不同覆膜方式對白及生長及根際土壤可培養細菌遺傳多樣性的影響

徐歆雅, 陳 晴, 吳郡穎, 戴林剛, 溫宇珂, 齊浩然, 余秀梅, 陳 強

(四川農業大學資源學院,成都 611130)

【研究意義】隨著全球糧食需求的不斷增長,塑料地膜覆蓋廣泛應用于農業生產中,能夠有效抑制雜草生長,降低化學除草劑的使用。據統計,2024年我國地膜覆蓋面積預計達到2.2×105km2[1]。然而,塑料地膜殘留物常被丟棄在農田中污染土壤,破壞土壤微生態,從而對環境和人類健康造成不良影響[2]。可降解地膜是解決殘膜污染的重要途徑之一,研究其對土壤肥力特征及細菌群落結構的影響,可為應用和推廣可降解地膜提供理論參考。【前人研究進展】地膜覆蓋可改善農田水文過程,具有增加作物蒸騰、土壤溫度、土壤含水量,防治雜草的功效[3],已在玉米[4]、大豆[5]、水稻[6]、小麥[3]等農作物種植中廣泛應用,我國地膜覆蓋面積位居世界第一[7],但地膜的使用也帶來了嚴重的“白色污染”。由于農用地膜由聚乙烯制成,分解難度大,長期使用后在土壤中大量殘留難以降解;另一方面,土壤中殘留地膜在分解過程中產生的微塑料,既破壞土壤原有結構,降低通透性,阻礙土壤水分入滲和溶質轉移,影響土壤吸濕性[8-9],又影響土壤理化性質及物質循環,改變土壤微生物群落結構,進而影響土壤生態系統健康,損害作物生長發育[10-11]。可降解地膜因其生物可降解特性,可望有效解決殘留地膜“白色污染”問題,實現農業的可持續發展,因而受到廣泛關注。申麗霞等[12]研究表明,可降解地膜覆蓋能顯著提升土壤水分含量,加快玉米發育進程,不同生育時期株高、葉面積及地上部干物質積累量顯著上升(P<0.05);在張占琴等[7]研究中,新疆地區應用可降解地膜覆蓋種植棉花有效促進棉株生長,產量上升5.81%(P<0.05);Huang等[13]發現,黃土高原應用生物降解膜覆蓋種植玉米產量顯著增加93.30% (P<0.05)。【本研究切入點】白及由于植株小,栽培期間極易發生草害,采用覆蓋地膜的方式不僅能抑制雜草生長,又可提高白及抗寒能力,加快種子萌發,增加塊莖干重及有效成分,促進白及植株發育[14-15]。但有關可降解生物質膜對白及土壤肥力特征的影響及白及根際可培養細菌群落變化的研究較少,為此,本文研究不同覆膜處理對白及種植雜草去除率、白及農藝性狀、根際土壤理化性質以及土壤可培養細菌群落組成的影響。【擬解決的關鍵問題】通過研究生物基質可降解膜對白及種植中的農藝性狀、土壤理化和微生物特性變化,為生物基質可降解膜應用于白及種植提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗地 試驗地位于成都市崇州市榿泉鎮四川農業大學現代農業研發基地(103°39′ E,30°33′ N)。供試土壤為潴育型水稻土,土壤基礎養分含量為有機質2.72%、堿解氮47.08 mg/kg、土壤有效磷13.76 mg/kg、速效鉀491.72 mg/kg。

1.1.2 試驗材料 供試品種為紫花三叉白及,從市場購買生長均勻、苗高10 cm 左右的白及苗。生物質可降解膜(簡稱生物質膜)由四川農業大學資源學院農業微生物資源與應用課題組和深圳市澤清源科技開發有限公司聯合研制,采用甘蔗渣、食用菌菌渣為原料,接種專用微生物菌種生產而成[16]。生物質膜規格長×寬=1.2 m×0.6 m,厚度5 mm;其養分組成為有機質含量632 g/kg,全氮、全磷、全鉀含量分別為12.58、8.52、31.67 g/kg。塑料地膜為銀黑雙色聚乙烯地膜,厚度0.012 mm;復混肥料(20-9-11)為臺沃科技集團生產,從市場購買。

1.1.3 試驗設計 田間試驗設置3個處理:常規種植不覆膜(CK)、覆蓋生物質膜(BM)、覆蓋聚乙烯地膜(PM)。試驗采用隨機區組排列,各重復3次,共9個小區,每個小區20 m2。于2020年9月進行,試驗前按有機肥300 kg/667 m2、復混肥料50 kg/667 m2施入基肥,均勻整地備用。覆膜試驗中,先將生物質膜、塑料膜覆蓋于各小區,按株行距20 cm×20 cm打孔,隨后種植白及幼苗。2021年4月和9月根據白及的長勢進行追肥。5—9月搭建高度為1.5～2.0 m的遮陽網,遮陽網透光率為30%～50%。

1.2 研究方法

1.2.1 不同處理除草效果測定 于2021年5月30日、6月30日以及7月30日分別采集每個小區雜草稱重量,計算雜草去除率。

1.2.2 土壤樣品采集及處理 于2021年11月采集白及根際土壤樣品,采用多點混合法取樣,土壤樣品低溫帶回實驗室,在超凈工作臺去除石礫和動植物殘體,混勻后四分法分成2份,1份于4 ℃冰箱保存,測定土壤可培養細菌數量和分離純化;另1份經自然風干,研磨過篩后用于測定土壤理化特性。

1.2.3 白及農藝性狀分析 于2021年6月15日(白及花期),從每個試驗小區選取9株長勢均勻且具有代表性的白及苗,測定其農藝性狀[17],測定指標包括株高、葉片數、葉片長寬比、葉綠素相對含量,其中植株的葉綠素相對含量采用活體葉綠素儀進行即時測量(單位spad)。

1.2.4 土壤溫度 于2021年8月初進行測定,每天8:00、14:00、18:00,每個小區隨機選取3個位置,采用地溫計測定不同處理10～15 cm土層溫度,計算平均值。

1.2.5 土壤理化特性測定 分別測定不同處理白及根際土壤理化性質[18]。土壤有機質測定采用重鉻酸鉀容量法;土壤堿解氮測定采用堿解擴散法;土壤有效磷測定采用0.5 mol/L NaHCO3浸提-鉬銻抗分光光度法;土壤速效鉀測定采用1 mol/L NH4OAc-火焰光度法。

1.2.6 可培養細菌分離純化 采用稀釋平板法分離白及土壤細菌[19],待菌落出現后,根據形態差異挑取單個菌落進行分離、純化、鏡檢獲得純菌株,LB斜面培養基,4 ℃保存備用。

1.2.7 可培養細菌遺傳多樣性分析 采用Chelex-100法提取DNA[20],利用BOX引物(5’-CTACGGCAAGGCGCTGACG-3’)進行擴增,產物經1.5%瓊脂糖,80 V、電泳2 h,Bio-Rad凝膠成像系統掃描得到BOXA1R指紋圖譜。根據BOXA1R遺傳群結果選取代表菌株,以27f (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3’)、1492r (5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’) 為PCR引物,擴增16S rRNA基因片段,送至上海生工有限公司測序[21]。

1.2.8 數據分析 實驗數據采用 Microsoft Excel 2019進行數據計算,顯著性差異均采用單因素方差分析(One-way ANOVA)和 Duncan分析,結合 LSD 法進行多重比較;采用NTSYS軟件對BOXA1R指紋進行非加權平均連鎖法(UPGMA)聚類分析;代表菌株系統發育樹構建采用 MEGA 7.0 鄰接法(Neighbour-joining)。

2 結果與分析

2.1 不同處理雜草去除效果

2021年5—7月各處理的雜草生長量及除草率見表1,結果表明,覆膜種植白及可顯著控制雜草生長,以BM處理控制雜草效果最佳,優于PM處理。尤以2021年5月的雜草去除率最高,為99.74%。

表1 不同處理除草效果Table 1 Weeding effect under different treatments

2.2 不同處理白及農藝性狀

對不同處理白及農藝性狀進行測定(表2),結果表明,BM處理的白及植株高度較CK處理顯著提高68.36%(P<0.05),PM處理高于CK,但差異不顯著。不同覆膜處理均可增加白及葉片數,但差異不顯著。

表2 不同處理白及農藝性狀Table 2 Agronomic traits of B. striata under different treatments

白及葉片的長寬比和葉綠素相對含量均表現為BM>PM>CK。與CK、PM相比,BM處理葉片長寬比分別增加26.55%、22.03%,葉綠素相對含量增加21.92%、19.20%,差異顯著(P<0.05)。

2.3 不同處理10～15 cm土層溫度變化

由圖1可知,與CK處理相比,8月PM處理10～15 cm土層平均土溫最高,升高幅度為1.0～1.7 ℃,日均增溫幅度高于1.7 ℃的天數達12 d;BM處理日均溫度升高不明顯,增幅僅0.0～0.7 ℃。說明BM處理有利于高溫季節保持較適宜的土層溫度。

圖1 不同處理10～15 cm土層溫度變化Fig.1 Temperatures changes at 10-15 cm soil layers under different treatments

2.4 不同處理土壤理化特性變化

由表3可知, 與CK、PM相比,BM處理可顯著提高土壤主要養分含量(P<0.05)。土壤有機質含量顯著增加26.58%、27.53%,堿解氮含量顯著增加35.34%、33.81%,有效磷含量顯著增加49.80%、28.66%,土壤速效鉀含量顯著增加47.43%、15.14%。除土壤速效鉀外,CK、PM處理之間土壤養分含量無明顯差異。

表3 不同處理土壤養分含量Table 3 Soil nutrient content of different treatments

2.5 不同處理白及根際可培養細菌遺傳多樣性

2.5.1 供試菌株BOXA1R-PCR分析結果 從3種處理白及根際土壤樣品分離、純化得到78株細菌(表4),其中CK處理26株,編號為CK01～CK26;BM處理29株,編號為BM01～BM29;PM處理23株,編號為PM01～PM23。對供試細菌的BOXA1R PCR指紋圖譜進行UPGMA聚類(圖2),供試菌株間存在明顯的遺傳多樣性。所有菌株在67%相似水平處聚在一起,在89%相似水平處分為42個遺傳群,其中CK14、BM07、PM04、BM04、BM14、CK11、PM09、CK06、PM01、CK19、CK04、PM05、BM10、CK07、BM09、PM10、BM11、BM08、CK03、BM25、BM23、BM15單獨成群;其余菌株構成20個遺傳群;以遺傳群12最大,由6個菌株組成;其次為群2、22、31,各有4株細菌;群1、11、14、16、27、32則均由3株細菌組成。

圖2 供試細菌BOXA1R-PCR UPGMA聚類圖Fig.2 UPGMA dendrogram constructed by BOXA1R PCR patterns of tested bacteria

表4 供試菌株遺傳多樣性Table 4 Genetic diversity of tested strains

2.5.2 代表細菌的系統發育 基于 BOXA1R-PCR 聚類圖,選取45個代表菌株(表4)測定16S rRNA基因序列,上傳至GenBank獲得序列號,采用MEGA7.0構建供試細菌的系統發育樹(圖3)。

圖3 代表菌株16S rRNA基因序列系統發育樹Fig.3 Phylogeny tree of the representative strains constructed by 16S rRNA gene sequences

系統發育分析結果表明,白及根際土壤可培養細菌包含芽孢桿菌屬(Bacillus)、假芽胞桿菌屬(Fictibacillus)、桿菌屬(Rathayibacter)、假節桿菌屬(Pseudarthrobacter)、劍菌屬(Ensifer)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、金黃桿菌屬(Chryseobacterium),其中以芽孢桿菌屬為優勢菌,在CK、BM、PM中占比分別為76.9%、69.0%、73.9%。不同處理白及根際土壤細菌種屬分布存在差異,CK處理根際細菌在分類上屬于4屬13個種,以粘著劍菌(E.adhaerens)占優勢(15.4%);BM處理根際細菌分屬于7屬20個種,以假蕈狀芽孢桿菌(B.pseudomycoides) 占優勢(13.8%);PM處理細菌分屬于4屬13個種,以花椒芽孢桿菌(B.zanthoxyli)為優勢菌群(17.4%),此外,僅由BM處理土壤中分離獲得9個細菌類群,分別是A.guillouiae、B.subtilis、B.siamensis、B.idriensis、P.oryzihabitans、C.nepalense、C.vietnamense、E.canadensis、P.psychrotolerans。

3 討 論

花期是白及生長最旺盛的時期,也是研究白及農藝性狀的最佳時間[17]。本研究對不同處理白及花期農藝性狀的測定結果表明,覆膜處理可以顯著增加白及株高及葉片數,且白及葉片長寬比和葉綠素相對含量表現為BM>PM>CK。較PM和BM處理葉片長寬比、葉綠素相對含量分別顯著增加22.03%、19.20%(P<0.05),說明生物基質膜覆蓋效果優于塑料膜覆蓋,更有利于白及生長,這與劉曉偉等[22]、Zong等[23]的研究結果一致。

作物生長受環境因子綜合影響,夏季高溫季節植株的葉綠素含量與環境溫度呈顯著負相關,白及適宜生長溫度為15～28 ℃[24]。本研究對夏季不同處理10～15 cm土層溫度進行測定,以PM處理日均溫最高,持續時間最長,BM處理與CK相近,這與Tao等[25]的研究結果一致。PM處理采用銀黑雙色地膜覆蓋,由于保溫性能好[26],因而10～15 cm土層溫度顯著高于其它2個處理;BM處理溫度升高不明顯,這是由于生物基質膜以秸稈為原料,利用真菌菌絲體扭結將植物纖維形成網狀結構[27-28],厚度約5 mm,高溫季節表現出良好的隔熱效果,有效地控制了地溫升高。BM處理10～15 cm土層溫度低于PM處理,為白及生長提供了適宜的環境條件。

土壤養分是土壤肥力的重要指標,直接影響作物生長發育。研究表明,覆膜或秸稈增加土壤有機碳、堿解氮、速效鉀含量,秸稈覆蓋效果最佳[29],生物可降解地膜覆蓋可顯著提高馬鈴薯種植土壤養分含量[30]。本研究中,土壤養分含量表現為BM>PM>CK,BM土壤養分含量顯著高于其他處理(P<0.05),PM與CK間差異不明顯(除速效鉀外)。BM處理土壤有機質、堿解氮、有效磷和速效鉀含量分別比PM顯著增加27.53%、33.81%、28.66%和15.14%。這主要由于生物質膜分解后的養分進入土壤,土壤養分含量增加,增加土壤微生物多樣性,提高土壤活性,進一步促進土壤緩效養分釋放所致。

土壤微生物多樣性及群落結構與土壤質量密切相關[31]。本研究中,各處理土壤可培養細菌中,芽孢桿菌(Bacillussp.)均為優勢菌群,CK、BM處理中的數量為20個,PM處理為17個,占比分別為76.9%、69.0%、73.9%。此外,從BM處理中分離獲得的枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、暹羅芽孢桿菌(B.siamensis)、棲稻假單胞菌(P.oryzihabitans)、尼泊爾金黃桿菌 (C.nepalense)等9個細菌種群被報道具有促生、抑病、抗逆等多種有益功能,這些菌株在CK和PM處理土壤中未能分離獲得。相關研究表明,B.subtilisB4能有效減少花生土傳病害,促進花生根系生長[32];B.siamensisB-612能夠降低稻瘟病發病率[33],B.siamensisYB-1631可抑制小麥冠腐病,幼苗根系鮮重顯著增加20.94%[34];菌株P.oryzihabitansEP4具有溶磷、產1-氨基環丙基-1-羧酸酯(ACC)脫氨酶等多種促生性能[35],而在Daniel等[36]的研究中,P.oryzihabitansPGP01有利于促進梨屬體外生根及植株生長;Chryseobacteriumsp. 可抑制花生莖腐病,花生產量顯著增加21%(P<0.05)[37],同時也具有降解塑料地膜的潛力[38]。可見,覆蓋生物質膜處理可以豐富根際細菌多樣性,增加有益微生物比例,從而改善根際微生態。

4 結 論

與地膜覆蓋和常規種植相比,生物質膜能有效抑制雜草生長,提高土壤有效養分含量,改善土壤理化性質,增加土壤細菌遺傳多樣性,從而促進白及生長。本研究分析了不同處理土壤可培養細菌多樣性變化,所分離細菌的促生特性、田間應用效果等方面值得深入研究,同時可采用高通量測序技術進一步探討不同覆膜處理對白及種植土壤微生物群落組成變化特征。