小麥赤霉病生防菌XH-1的鑒定及防治效果

王婷婷,魏淑紅,宋 波,董潤(rùn)鑫,許有嬪

(西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,四川 南充 637000)

【研究意義】小麥(TriticumaestivumL.)是全球重要糧食作物,其可持續(xù)發(fā)展是關(guān)乎國(guó)計(jì)民生的大事[1]。然而,小麥生產(chǎn)過(guò)程中常常會(huì)受到非生物(如干旱、高溫、鹽度、寒冷等)和生物脅迫(病毒、細(xì)菌、真菌、昆蟲等),導(dǎo)致各種病害發(fā)生[2]。其中由禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)引起的小麥赤霉病(Fusarium head blight,FHB)被稱為小麥的“癌癥”,近年來(lái)該病害在我國(guó)各地頻繁發(fā)生[3],據(jù)統(tǒng)計(jì),2012—2018年,每年有超過(guò)4×106hm2的小麥發(fā)生赤霉病,約占小麥產(chǎn)區(qū)總面積的23%,給農(nóng)民帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失,對(duì)糧食生產(chǎn)安全構(gòu)成了嚴(yán)重威脅[4]。為防治赤霉病,人們長(zhǎng)期使用殺菌劑,使得菌株對(duì)殺菌劑的敏感性逐漸降低,因此,迫切需要尋找一種新穎有效的赤霉病防治措施。生物防治成本低、環(huán)境友好且具有可持續(xù)防治的特點(diǎn)[5],彌補(bǔ)了化學(xué)防治帶來(lái)的環(huán)境污染和抗藥性產(chǎn)生等問(wèn)題,目前備受關(guān)注。因此,分離出1株對(duì)赤霉病具有高效防治效果的生防菌以防控赤霉病害具有很好的科研及應(yīng)用價(jià)值。【前人研究進(jìn)展】生防菌可來(lái)源于植物體內(nèi)、昆蟲共生以及與生物相關(guān)的其他各種環(huán)境[6]。目前能夠防治小麥赤霉病的生防菌涵蓋了細(xì)菌、真菌等多個(gè)種屬,如芽孢桿菌、霉菌和放線菌等[7]。當(dāng)前研究認(rèn)為,生防菌主要通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性作用、產(chǎn)生生物活性物質(zhì)、誘導(dǎo)植物防御等機(jī)制來(lái)發(fā)揮生防作用[8]。芽胞桿菌作為生防菌的一大類別,具有抗逆性強(qiáng)和抑菌譜廣等特點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于植物病蟲害防治[9]。目前國(guó)內(nèi)外已分離出一些對(duì)小麥赤霉病有防治效果的芽孢桿菌,如枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)XG-7對(duì)赤霉病有良好的抑菌性[10];D1/2[11]、DZSG23[12]能夠抑制菌絲生長(zhǎng),減緩孢子萌發(fā)、使孢子畸形;Z54[13]、AF0907[14]、B-30210[15]、RC218[16]等能降低赤霉病發(fā)病;SG6抑制菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢量及DON生產(chǎn)[17]。解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)YN201732[18]、XS-2[19]和AX-3[20]等對(duì)小麥赤霉病具有明顯的防治效果。多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)AFR0406[21]、DY04[22]和7F1[23]等也對(duì)禾谷鐮刀菌抑制效果明顯。【本研究切入點(diǎn)】盡管國(guó)內(nèi)外對(duì)生防菌相關(guān)研究已取得較大進(jìn)展,但在應(yīng)用方面尚處于起步階段,且可開發(fā)利用的生防菌資源匱乏,因此有必要挖掘新的生防菌資源。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】XH-1是否可作為赤霉病防治的有效生防菌資源?篩選禾谷鐮刀菌的高效生防菌株是小麥赤霉病生物防治的關(guān)鍵,但目前可利用的生防菌資源十分匱乏。因此,迫切需要挖掘出高效防治赤霉病的生防菌資源。為此,本研究從健康小麥周圍土壤中分離純化出常用生理小種XH-1菌株,通過(guò)鑒定其種屬分類,分析其對(duì)常用生理小種PH-1生長(zhǎng)發(fā)育及致病力的拮抗作用,探究XH-1可否作為小麥赤霉病的有效生防菌資源這一關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料培養(yǎng)

禾谷鐮刀菌菌株選用常用生理小種PH-1,由西華師范大學(xué)植物遺傳與發(fā)育生物學(xué)課題組保存,將其培養(yǎng)于PDA平板,于28 ℃恒溫培養(yǎng)3 d后,保存于4 ℃?zhèn)溆谩Ｐ←湶牧线x用南麥660,由南充市農(nóng)科院小麥所贈(zèng)送。枯草芽孢桿菌菌株XH-1,分離自四川南充市西華師范大學(xué)小麥試驗(yàn)田。

1.2 生防菌的分離與篩選

挖取小麥赤霉病病區(qū)中健康小麥植株周圍深5～15 cm的土樣,將其于無(wú)菌水中混勻,靜置10 min后吸取100 μL上清液進(jìn)行稀釋涂布于PDA培養(yǎng)基,于30 ℃培養(yǎng)1～2 d,挑取形態(tài)各異的菌落劃線純化培養(yǎng),將純化后的單菌落連續(xù)純化培養(yǎng)3次后保存?zhèn)溆谩Ｌ羧〖兓募?xì)菌接種于PDA培養(yǎng)基的1/3處,正中間接種PH-1菌株,28 ℃培養(yǎng)3～4 d后觀察細(xì)菌周圍是否產(chǎn)生抑菌帶,將有抑菌帶菌株作為生防菌資源并保存。本研究后續(xù)選用XH-1開展試驗(yàn)。

1.3 菌株XH-1的鑒定

本研究采用16S rDNA序列分析法鑒定該菌株,利用細(xì)菌通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCTGGCTCG-3’)和1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACT T-3’)擴(kuò)增XH-1菌株的16S rDNA基因序列。并將PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序,對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對(duì),使用MEGA 5.0軟件將獲得的同源序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.4 XH-1菌液與PH-1菌株的平板對(duì)峙分析

為分析XH-1菌液對(duì)禾谷鐮刀菌PH-1菌落生長(zhǎng)的影響,采用平板對(duì)峙法進(jìn)行試驗(yàn)。每個(gè)平板滴3滴1 μL的菌液形成等邊三角形的3個(gè)頂點(diǎn)(圖1),平板中央接種約2 mm×2 mm的PH-1菌絲塊,于28 ℃培養(yǎng)3 d后測(cè)量計(jì)算抑菌率,以添加PDB培養(yǎng)基作為對(duì)照。每個(gè)處理接種3個(gè)平板,設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。抑菌率=[(R平均值-r平均值)/R平均值]×100%。

圖1 平板對(duì)峙試驗(yàn)Fig.1 Experimental illustration of flat plate confrontation

1.5 菌液和孢懸液的制備

XH-1菌液:挑取XH-1菌株于3 mL PDB培養(yǎng)基中28 ℃,180 r/min搖培8～12 h作為種子液,按1∶100(種子液∶培養(yǎng)基)的比例取種子液到新的PDB

培養(yǎng)基中搖培24 h后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

PH-1的孢子懸浮液:將PH-1于PDA平板培養(yǎng)3 d,用黃色槍頭戳取6個(gè)菌絲塊置于50 mL 的CMC產(chǎn)孢培養(yǎng)基中,于28 ℃、180 r/min 條件下?lián)u培5 d后收集分生孢子,并將孢子濃度調(diào)至1×106個(gè)/mL備用。

1.6 菌株XH-1對(duì)禾谷鐮刀菌孢子萌發(fā)的影響

將XH-1菌液與1×106個(gè)/mL的PH-1孢子懸浮液按1∶1(體積比)混合,再向各混合液中加入等量的YEPD培養(yǎng)基,以無(wú)菌水與PH-1孢子懸浮液混合為對(duì)照,28 ℃、180 r/min搖培,分別在2、4、8、12和24 h時(shí)取培養(yǎng)液觀察分生孢子的萌發(fā)情況。

1.7 菌株XH-1對(duì)禾谷鐮刀菌侵染力的影響

接種前配制3份接種液,A液:PH-1孢子懸浮液與XH-1菌液按1∶1(體積比)混合;B液:PH-1孢子懸浮液與PDB液體培養(yǎng)基混合;C液:無(wú)菌水。

葉片戳傷接種:選取生長(zhǎng)4周齡大小的小麥葉片,進(jìn)行戳傷處理,在戳傷處分別接種6 μL的A、B、C液對(duì)接種后的葉片進(jìn)行保濕處理,于27 ℃下暗培養(yǎng)24 h,之后進(jìn)行光暗交替培養(yǎng)3～4 d后觀察葉片發(fā)病情況,每個(gè)處理接種15個(gè)傷口,設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。

麥穗單花滴注接種:選取處于揚(yáng)花期的小麥麥穗,分別在小穗中部小花接種A、B、C液,每個(gè)小花接種體積10 μL,每個(gè)處理接種3個(gè)小穗,并進(jìn)行套袋保濕,1周觀察麥穗發(fā)病情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株XH-1的分離與鑒定

前期通過(guò)采集健康的南麥660植株附近根際土壤,通過(guò)梯度稀釋后涂布于平板,對(duì)獲得的菌落進(jìn)行分離純化(圖2-A),將純化后的菌株接與禾谷鐮刀菌共培養(yǎng),觀察PH-1的菌落生長(zhǎng)情況。發(fā)現(xiàn)其中XH-1對(duì)PH-1的菌落生長(zhǎng)具有抑菌作用。經(jīng)革蘭氏染色觀察,菌株XH-1為革蘭氏陽(yáng)性菌,菌體為桿狀(圖2-B)。通過(guò)16S rDNA序列分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,將XH-1鑒定為枯草芽孢桿菌(圖3)。

圖2 XH-1菌株形態(tài)Fig.2 Morphology of strain XH-1

圖3 XH-1系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.3 Phylogenetic analysis of XH-1

2.2 菌株XH-1影響禾谷鐮刀菌生長(zhǎng)

為探究枯草芽孢桿菌XH-1對(duì)禾谷鐮刀菌營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的影響,進(jìn)行平板對(duì)峙試驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn),相比于對(duì)照組,接種有XH-1的PDA培養(yǎng)基中PH-1菌落生長(zhǎng)受到抑制(圖4),其抑制率為45.6%。表明枯草芽孢桿菌XH-1能抑制禾谷鐮刀菌的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng),對(duì)禾谷鐮刀菌具有拮抗作用。

圖4 XH-1菌株對(duì)禾谷鐮刀菌的平板對(duì)峙分析Fig.4 Plate confrontation analysis of strain XH-1 against F. graminearum

2.3 菌株XH-1抑制禾谷鐮刀菌的產(chǎn)孢

為探究枯草芽孢桿菌XH-1對(duì)禾谷鐮刀菌孢子產(chǎn)量的影響,利用CMC產(chǎn)孢法,將XH-1加入CMC產(chǎn)孢培養(yǎng)基中,同時(shí)加入PH-1菌絲塊,產(chǎn)孢 5 d后統(tǒng)計(jì)產(chǎn)孢量,以加入與XH-1等體積的PDA培養(yǎng)基為對(duì)照,每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)技術(shù)重復(fù),并進(jìn)行3次生物重復(fù)。結(jié)果顯示,對(duì)照組平均產(chǎn)孢量為12.1×105個(gè)/mL,加入XH-1后PH-1的產(chǎn)孢量為0(圖5)。表明枯草芽孢桿菌XH-1能夠抑制禾谷鐮刀菌的產(chǎn)孢過(guò)程。

圖5 XH-1對(duì)禾谷鐮刀菌產(chǎn)孢量的影響Fig.5 Effect of XH-1 on the spore production of F. graminearum

2.4 菌株XH-1抑制禾谷鐮刀菌孢子萌發(fā)過(guò)程

為探究枯草芽孢桿菌XH-1菌液對(duì)禾谷鐮刀菌孢子萌發(fā)的影響,將XH-1菌液加入PH-1孢子萌發(fā)誘導(dǎo)培養(yǎng)基YEPD中,以添加與XH-1菌液等體積的PDA培養(yǎng)基為對(duì)照,分別于培養(yǎng)2、4、8、12和24 h后觀察孢子萌發(fā)情況。通過(guò)顯微觀察,發(fā)現(xiàn)對(duì)照組的PH-1分生孢子從培養(yǎng)2 h后開始萌發(fā)產(chǎn)生液生菌絲(圖6-A),培養(yǎng)8 h后孢子的萌發(fā)率趨于穩(wěn)定(圖6-B)。而加入XH-1后,分生孢子的萌發(fā)被顯著抑制,且孢子出現(xiàn)異常膨大現(xiàn)象(圖6-A),直到24 h都沒(méi)有萌發(fā)產(chǎn)生液生菌絲。表明,添加X(jué)H-1菌液后能夠抑制禾谷鐮刀菌孢子萌發(fā)過(guò)程。

A:各時(shí)間段孢子萌發(fā)情況;B:孢子萌發(fā)率變化情況。A: Conidia germination at different time; B: The change of conidia germination rate.圖6 XH-1對(duì)孢子萌發(fā)的抑制作用Fig.6 Inhibitory effect of XH-1 on germination of conidia

2.5 菌株XH-1影響禾谷鐮刀菌的侵染力

為分析XH-1對(duì)禾谷鐮刀菌致病性的影響,對(duì)小麥葉片進(jìn)行戳傷接種,分別接種PH-1與XH-1的混合液、PH-1、 ddH2O于小麥葉片上,接種4 d后觀察并統(tǒng)計(jì)發(fā)病情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),接種XH-1與 PH-1混合液的小麥葉片病斑較小(圖7-A),且不會(huì)向接種點(diǎn)外擴(kuò)展,而接種PH-1的小麥葉片發(fā)病嚴(yán)重,接種無(wú)菌水的小麥葉片不發(fā)病。進(jìn)一步通過(guò)對(duì)小麥麥穗進(jìn)行單花滴注實(shí)驗(yàn),結(jié)果與葉片接菌結(jié)果一致,加入XH-1后PH-1的致病力顯著減弱(圖7-B)。結(jié)果表明,枯草芽孢桿菌XH-1菌液能夠抑制禾谷鐮刀菌的致病力。

A:XH-1對(duì)PH-1侵染小麥葉片的影響;B:XH-1對(duì)PH-1侵染小麥穗部的影響。A: Effect of XH-1 on PH-1 infection of wheat leaves; B: Effect of XH-1 on PH-1 infection of wheat spike.圖7 XH-1對(duì)禾谷鐮刀菌侵染力的影響Fig.7 Effect of XH-1 on wheat leaves and ears infected by F. graminearum

3 討 論

小麥赤霉病的普遍發(fā)生給農(nóng)民帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[24],而禾谷鐮刀菌作為引發(fā)赤霉病的主要病原體,被列為第四大植物病原真菌[25]。一直以來(lái),人們通常采用殺菌劑(如多菌靈等)對(duì)赤霉病進(jìn)行化學(xué)防控,但這對(duì)環(huán)境也造成了一定的污染[26-27]。相比化學(xué)防治,生物防治具有無(wú)公害、無(wú)殘留、對(duì)人和動(dòng)物安全等優(yōu)點(diǎn),因此具有廣泛的應(yīng)用前景[20]。生物防治是指利用生物有機(jī)體或其天然產(chǎn)物控制病蟲害的方法[28-29],芽孢桿菌是生物防治中使用最廣泛的微生物[30]。已有研究表明,芽孢桿菌可以產(chǎn)生表面活性素、豐原素和伊枯草菌素等脂肽抗菌物質(zhì),包括聚酮、氨基糖和磷脂在內(nèi)的非肽類抗菌化合物,細(xì)菌素等蛋白類活性物以及其他的能夠抑制病原菌生長(zhǎng)的產(chǎn)物[31-35]。一些研究表明芽孢桿菌對(duì)小麥赤霉病有明顯的抑制作用,如抑制菌絲營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)[17]、降低孢子萌發(fā)率或致畸[11-13]以及削弱病原菌的致病力[36]等。此外,已有研究表明芽孢桿菌被廣泛應(yīng)用于作物土傳病害的防治中,如尖孢鐮刀菌引起的人參根腐病[37]和草莓鐮刀菌枯萎病[38]、致病疫霉引起的馬鈴薯晚疫病[39]等,因此芽孢桿菌具有良好的應(yīng)用前景。本研究從小麥根部土壤中分離出1株對(duì)禾谷鐮刀菌具有明顯抑制作用的拮抗菌株XH-1,經(jīng)過(guò)對(duì)該菌株的形態(tài)特征觀察、16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育分析,將其鑒定為枯草芽孢桿菌。

生防菌XH-1與禾谷鐮刀菌一起培養(yǎng)時(shí),可以抑制禾谷鐮刀菌的生長(zhǎng),使其菌絲無(wú)法向外自由延伸,并且XH-1還能抑制禾谷鐮刀菌分生孢子的產(chǎn)孢及萌發(fā),降低孢子萌發(fā)率,同時(shí)使孢子膨脹和畸形。已有研究表明,大部分枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)都能造成病原菌的細(xì)胞壁或細(xì)胞膜裂解,繼而使原生質(zhì)外泄,菌絲體崩解,這些抑菌物質(zhì)大多也都能抑制孢子萌發(fā)或者使已經(jīng)萌發(fā)的孢子變形[31, 40],這一結(jié)論與本研究結(jié)果相符。可見(jiàn),在生防菌XH-1的作用下,禾谷鐮刀菌無(wú)法正常生長(zhǎng)和繁殖。但是XH-1菌株具體產(chǎn)生了哪些抑菌物質(zhì)來(lái)影響禾谷鐮刀菌的生長(zhǎng)目前尚不明確,后續(xù)可對(duì)其抑菌物質(zhì)的組成和作用機(jī)理進(jìn)行深入探究。此外,本研究還通過(guò)葉片及麥穗的接菌實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),XH-1能夠顯著削弱禾谷鐮刀菌對(duì)小麥的侵染能力,因此XH-1在小麥赤霉病的防治中,甚至在其他植物真菌病害的防治中可能會(huì)有廣泛的應(yīng)用前景。但其具體的作用機(jī)制尚不明確,后續(xù)可深入探究其在禾谷鐮刀菌侵染進(jìn)程中的作用機(jī)理以及對(duì)產(chǎn)毒的影響。

4 結(jié) 論

本研究從健康小麥周圍土壤中分離到對(duì)禾谷鐮刀菌具有拮抗作用的菌株XH-1,經(jīng)測(cè)序比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育分析將其鑒定為枯草芽孢桿菌,該菌株對(duì)禾谷鐮刀菌的生長(zhǎng)、產(chǎn)孢、孢子萌發(fā)、侵染力等過(guò)程均具有明顯抑制作用,因此該菌株具有良好的應(yīng)用前景,可為小麥赤霉病的生物防治提供資源。