IL-17 mRNA和PGE2 mRNA在口腔扁平苔蘚患者中的表達水平及臨床意義*

李 陽,王 瓏

寧夏醫科大學口腔醫學院,寧夏銀川 750001

口腔扁平苔蘚(OLP)是一種常見的口腔黏膜疾病。根據組織有無糜爛分為糜爛型OLP和非糜爛型OLP。其中,糜爛型OLP表現為口腔常伴有明顯的灼燒感和疼痛,嚴重影響患者語言、進食和吞咽功能。此外,糜爛型OLP若久治不愈,可能發展為口腔癌[1]。因此,世界衛生組織將其列為口腔潛在惡性疾病之一[2]。雖然目前尚未完全明確OLP的發病機制,但是越來越多的研究證明免疫失調在OLP發生、發展中發揮著重要作用,特別是T淋巴細胞介導的免疫反應和各種炎癥分子的異常表達等免疫失調[3]。輔助性T細胞17(Th17)是Th家族的最新成員,可分泌白細胞介素(IL)-17等特異性細胞因子,并與炎癥、腫瘤及自身免疫性疾病的發生密切相關[4]。在OLP的發展過程中,浸潤的T淋巴細胞和角質形成細胞合成并分泌多種促炎性細胞因子,促使OLP患者產生炎癥反應,進而導致糜爛、潰瘍及疼痛等臨床表現,表明OLP的發展與促炎性細胞因子的激活有關[5-7]。本課題組前期研究發現,OLP患者外周血血清中IL-17、血管表皮生長因子表達水平均高于健康者,提示IL-17和血管表皮生長因子可能參與OLP的發病過程,但具體機制尚不明確,需要進一步探究[8]。前列腺素E2(PGE2)作為炎癥介質參與許多疾病的發生、發展過程,并可以活化樹突狀細胞的促炎性細胞因子/趨化因子,但在自身免疫性疾病中,PGE2主要被認為是一種促炎性細胞因子[9]。此外,有研究報道,IL-17和PGE2在腫瘤的發生、轉移、血管生成等過程中發揮重要作用[10-11]。而PGE2和IL-17在OLP發生、發展中的作用機制目前仍不清楚。因此,本研究主要探討了IL-17和PGE2的信使RNA(mRNA)在OLP患者中的表達水平與臨床意義,現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2020年3月至2021年3月寧夏醫科大學總醫院口腔醫院收治的35例OLP患者作為試驗組,另選取同期在寧夏醫科大學總醫院口腔醫院進行阻生牙拔除的20例患者作為對照組。根據組織是否糜爛,將試驗組患者分為糜爛型OLP組和非糜爛型OLP組。納入標準:(1)符合《口腔扁平苔蘚診療指南(修訂版)》[3]中的相關診斷標準;(2)未接受任何相關治療。排除標準:(1)合并全身系統性疾病或惡性腫瘤;(2)伴有牙齦炎或牙周炎等口腔疾病。試驗組男16例,女19例;年齡32～71歲,平均(48.3±15.5)歲。對照組男9例,女11例;年齡21～43歲,平均(32.5±9.2)歲。試驗組和對照組性別、年齡比較,差異均無統計學意義(P>0.05),具有可比性。所有患者及家屬均知情同意并簽署知情同意書。本研究經寧夏醫科大學總醫院口腔醫院醫學倫理委員會審核批準(寧醫大倫理第2020-270號)。

1.2儀器與試劑 美國賽默飛世爾NanoDrop One 超微量紫外分光光度計,美國賽默飛ProFlex 聚合酶鏈反應(PCR)儀。RNAlater液和RNAeasyTMRNA抽提試劑盒均購自中國碧云天生物技術有限公司;PCR引物均由上海吉瑪制藥技術有限公司設計并合成;反轉錄試劑盒Time PrimeScript?RT kit和熒光定量試劑盒SYBR?Premix Ex TaqTM Ⅱ均購自北京寶日醫生物技術有限公司。

1.3方法

1.3.1實時熒光定量PCR 采集試驗組患者口腔黏膜病損組織及對照組患者口腔黏膜組織標本,置于RNAlater液,在4 ℃冰箱過夜后,再置于-80 ℃冰箱中保存備用;液氮研磨組織后,使用RNAeasyTMRNA抽提試劑盒,提取RNA。美國賽默飛世爾NanoDrop One超微量紫外分光光度計測定RNA濃度后合成互補DNA(cDNA),根據RNA濃度,配制反轉錄體系,按照產品說明書,將合成的cDNA存于-20 ℃冰箱中備用。IL-17正向引物序列為5′-CTGAATATCCATAACCGGAATACC-3′,反向引物序列為5′-AGCGTTGATGCAGCCCAAG-3′;PGE2正向引物序列為5′-CACAATCTCAAAGGGCCATC-3′,反向引物序列為5′-ATGGTACACACCGTGGCATA-3′;GAPDH正向引物序列為5′-GGTGTGAACCATGAGAAGTATGA-3′,反向引物序列為5′-GAGTCCTTCCACGATACCAAAG-3′。PCR反應體系為TB Green Fast qPCR Mix(2X) 10.0 μL,PCR Forward Primer(10 μmol/L) 0.5 μL,PCR Reverse Primer(10 μmol/L) 0.5 μL,cDNA 2.0 μL,碳酸二乙酯(DEPC)水 7.0 μL。PCR反應參數為95 ℃,1 min;95 ℃,15 s;60 ℃,30 s ;循環40次。采用2-ΔΔCt法計算IL-17和PGE2在試驗組患者口腔黏膜病損組織及對照組患者口腔黏膜組織中mRNA的表達水平,重復3次取平均值。

1.3.2評估患者疼痛程度 根據中華口腔醫學會黏膜病專業委員會于2022年制定的《口腔扁平苔蘚診療指南(修訂版)》[3],采用視覺模擬評分法(VAS)評估患者的疼痛程度,讓患者在0～10分自行選擇一個最能代表其疼痛程度的分數,0分代表無疼痛,1～3分代表輕度疼痛,4～6分代表中度疼痛,7～10 分代表重度疼痛。

2 結 果

2.1對照組、非糜爛型OLP組、糜爛型OLP組IL-17 mRNA和PGE2 mRNA表達水平比較 非糜爛型OLP組有19例患者,糜爛型OLP組有16例患者。糜爛型OLP組IL-17 mRNA和PGE2 mRNA表達水平均高于非糜爛型OLP組和對照組,且非糜爛型OLP組均高于對照組,差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 對照組、非糜爛型OLP組、糜爛型OLP組IL-17和PGE2的mRNA表達水平比較

2.2OLP患者IL-17 mRNA與PGE2 mRNA表達水平的相關性 Pearson相關分析結果顯示,OLP患者IL-17 mRNA表達水平與PGE2 mRNA表達水平呈正相關(r=0.505,P=0.002)。

2.3不同疼痛程度的OLP患者IL-17 mRNA和PGE2 mRNA表達水平比較 試驗組中無疼痛患者有5例,輕度疼痛患者有6例,中度疼痛患者有16例,重度疼痛患者有8例。無疼痛OLP患者IL-17 mRNA和PGE2 mRNA表達水平均低于輕度、中度、重度疼痛OLP患者,差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 不同疼痛程度的OLP患者IL-17 mRNA和PGE2mRNA表達水平比較

2.4OLP患者IL-17 mRNA和PGE2 mRNA表達水平與疼痛程度的相關性 Spearman相關分析結果顯示,OLP患者IL-17 mRNA、PGE2 mRNA表達水平與疼痛程度均呈正相關(r=0.710、0.570,P<0.05)。

3 討 論

OLP是臨床常見的與免疫相關的慢性炎癥性口腔黏膜病。糜爛型OLP有轉化為口腔鱗癌的風險,一旦發生癌變,會嚴重影響患者的身心健康。OLP的病理特點為固有層有大量的淋巴細胞浸潤及基底細胞發生液化變性,提示T淋巴細胞參與OLP的發生、發展過程[2]。有研究報道,Th17會產生多種促炎性細胞因子,在銀屑病和類風濕關節炎等慢性炎癥性疾病中發揮了重要作用,并與疾病的嚴重程度有關[12]。此外,Th17分泌的IL-17會促使上皮細胞、固有層中的成纖維細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞等產生多種細胞因子,從而協同促進炎癥的發生、發展[13]。

本研究發現,糜爛型OLP組、非糜爛型OLP組IL-17 mRNA表達水平均高于對照組,差異均有統計學意義(P<0.05),提示OLP患者體內的Th17數量增加。糜爛型OLP組IL-17 mRNA表達水平高于非糜爛OLP組(P<0.05),提示與非糜爛型OLP患者相比,糜爛型OLP患者體內含有更多的IL-17細胞。謝三祥等[14]研究發現OLP患者體內存在大量的Th17細胞浸潤。CD8+T淋巴細胞在糜爛型OLP患者的糜爛部位聚集增多、活性增強,并通過分泌人干擾素-γ、腫瘤壞死因子-α、IL-17等細胞因子加重OLP患者口腔部位糜爛[15]。因此,筆者推斷OLP患者IL-17 mRNA表達水平升高是因為局部環境中淋巴細胞的浸潤。本研究結果顯示,OLP患者IL-17 mRNA表達水平與疼痛程度呈正比(r=0.710,P<0.05),提示OLP患者IL-17 mRNA表達水平越高,疼痛癥狀越明顯。表明OLP患者上皮和固有層中的Th17被抗原呈遞細胞激活并釋放IL-17并促進炎癥反應,引起相應的疼痛等生物學效應。提示Th17產生的IL-17在OLP中發揮了關鍵作用。

本研究發現,糜爛型OLP組、非糜爛型OLP組PGE2 mRNA表達水平均高于對照組,差異均有統計學意義(P<0.05),并且與OLP患者的疼痛程度呈正相關(r=0.570,P<0.05),提示PGE2 mRNA表達水平越高,OLP患者疼痛越明顯。而且糜爛型OLP組PGE2 mRNA表達水平比非糜爛型OLP組高(P<0.05)。分析原因為在OLP患者體內的Th17刺激固有層中的樹突狀細胞從而分泌大量的PGE2,并募集固有層的細胞產生大量炎癥因子,導致基底細胞發生空泡性變,上皮細胞發生糜爛,這可能是臨床OLP患者口腔組織發生糜爛并伴疼痛的原因之一。Th17通過分泌環氧化酶-2誘導PGE2發揮擴血管作用,也能促進炎癥細胞分泌炎癥因子,從而促進炎癥反應的進一步發生和發展[11]。MUKAE等[16]通過免疫組化反應檢測OLP患者的環氧化酶-2和微粒體前列腺素E合酶-1(mPGES-1)表達水平發現,OLP病變的角質形成細胞中環氧化酶-2和mPGES-1的表達水平較正常的口腔上皮細胞高,與本研究結果相似。在研究小鼠類風濕關節炎的模型中PGE2類似物(米索前列醇)的作用機制時發現,PGE2促進了樹突狀細胞產生IL-6,并誘導IL-23/IL-12平衡的轉變,導致IL-17水平上升,提示PGE2可能是通過放大自身反應性Th17細胞作用,從而加重小鼠關節炎的炎癥反應[17]。此外,IL-17和PEG2還可能與乳腺癌、肺癌等腫瘤的發生、發展和轉移等密切相關[18-20]。

綜上所述,OLP患者口腔黏膜病損組織中IL-17 mRNA、PGE2 mRNA表達水平均高于正常的口腔黏膜組織,且糜爛型OLP組織IL-17 mRNA、PGE2 mRNA表達水平均高于非糜爛型OLP組織,并且與OLP患者的疼痛程度呈正相關,提示其可能參與了OLP的發生和發展過程。因此,闡明IL-17/PGE2軸在OLP中發生、發展機制,尋找可能有效的治療靶點,減少OLP發展為口腔癌的風險,有助于預防和管理OLP。