌提取液貼在培養基上,用濾紙蘸取不含內生真菌提取物的乙酸乙酯溶液為陰性對照,培養并觀察抑菌情況,后續測量抑菌圈大小,記錄試驗數據。海豚鏈球菌由北部灣海洋微生物實驗室分離保藏。

2 結果與分析

2.1 楊葉肖槿內生真菌的分離情況

從楊葉肖槿的莖、葉、樹皮組織中共分離純化獲得60株內生真菌,結合《真菌鑒定手冊》[30]進行形態學鑒定,分屬于5個屬。楊葉肖槿部分內生真菌菌落見圖1。其中,楊葉肖槿樹皮組織分離到的菌株最多,共分離到4個屬23株真菌,占總分離量的38.33%;其次為葉片組織,共分離到4個屬19株真菌,占總分離量的31.67%;從楊葉肖槿的莖組織分離到4個屬共18株真菌,占總分離量的30.00%(表1)。

表1 楊葉肖槿不同組織中內生真菌屬的組成Table 1 Composition of endophytic fungi genus in different tissues of T.populnea

圖1 楊葉肖槿部分內生真菌菌落特征Fig.1 Characteristics of partial endophytic fungal colonies of T.populnea

2.2 楊葉肖槿內生真菌的分子生物學鑒定

通過BLASTN對分離到的60株內生真菌的ITS rDNA序列進行分析。結果表明,60株內生真菌都屬于子囊菌門的盤菌亞門,涵蓋4個目5個屬。其中,Y1-11菌株與已知真菌ITS rDNA參考序列的相似性只有87.68%;Y1-39、Y1-50、Y2-58菌株與已知真菌ITS rDNA參考序列的相似性均低于90.00%;J2-30、Y3-37、Y1-47、Y3-53、P2-24、P2-25、P3-33、P3-44與已知真菌ITS rDNA參考序列的相似性均低于95.00%,可能是潛在新種;其余內生真菌菌株與已知真菌ITS rDNA參考序列的相似性均在95.00%以上,最高為99.96%,多樣性較豐富(表2)。

表2 楊葉肖槿內生真菌ITS rDNA序列的BLASTN分析Table 2 BLASTN analysis of ITS rDNA sequence of endophytic fungi in T.populnea

用MEGA7.0軟件構建系統發育進化樹(圖2),結果表明這60株真菌聚類為5個分支。P2-26、P2-25、J2-19、P2-24、P1-28、P1-60、P1-14、P3-1、P1-7、J1-20、J2-56、J2-6、P1-43、P1-10、P2-55、P2-36、P2-5、P2-31、P1-46、P1-51、P2-4、Y3-35、Y3-49、Y3-52、Y2-61、Y3-15、Y2-42、P2-40、Y3-48這29株菌株屬于炭疽菌屬,與C.tropicale、C.aeschynomenes、C.fructicola、C.queenslandicum、C.aotearoa等菌株構成一個支持率為99%的分支;J2-29和J2-30菌株屬于小隱孢殼屬,與C.amistadensis菌株構成一個支持率為99%的分支;Y3-53、Y3-37、J1-45、J2-2、J2-18、J2-32、J2-57、P1-27、P1-34、J2-12、J1-16、J2-17、J1-38、P2-13、Y2-62、Y2-3這16株菌株屬于間座殼屬,與D.pseudomangiferae、D.arengae、D.limonicola、D.oculi等菌株構成一個支持率為95%的分支;P3-54、Y3-59、Y3-22、Y3-23這4株菌株屬于亞隔孢殼屬,與參考菌株D.keratinophila、D.prosopidis構成一個支持率為100%的分支;P3-33、P3-44、J1-9、J3-41、Y1-11、Y1-47、Y2-58、Y1-39、Y1-50這9株菌株屬于葡萄座腔霉屬,與B.agaves、B.fabicerciana、B.fusispora等菌株構成一個支持率為98%的分支。

圖2 基于楊葉肖槿內生真菌ITS rDNA序列構建的系統發育進化樹Fig.2 Phylogenetic tree based on ITS rDNA sequence of endophytic fungi in T.populnea

2.3 楊葉肖槿內生真菌的多樣性

分離純化獲得的60株內生真菌分屬于5個屬25個種,其中炭疽菌屬(Colletotrichum)和間座殼屬(Diaporthe)是優勢菌屬,分別包含29和16株真菌,分離率為48.33%和26.67%;葡萄座腔霉屬(Botryosphaeria)含有9株真菌,分離率為15.00%;亞隔孢殼屬(Didymella)和小隱孢殼屬(Cryptosporella)分別含有4和2株真菌,分離率為6.70%和3.33%。莖組織分離到的內生真菌包括葡萄座腔霉屬、炭疽菌屬、小隱孢殼屬和間座殼屬,小隱孢殼屬只在莖組織中分離到,在葉和樹皮中未分離到。葉片組織分離到的有炭疽菌屬、亞隔孢殼屬、間座殼屬和葡萄座腔霉屬內生真菌。樹皮組織共分離純化出23株菌株,其中17株為炭疽菌屬,亞隔孢殼屬、間座殼屬和葡萄座腔霉屬也有少量分布,分別為1、3和2株(表3)。

表3 楊葉肖槿內生真菌在各組織的分布情況Table 3 Distribution of endophytic fungi in various tissues of T.populnea

楊葉肖槿莖、葉、樹皮組織分離的內生真菌H′分別為2.11、2.32和2.34,其中樹皮組織內生真菌的多樣性最高,但三者之間無顯著差異(P>0.05,下同);R分別為2.20、2.54和2.87,R的變化規律與H′類似,樹皮組織分離內生真菌R也高于莖和葉,且三者之間不存在顯著差異。楊葉肖槿莖、葉和樹皮組織分離內生真菌之間的E則存在顯著差異(P<0.05,下同),其中葉組織分離內生真菌E最高(0.94),其次為莖組織(0.92),樹皮組織最低(0.89)(表4)。

表4 楊葉肖槿不同組織中的內生真菌多樣性Table 4 Diversity of endophytic fungi in various tissues of T.populnea

2.4 楊葉肖槿內生真菌的抗真菌和抗細菌活性

選用柿樹炭疽菌、核桃炭疽菌、荔枝炭疽菌、香蕉枯萎病菌FOC1和FOC4、黃瓜瓜鏈格孢菌、白骨壤內生真菌鏈格孢菌、海豚鏈球菌做為指示菌,對分離得到的60種楊葉肖槿內生真菌進行抗真菌和抗細菌活性篩選。結果顯示,共有9株內生真菌對指示菌顯示出抑菌活性,其中炭疽菌J1-20(C.arecicola)對8種指示菌均表現出較強的抑菌活性。J1-20菌株對6種植物病原菌的抑菌率分別是39.39%、25.00%、19.10%、32.43%、28.20%和89.00%,對白骨壤內生真菌鏈格孢菌的抑菌率為74.19%(表5),同時對海豚鏈球菌抑菌圈大小為21 mm,說明J1-20菌株具有廣譜抑菌活性(圖3),有較好的開發潛力。其他菌株中,Y1-11菌株對白骨壤內生鏈格孢菌的抑菌率較強,達80.64%,但對其他真菌和細菌抑菌活性都較弱。統計分析顯示,除J1-20菌株對核桃炭疽菌的抑菌率極顯著低于J2-30(P<0.01,下同),對香蕉枯萎病菌FOC1的抑菌率極顯著低于P2-24菌株外,J1-20菌株對柿樹炭疽菌、荔枝炭疽菌(P1-46菌株除外)、香蕉枯萎病菌FOC4、黃瓜鏈格孢菌、白骨壤內生鏈格孢菌(Y1-11菌株除外)、海豚鏈球菌6種病原菌的抑菌率均極顯著高于其他菌株。

表5 楊葉肖槿內生真菌的抗真菌和細菌活性 Table 5 The antifungal and antibacterial activities of endophytic fungi from T.populnea

A:柿樹炭疽菌;B:核桃炭疽菌;C:荔枝炭疽菌;D:香蕉枯萎病菌(FOC1);E:香蕉枯萎病菌(FOC4);F:黃瓜瓜鏈格孢菌;G:白骨壤內生真菌鏈格孢菌;H:海豚鏈球菌。A:Colletotrichum of D.kaki; B: Colletotrichum of J.regia; C:Colletotrichum of L.chinensis; D:F.oxysporum f.sp.cubense 1; E:F.oxysporum f.sp.cubense 4; F:A.cucumerina; G:A.alternata; H:S.iniae.圖3 J1-20菌株的抗真菌和抗細菌活性Fig.3 Antifungal and antibacterial activities of strain J1-20

3 討 論

本研究從半紅樹藥用植物楊葉肖槿中分離到60株內生真菌,利用形態學和分子生物學相結合的方法進行分類鑒定,分屬于5個屬25個種。其中有12株內生真菌與NCBI數據庫中已知ITS rDNA序列相似性低于95.00%,可能是潛在新種,有待進一步研究。楊葉肖槿的內生真菌多樣性豐富,以炭疽菌屬和間座殼屬為優勢種群,其次為葡萄座腔霉屬、亞隔孢殼屬和小隱孢殼屬。肖勝藍等[26]從楊葉肖槿分離到8株內生真菌,但因其不產孢,尚未明確株菌的分類;林愛玉等[27]在楊葉肖槿中分離到5株內生真菌,分屬于鐮孢屬和青霉屬。以上2位學者均僅是通過形態學特征對楊葉肖槿內生真菌進行鑒別,可能是因為鐮孢屬和青霉屬真菌易產孢,較易通過形態學觀察進行鑒別,而其他內生真菌不容易產孢,單純依據形態學的鑒定方法較難對其進行準確分類。本研究首次準確地鑒定出藥用半紅樹植物楊葉肖槿內生真菌的類型及其在不同組織的分布狀況等,為楊葉肖槿內生真菌多樣性的研究提供了參考數據。

抗真菌活性結果顯示,J1-20菌株對柿樹炭疽菌、核桃炭疽菌、荔枝炭疽菌、香蕉枯萎病菌FOC1和FOC4、黃瓜瓜鏈格孢菌、白骨壤內生真菌鏈格孢菌和海豚鏈球菌均表現出較強的抑菌活性。J1-20菌株屬于炭疽菌屬真菌。盡管炭疽菌屬的許多病原菌都是植物病原體,但C.arecicola能產生多種具有不同生物活性的次生代謝物。至今,已經報道了至少109種炭疽菌的次生代謝物,主要包括含氮代謝物、固醇、萜烯、吡酮、酚類和脂肪酸等[34]。C.arecicola是膠孢炭疽菌(C.gloeosporioides)的一個復合種[35],主要分布在澳大利亞、印度、新西蘭和中國臺灣,在全緣佛塔樹(Banksiamarginata)和新西蘭牡荊(Vitexlucens)等植物上引起過炭疽病[36-38],但C.arecicola作為植物內生真菌的有關研究較少。Hsiao等[39]從金石榴(Brediaoldhamii)的葉片中分離到C.arecicola的一個內生真菌菌株(BCRC 09F0161),該菌株產生18種次生代謝物,均能抑制活化巨噬細胞活性氧自由基(NO)的產生,且無細胞毒性,但針對這些次級代謝產物的抑菌活性研究還較少。目前已從膠孢炭疽菌中分離到一些具有較強抗真菌和抗細菌活性的次生代謝產物[40-41],推測J1-20菌株中應該也含有一些抑菌效果較好的化合物,可作為新的生物農藥來源進行深入研究開發。

本研究中,僅在楊葉肖槿的樹皮組織中分離到J1-20菌株,在莖段和葉片中并未分離到J1-20菌株。楊葉肖槿樹皮中的生物活性物質可治療痢疾、痔瘡及各種皮膚病[7, 42],表明楊葉肖槿內生真菌的活性可能與宿主植物的藥理活性有關,從植物的藥用部位分離內生真菌獲得含有相似藥理活性菌株的可能性更大[43]。楊葉肖槿的樹皮內含有生物堿、聚酮、萜類、甾醇類、蒽醌類等多種活性成分,且顯示出良好的抗菌作用[7, 44]。本研究中分離到的J1-20菌株也來自樹皮,故推測J1-20菌株也可能含有類似的次生代謝產物。下一步將對J1-20菌株的活性成分進行分離鑒定,并對其抗菌機制進行研究,有望開發出新的生態友好型抗菌藥物。

4 結 論

本研究從半紅樹藥用植物楊葉肖槿中共分離到60株內生真菌,分屬于5個屬25個種,以炭疽屬和間座殼屬為主。分離的內生真菌多樣性豐富,且在各組織中分布均勻。J1-20菌株對柿樹炭疽菌、核桃炭疽菌、荔枝炭疽菌、香蕉枯萎病菌FOC1和FOC4、黃瓜瓜鏈格孢菌、白骨壤內生真菌鏈格孢菌和海豚鏈球菌有抗菌作用,有進一步開發利用的潛力。