新型冠狀病毒Omicron I1566V突變位點MS2噬菌體病毒樣顆粒的構建*

楊靜遠,李永鑫,史 茜,劉春燕,梁夢潔,張 新△

1.石河子大學醫(yī)學院,新疆石河子832000;2.新疆生產(chǎn)建設兵團醫(yī)院/石河子大學醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院檢驗科,新疆烏魯木齊 830002

新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)的Omicron變異株具有極強的傳染性和免疫逃逸能力[1],在全球的流行周期已長達22個月[2]。基因測序技術是鑒定SARS-CoV-2基因分型的金標準,但由于該技術檢測設備昂貴、操作難度大、生物信息分析復雜、檢測周期長等原因,在SARS-CoV-2變異株檢測中受到極大限制[3]。為此,研究者們不斷嘗試采用反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)、等溫擴增技術和熔解曲線等方法在常規(guī)PCR實驗室完成對SARS-CoV-2變異株的檢測[4-7]。本課題組前期在常規(guī)PCR實驗室構建了基于分子信標探針技術快速檢測Omicron I1566V突變位點的RT-PCR檢測體系,為確保該體系的檢測質(zhì)量,急需可靠的質(zhì)控品用于每檢測批的室內(nèi)質(zhì)量控制。MS2噬菌體的衣殼蛋白(CP)可包裝外源核酸制備成病毒樣顆粒,能夠模擬從核酸提取到PCR檢測質(zhì)量控制的全過程[8]。因此,本研究基于MS2噬菌體構建了包含Omicron I1566V突變位點的病毒樣顆粒,旨在用于已構建的Omicron I1566V突變位點的RT-PCR檢測體系的質(zhì)量控制。

1 材料與方法

1.1菌株、質(zhì)粒和主要試劑 克隆菌株DH5α和表達菌株BL21(DE3)均購自天根生化科技(北京)有限公司;pACYCDuet-1質(zhì)粒購自安諾倫(北京)生物科技有限公司;限制性內(nèi)切酶Bgl Ⅱ、Kpn Ⅰ、BamH Ⅰ、Hind Ⅲ、T4DNA連接酶、核酸Marker、蛋白質(zhì)Marker、RNA核酸提取試劑盒、反轉錄試劑均購自寶日醫(yī)生物技術(北京)有限公司;Benzonase核酸酶購自Sigma公司。

1.2引物和探針 通過Primer Premier 5.0軟件設計擴增引物,通過DNAMAN 6.0軟件設計分子信標。正向和反向擴增Omicron突變序列的引物和探針序列見表1,探針和引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物和探針序列

1.3方法

1.3.1序列選取與合成 參考GenBank數(shù)據(jù)庫中MS2噬菌體序列(GenBank:MK213795.1)合成MS2噬菌體CP和成熟蛋白(A蛋白)基因(1 692 bp),并在CP基因中插入6×His標簽,序列兩邊分別加入酶切位點BamH Ⅰ和Hind Ⅲ。在Outbreak數(shù)據(jù)庫(https://outbreak.info/)比對篩選出Omicron突變頻率高且特異性好的I1566V突變位點(圖1),參考GenBank數(shù)據(jù)庫中Omicron變異株序列(GenBank:OR472660.1),合成含有Omicron的高頻特異突變位點I1566V的序列(184 bp),序列兩邊分別加入酶切位點Bgl Ⅱ和Kpn Ⅰ,委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成上述2條序列。

注:每一行對應于左邊列出的SARS-CoV-2變異株;每一列表示頂部列出的突變。

1.3.2重組載體構建 以BamH Ⅰ和Not Ⅰ分別雙酶切質(zhì)粒pACYCDuet-1和CP、A蛋白基因序列,回收、連接、轉化到大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細胞中。提取質(zhì)粒,通過雙酶切和測序進行鑒定,鑒定正確的重組載體命名為pACYCDuet-MS2。以Bgl Ⅱ和Kpn Ⅰ分別雙酶切重組載體pACYCDuet-MS2和Omicron突變序列,回收、連接、轉化到大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細胞中。提取質(zhì)粒,通過雙酶切和測序進行鑒定,鑒定正確的重組載體命名為pACYCDuet-MS2-O。

1.3.3重組蛋白的表達與純化 將重組載體pACYCDuet-MS2-O轉化到表達菌株BL21(DE3)感受態(tài)細胞,挑取單克隆,37 ℃培養(yǎng)至A600 nm值為0.5～0.7,加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG),終濃度為0.3 mmol/L,25 ℃振蕩誘導表達14 h。8 000 r/min離心5 min收集菌體,按照菌體濕重1 g∶20 mL比例加入TBS緩沖液(pH=7.4)重懸后超聲破碎菌體,將破碎后的標本以12 000 r/min離心10 min,將獲得的上清液加入NI柱中,分別取10 μL洗脫標本用于SDS-PAGE分析。

1.3.4重組病毒樣顆粒的鑒定 取純化后的標本,在2%磷鎢酸復染,100 kV加速電壓條件下,通過透射電子顯微鏡(JEM-1200EX)觀察顆粒粒徑和均勻程度。

1.3.5重組病毒樣顆粒的定量 按照Microdrop-100微滴式數(shù)字PCR儀(廣州永諾生物科技有限公司)標準實驗流程,用表1中的引物對稀釋的病毒樣顆粒進行3次重復性檢測來對標本進行定量。

1.3.6重組病毒樣顆粒的穩(wěn)定性試驗 取純化后的病毒樣顆粒,每管500 μL,1份4 ℃放置,剩余4份凍存至-20 ℃冰箱中,分別在第1、5、10、15天將1份假病毒取出放置在37 ℃中,然后在第20天將5份假病毒同時進行標本裂解和反轉錄,利用表1中的引物和探針進行RT-PCR,比較其Ct值變化。

2 結 果

2.1重組載體構建 所有合成序列均經(jīng)過測序驗證后進行后續(xù)試驗,重組載體pACYCDuet-MS2-O經(jīng)酶切鑒定(圖2),片段大小與預期一致(1 876 bp),經(jīng)測序鑒定MS2噬菌體CP和A蛋白基因序列與I1566V突變序列均正確。

注:M為15 000 bp標志物;1泳道為BamH Ⅰ/Kpn Ⅰ酶切片段;2泳道為BamH Ⅰ酶切片段。

2.2重組蛋白的表達與純化 重組載體pACYCDuet-MS2-O在表達菌株BL21(DE3)經(jīng)過IPTG誘導表達,SDS-PAGE分析結果顯示,A蛋白(44×103)、CP(14×103)均成功表達(圖3)。

注:M為蛋白相對分子質(zhì)量標準;泳道1為誘導后沉淀;泳道2為誘導后的上清液;泳道3為純化后沉淀;泳道4為純化后的上清液。

2.3重組病毒樣顆粒的鑒定 將目的蛋白稀釋后染色,通過透射電鏡觀察粒徑,目的蛋白在體外自組裝形成了大小均勻的病毒樣顆粒,直徑為23～28 nm(圖4),符合MS2噬菌體直徑大小。

圖4 病毒樣顆粒的物理表征

2.4重組病毒樣顆粒的定量 將純化后的標本稀釋到合適的濃度后進行數(shù)字PCR定值(圖5),經(jīng)換算后病毒樣顆粒的濃度為8.2×1011copy/mL。

圖5 數(shù)字PCR測試結果

2.5重組病毒樣顆粒的穩(wěn)定性試驗 在37 ℃條件下,其Ct值隨著放置時間延長逐漸升高,但與4 ℃條件下的Ct值比較差異較小(圖6)。制備的病毒樣顆粒在37 ℃條件下可儲存20 d以上,具有良好的熱穩(wěn)定性。

圖6 病毒樣顆粒的熱穩(wěn)定性檢測

3 討 論

眾所周知,穩(wěn)定、可靠的質(zhì)控品對于RT-PCR檢測室內(nèi)質(zhì)量控制十分重要,目前重組質(zhì)粒常作為RT-PCR檢測中的質(zhì)控品,但存在不能模擬核酸提取及反轉錄過程、易造成實驗室污染等缺點[9]。因此,使用噬菌體或病毒的蛋白質(zhì)外殼來包裹靶序列制備成病毒樣顆粒就能夠彌補上述缺點。常用為病毒樣顆粒的噬菌體或病毒有Lambda噬菌體、絲狀噬菌體、煙草花葉病毒及MS2噬菌體等[10-11]。MS2噬菌體基因組全長3 569 bp,共編碼4種蛋白[12],自身的CP和A蛋白可在體外自行組裝形成病毒樣顆粒,并將包裝位點反向的外源核酸組裝包封在病毒樣顆粒中,常作為檢測RNA病毒過程中穩(wěn)定、可靠的陽性質(zhì)控品[13]。近期有研究基于MS2噬菌體分別制備了SARS-CoV-2和豬流行性腹瀉病毒的病毒樣顆粒,用于其RT-PCR檢測體系的質(zhì)控品[14-15];WANG等[16]基于MS2噬菌體制備的戊型肝炎病毒的病毒樣顆粒用于戊型肝炎病毒檢測時的質(zhì)量控制;MIKEL等[17]制備了基于MS2噬菌體腸道RNA病毒樣顆粒。以上研究均表明MS2噬菌體病毒樣顆粒在RT-PCR檢測體系的質(zhì)控品構建中具有良好的應用前景。

本研究構建的病毒樣顆粒是基于單質(zhì)粒雙表達包裝系統(tǒng)的pACYCDuet-1質(zhì)粒,目前有各種質(zhì)粒驅(qū)動的包裝系統(tǒng),它們在不同程度上均有RNA包裝能力有限、包裝效率較低、系統(tǒng)構建復雜及生產(chǎn)的病毒樣顆粒純化復雜而耗時等缺點。而單質(zhì)粒雙表達包裝系統(tǒng)的優(yōu)點就是能夠構建具有高效率和自包裝的病毒樣顆粒,并且允許最大長度的封裝,RNA長達3 600個核苷酸[18]。相關研究表明,MS2序列中僅選取CP基因序列,雖然也能形成病毒樣顆粒,但形成的病毒樣顆粒穩(wěn)定性差,無法耐受核酸酶攻擊[19],所以本研究同時選取CP和A蛋白基因序列來形成穩(wěn)定的MS2噬菌體病毒樣顆粒。合成上述序列后酶切插入質(zhì)粒pACYCDuet-1中,首先構建重組載體pACYCDuet-MS2。其次,本研究選取Omicron變異株ORF1b基因序列上的I1566V高頻特異突變位點作為檢測靶點,該突變位點經(jīng)過數(shù)據(jù)庫比對,其變異位點的突變頻率在95%以上,屬于Omicron保守且特異的突變位點[20]。隨后將包含這個特定突變位點的核酸序列作為靶序列,插入重組載體pACYCDuet-MS2中,成功構建重組載體pACYCDuet-MS2-O。重組載體在大腸埃希菌中誘導表達和純化,得到目的蛋白,目的蛋白通過透射電鏡進行物理表征,顯示在體外自組裝形成了23～28 nm的病毒樣顆粒。此外,本研究選用數(shù)字PCR對該病毒樣顆粒進行定量檢測,直接對單分子RNA水平進行定值,相對于實時熒光定量PCR,其不需要依賴于Ct值和標準曲線,直接得到病毒樣顆粒的拷貝數(shù),具有靈敏度高和精準定量的特點。該病毒樣顆粒用核酸酶消化后進行穩(wěn)定性試驗提取RNA,通過RT-PCR檢測,提示本研究構建的病毒樣顆粒具有良好的熱穩(wěn)定性,MS2的蛋白質(zhì)外殼能夠有效保護包被的靶序列。病毒樣顆粒在形態(tài)和結構上與天然病毒相似,因其被包裹的核酸不能復制,故不具有傳染性,且因為耐核酸酶的攻擊,熱穩(wěn)定性好[21]。因此,該病毒樣顆粒可全程模擬從核酸提取、反轉錄到核酸擴增,能夠為構建的Omicron變異株RT-PCR反應體系提供高質(zhì)量保證。

目前,SARS-CoV-2在全球范圍內(nèi)流行,依然對人類健康造成極大的威脅,如何快速對新發(fā)變異株進行監(jiān)測始終是公共衛(wèi)生領域所面臨的挑戰(zhàn)[22],當前基因測序技術從遞交標本到數(shù)據(jù)發(fā)布存在嚴重的變異監(jiān)測滯后性[23]。本課題組已構建了基于分子信標技術,通過識別I1566V位點快速檢測Omicron的RT-PCR反應體系,并且制備了該技術配套的變異株質(zhì)控品,保證了在常規(guī)PCR實驗室內(nèi)對Omicron檢測結果的可靠性。總之,該質(zhì)控品制備的方法具有通用性,使用該方法快速構建的RNA病毒質(zhì)控品,在面對大規(guī)模的突發(fā)公共衛(wèi)生事件時能夠快速提供高質(zhì)量的陽性對照,能夠為臨床患者救治及公共衛(wèi)生政策的制定提供強有力的支持。