元寶楓種仁多糖提取純化、結(jié)構(gòu)表征以及降糖活性研究

米圣成，徐曉杰，魏菱鴿，路 祺，朱明華，包怡紅，陳春霞

（1.東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150000；2.東北林業(yè)大學(xué)化學(xué)與資源利用學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150000；3.哈爾濱職業(yè)技術(shù)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150000）

我國Ⅱ型糖尿?。═2DM）患者占總糖尿病患的90%以上，T2DM 發(fā)病機(jī)制尚不明確，但人們普遍認(rèn)為胰腺β細(xì)胞功能障礙和胰島素抵抗是兩個(gè)主要因素[1]。此外，氧化應(yīng)激在T2DM 的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用。通常用于治療這種疾病的藥物是西藥，這些藥物往往具有副作用大、選擇有限和成本高等[2]缺陷。張培蓮[3]的研究發(fā)現(xiàn)使用胰島素治療糖尿病后會(huì)出現(xiàn)低血糖、體重增加、水腫、脂肪組織增生以及脂肪萎縮等不良反應(yīng)。植物多糖具有多種生物學(xué)功能，如改善腸道健康、增強(qiáng)免疫力、抗氧化、抗病毒和抗應(yīng)激等[4]作用。隨著人們生活水平的提高和科技的進(jìn)步，植物多糖在食品[5]、醫(yī)藥[6]和材料等[7]領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。馬寧珠等[8]發(fā)現(xiàn)虎杖多糖能夠顯著降低糖尿病大鼠的糖耐量和空腹血糖。趙凱迪等[9]發(fā)現(xiàn)桔梗多糖可以通過改善T2DM 大鼠代謝水平和氧化應(yīng)激水平起到降血糖作用。

元寶楓為槭樹科槭樹屬的植物，因翅果形狀像中國古代金錠“元寶”得以命名。2011 年我國衛(wèi)生部（如今的國家衛(wèi)生健康委員會(huì)）發(fā)布的“關(guān)于批準(zhǔn)元寶籽油和牡丹籽油作為新資源食品的公告”，標(biāo)志著元寶楓籽油正式成為被國家承認(rèn)的食用油；2015 年國務(wù)院辦公廳發(fā)布《關(guān)于加快木本油料產(chǎn)業(yè)發(fā)展的意見》（國辦發(fā)[2014]68 號(hào)）重點(diǎn)提及加快元寶楓等木本油料作物產(chǎn)業(yè)的綜合發(fā)展。近年來，科研工作者發(fā)現(xiàn)元寶楓種仁中除了富含有油脂[10]，還含有蛋白質(zhì)[11]和多糖[12]，目前關(guān)于元寶楓種仁的研究還主要集中在油脂提取和其功能性脂肪酸—神經(jīng)酸的純化等方面。而對(duì)元寶楓種仁多糖的研究，僅僅局限于對(duì)元寶楓種仁多糖的提取方面，對(duì)元寶楓種仁多糖分離純化、單糖組成、以及生物活性等方面的研究卻鮮有報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)利用水提醇沉法從元寶楓種仁中提取多糖,并通過單因素和響應(yīng)面法對(duì)元寶楓種仁多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。經(jīng)Sevage 法脫蛋白、DEAE-DE 纖維素52 層析柱和SephadexG-100 凝膠層析柱分離純化元寶楓種仁多糖，并對(duì)所獲得多糖進(jìn)行了紅外光譜分析、同步熱分析、單糖組成分析、α-淀粉酶抑制活性以及降血糖等活性檢測(cè)，為元寶楓種仁多糖的開發(fā)和應(yīng)用提供參考和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

元寶楓種仁 購置于陜西金旺農(nóng)林科技有限公司；DEAE-DE 纖維素52、SephadexG-100 凝膠、阿卡波糖（BR，95%）、α-淀粉酶（50 U/mg）、噻唑藍(lán)（Thiazolyl Blue，MTT）（BR，95%）、單糖標(biāo)準(zhǔn)品 美國Sigma 公司；胎牛血清（Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS） 浙江天杭生物科技有限公司；MEM 培養(yǎng)基 美國Gibco 公司；二甲基亞砜（Dimethyl Sulfoxide，DMSO）Biosharp 公司；葡萄糖（Glucose，GLU）試劑盒、糖原（Glycogen，Gn）測(cè)定試劑盒、己糖激酶（Hexokinase，HK）試劑盒、丙酮酸激酶（Pyruvate Kinase，PK）試劑盒、3,5-二硝基水楊酸（3,5-Dinitrosalicylic acid，DNS）南京建成生物工程研究所；HepG2 細(xì)胞 上海瑾元生物科技有限公司；其他試劑 均為國產(chǎn)分析純。

IRAffinity-1 傅里葉變換紅外光譜 日本島津公司；STA449F5 同步熱分析儀 德國耐馳儀器制造有限公司；Reacti-thermo 氮?dú)獯祾邇x 美國Thermo 公司；ICS5000+離子色譜儀 美國Thermo公司；HZQ-F 全溫振蕩培養(yǎng)箱 哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)有限公司；Infinite 200 PRO 酶標(biāo)儀 長沙泰肯生物技術(shù)有限公司；CYTATION5 高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng) 美國伯騰儀器有限公司；HL-2B 數(shù)顯恒流泵上海馳唐電子有限公司；UV-5500 紫外分光光度計(jì)上海元析儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 元寶楓種仁多糖的制備工藝研究

1.2.1.1 元寶楓種仁多糖的提取 元寶楓種仁于60 ℃烘干后，粉碎過20 目篩，室溫存儲(chǔ)備用。精確稱取上述元寶楓種仁粉末100 g 于圓底燒瓶中，加入1500 mL 超純水，用加熱套回流煮沸4 h 后冷卻，以5000 r/min 離心10 min，收集上清液，濃縮至50 mL 左右，加入200 mL 無水乙醇在4 ℃下醇沉12 h，在6000 r/min 離心10 min，回收多糖，使用超純水重新溶解多糖，透析72 h，凍干得元寶楓多糖。

1.2.1.2 元寶楓種仁多糖得率 計(jì)算采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖（PATM）的質(zhì)量濃度，并按公式（1）計(jì)算，得到PATM 質(zhì)量分?jǐn)?shù)得率。

式中：Y 表示提取多糖PATM 的得率，%；ρ表示多糖質(zhì)量濃度，mg/mL；n 表示稀釋倍數(shù)；V 表示多糖溶液的體積，mL；m 表示樣品絕干質(zhì)量，mg。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn) 采用水提醇沉法提取PATM，以多糖得率為指標(biāo)，對(duì)提取各因素進(jìn)行研究。

1.2.2.1 提取次數(shù) 固定提取溫度80 ℃，提取時(shí)間3 h，液固比30:1 mL/g，考察提取次數(shù)（提取1、2、3 次）對(duì)多糖（PATM）得率的影響。

1.2.2.2 提取溫度 固定液固比30:1 mL/g，提取時(shí)間3 h，提取1 次，考察不同提取溫度（60、70、80、90、100 ℃）對(duì)多糖（PATM）得率的影響。

1.2.2.3 提取時(shí)間 固定液固比30:1 mL/g，提取溫度80 ℃，提取1 次，考察不同提取時(shí)間（1、2、3、4、5 h）對(duì)多糖（PATM）得率的影響。

1.2.2.4 液固比 固定提取溫度80 ℃，提取時(shí)間3 h，提取1 次，考察不同液固比（10:1、15:1、20:1、30:1、40:1 mL/g）對(duì)多糖（PATM）得率的影響。

1.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提取次數(shù)固定為1 次。選取提取溫度（℃）、提取時(shí)間（h）、液固比（mL/g）三個(gè)因素，以PATM 得率為響應(yīng)值，運(yùn)用Box-Behnken 進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化設(shè)計(jì)[13]，其試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Response surface test factors and levels

1.2.4 元寶楓種仁多糖的分離純化

1.2.4.1 元寶楓種仁多糖脫蛋白 采用Sevage 試劑[V（三氯甲烷）:V（正丁醇）=4:1]脫除蛋白[14]，將PATM 溶液與Sevage 試劑混合攪拌30 min，以5000 r/min 離心10 min，收集上清液，重復(fù)至蛋白無析出，上清液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去除有機(jī)試劑，收集多糖溶液，用3500 Da 透析袋流水透析24 h。將透析后的多糖溶液進(jìn)行濃縮、凍干，放置干燥器中以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4.2 纖維素層析柱分離元寶楓種仁多糖 稱取500 mg 除蛋白的PATM，配置成質(zhì)量濃度為10 mg/mL 的多糖溶液。將多糖溶液緩慢注入DEAE-DE纖維素52 層析柱中，依次用超純水、0.1、0.3、0.5 mol/L 的NaCl 溶液進(jìn)行洗脫，流速為1 mL/min，每管4 mL。收集不同洗脫條件的多糖組分，采用苯酚-硫酸法處測(cè)定每管中多糖含量，記錄OD 值。根據(jù)峰值段收集洗脫液，減壓濃縮，用透析袋流水透析24 h 后凍干，得到4 個(gè)多糖組分：PATM-1、PATM-2、PATM-3 和PATM-4。

1.2.4.3 凝膠層析柱純化元寶楓種仁多糖 采用SephadexG-100 凝膠層析柱對(duì)主要多糖成分PATM-3 進(jìn)一步分離純化，上樣濃度為5 mg/mL，緩慢注入SephadexG-100 凝膠層析柱，0.2 mL/min 的流速去離子水進(jìn)行洗脫，每管4 mL。采用苯酚-硫酸法測(cè)定洗脫液在490 nm 處吸光值，并繪制洗脫曲線[15]。根據(jù)峰值段收集洗脫液，將收集洗脫液濃縮和冷凍干燥，得到純化組分PATM-3-1。

1.2.5 多糖和蛋白含量測(cè)定 以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，采用苯酚-硫酸法測(cè)定PATM-3-1 多糖含量[16]，其回歸方程Y=1.0536X+0.0064（R2=0.9932）；使用BCA 試劑盒檢測(cè)PATM-3-1 多糖中蛋白質(zhì)含量。

1.2.6 單糖組成測(cè)定 準(zhǔn)確稱量PATM-3-1 多糖樣品5 mg，加入2 mol/L 三氟乙酸（TFA）溶液1 mL，105 ℃加熱6 h。超純氮?dú)獯蹈?，加入甲醇清洗，在通過超純氮?dú)獯蹈?，重?fù)甲醇清洗2～3 次。加入超純水溶解，并通過0.22 μm 微孔膜轉(zhuǎn)入色譜瓶中進(jìn)行測(cè)量。HPAEC 條件為：Thermo ICS5000 離子色譜系統(tǒng)（ICS5000），利用電化學(xué)檢測(cè)器對(duì)單糖組分進(jìn)行分析檢測(cè)。采用Dionex? CarboPac? PA10（250 mm×4.0 mm，10 μm）液相色譜柱；進(jìn)樣量為5 μL。流動(dòng)相A（0.1 mol/L NaOH），流動(dòng)相B（0.1 mol/L NaOH，0.2 mol/L NaAc），流速0.5 mL/min；柱溫設(shè)置為30 ℃；洗脫梯度：0 min A 相/B 相（95:5 V/V），30 min A 相/B 相（80:20 V/V），30.1 min A 相/B 相（60:40 V/V），45 min A 相/B 相（60:40 V/V），45.1 min A 相/B 相（95:5 V/V）。數(shù)據(jù)在ICS5000 離子色譜儀上采集，并使用Chromeleon 7.2 CDS 進(jìn)行處理。

1.2.7 紅外光譜分析 稱取2 mg 多糖樣品（PATM-3-1），與200 mg 的干燥后的溴化鉀在瑪瑙研缽中研磨均勻，放入壓片機(jī)壓成薄片。以溴化鉀片作為背景去除干擾，在分辨率為4 cm-1在4000～500 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行紅外光譜掃描[17]。

1.2.8 熱重分析 采用同步熱分析法分析純化多糖的熱穩(wěn)定性。稱取5 mg 多糖樣品（PATM-3-1），放于坩堝中，以10 ℃/min 加熱速率，在20～800 ℃范圍進(jìn)行熱重分析[18]。

1.2.9 剛果紅實(shí)驗(yàn) 采用剛果紅法分析純化多糖的三螺旋結(jié)構(gòu)。取2 mL（1 mg/mL）純化多糖溶液與2 mL（160 μmol/L）剛果紅溶液混合，依次加入不同濃度（0、0.1、0.3、0.4、0.5 mol/L）的NaOH 溶液，室溫靜置15 min，600～400 nm 范圍進(jìn)行全波長掃描，測(cè)定溶液最大吸收波長。以NaOH 濃度為橫坐標(biāo)，以最大吸收波長為縱坐標(biāo)，并繪制曲線[19]。

1.2.10 體外降糖活性研究

1.2.10.1α-淀粉酶抑制率測(cè)定 根據(jù)文獻(xiàn)[20]描述的方法，對(duì)多糖PATM-3-1 進(jìn)行α-淀粉酶的抑制率測(cè)定。用去離子水將多糖配置成不同質(zhì)量濃度的溶液。以不同濃度阿卡波糖為陽性對(duì)照，取250 μL 多糖溶液，與40 μLα-淀粉酶（5 U）充分混合，37 ℃水浴10 min 后，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%可溶性淀粉溶液500 μL，繼續(xù)37 ℃水浴5 min，取出后加入600 μL DNS 試劑終止反應(yīng)，并在沸水浴加熱10 min，冷卻至室溫，540 nm 處檢測(cè)吸光值，按公式（2）計(jì)算α-淀粉酶的抑制率。

式中：Y 表示為α-淀粉酶抑制率，%；A0表示用去離子水代替樣品的吸光值；A1表示被測(cè)樣品反應(yīng)后的吸光值；A2表示去離子水代替α-淀粉酶溶液混合后的吸光值。

1.2.10.2 胰島素抵抗細(xì)胞模型的建立 取對(duì)數(shù)生長期的HepG2 細(xì)胞，用0.25%胰酶進(jìn)行消化，加入完全培養(yǎng)基調(diào)節(jié)成1×105個(gè)/mL 的細(xì)胞懸液，接種于96 孔板，每孔100 μL，細(xì)胞貼壁后，棄去培養(yǎng)基，加入含有不同濃度胰島素的無血清MEM 培養(yǎng)基（10-9、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L）100 μL，培養(yǎng)36 h 根據(jù)細(xì)胞的葡萄糖消耗量來確定最佳的胰島素濃度。

1.2.10.3 細(xì)胞存活率測(cè)定 采用MTT 法[21]測(cè)定多糖PATM-3-1 對(duì)HepG2 細(xì)胞存活率的影響。將PATM-3-1 用MEM 培養(yǎng)基配制成不同質(zhì)量濃度備用。將1×105個(gè)/mL 的HepG2 細(xì)胞懸液加入96 孔板，每孔100 μL。放入37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，加入100 μL 不同質(zhì)量濃度（2560、1280、640、320、160、80 μg/mL）的PATM-3-1 繼續(xù)培養(yǎng)24 h，加入5 mg/mL MTT 溶液50 μL 繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h，棄去上清液，加入150 μL DMSO 溶液，充分振蕩10 min，490 nm 處檢測(cè)吸光值[22]。并按照公式（3）計(jì)算HepG2 細(xì)胞存活率。

式中：Y 表示細(xì)胞存活率，%；A0表示無細(xì)胞孔的吸光值；A1表示含有HepG2 細(xì)胞和被測(cè)樣品的吸光值；A2表示含有HepG2 細(xì)胞的吸光值。

1.2.10.4 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)條件下，用完全培養(yǎng)基（89% MEM 培養(yǎng)基、10%FBS 和1%青霉素-鏈霉素）培養(yǎng)HepG2 細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞貼壁80%后，用0.25%胰酶進(jìn)行消化傳代，并選取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。取對(duì)數(shù)生長期HepG2細(xì)胞，加入完全培養(yǎng)基調(diào)節(jié)成1×105個(gè)/mL 的細(xì)胞懸液，接種于6 孔板中每孔1 mL。將細(xì)胞分為六組：空白組、模型組（10-7mol/L 胰島素）、陽性對(duì)照組（1 mg/mL 二甲雙胍+10-7mol/L 胰島素）、PATM-3-1低劑量組（320 μg/mL PATM-3-1+10-7mol/L 胰島素）、PATM-3-1 中劑量組（640 μg/mL PATM-3-1+10-7mol/L 胰島素）、PATM-3-1 高劑量組（1280 μg/mL PATM-3-1+10-7mol/L 胰島素）。

1.2.10.5 葡萄糖消耗量和糖原含量測(cè)定 按照1.2.10.4 中的細(xì)胞分組進(jìn)行培養(yǎng)，用0.25%胰酶消化，收集細(xì)胞離心棄上清液，用PBS 清洗細(xì)胞1～2 次，離心保留沉淀細(xì)胞。向沉淀細(xì)胞中加入0.1 mol/L pH7.4 的磷酸鹽緩沖溶液，冰水浴下超聲破碎。按照葡萄糖（GLU）、糖原（Glycogen）和蛋白定量（TP）試劑盒說明進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.10.6 己糖激酶（HK）和丙酮酸激酶（PK）活性測(cè)定 實(shí)驗(yàn)分組同1.2.10.4，用0.25%胰酶消化后，收集、離心、保留沉淀細(xì)胞待用，后續(xù)操作按照己糖激酶（HK）、丙酮酸激酶（PK）和蛋白定量（TP）試劑盒說明進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Design-Expert 13.0.1 軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理，并對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。每組實(shí)驗(yàn)3 個(gè)平行，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，利用軟件SPSS Statistics26.0 進(jìn)行方差分析，P<0.01表示差異性極顯著P<0.05 表示差異顯著，采用Origin 2021.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)和圖像處理并生成圖片。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素結(jié)果分析

2.1.1 提取次數(shù)對(duì)元寶楓種仁多糖得率的影響 提取次數(shù)對(duì)PATM 得率的影響如圖1 所示，提取1 次多糖得率為17.79%，提取2 次多糖得率為20.60%，提取3 次多糖得率為21.72%。提取2 次和提取3 次多糖得率增加不顯著（P>0.05）。這是由于提取1 次已經(jīng)將大部分元寶楓種仁多糖提取出來，增加提取次數(shù)，PATM 得率增加不明顯。考慮到能耗等因素，選擇提取1 次，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 提取次數(shù)對(duì)PATM 得率的影響Fig.1 Effect of extraction times on the yield of PATM

2.1.2 提取溫度對(duì)多糖得率的影響 如圖2 所示，隨著提取溫度的增加，PATM 得率呈現(xiàn)先增加后平穩(wěn)的趨勢(shì)。在80 ℃時(shí)，PATM 得率達(dá)到最大值，得率為17.97%。之后繼續(xù)升高提取溫度，PATM 得率也沒有顯著變化（P>0.05），趨于穩(wěn)定。這是由于在80 ℃時(shí)能夠?qū)⒃獙殫鞣N仁多糖充分提取出來，達(dá)到最大值。提取溫度過高不僅能耗增加，而且會(huì)對(duì)多糖的結(jié)構(gòu)造成破壞，影響后續(xù)PATM 的表征。因此，最佳提取溫度確定為80 ℃。

圖2 提取溫度對(duì)PATM 得率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on the yield of PATM

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)多糖得率的影響 提取時(shí)間對(duì)PATM 得率的影響如圖3 所示，提取時(shí)間在1～5 h的范圍內(nèi)，PATM 的得率呈現(xiàn)先上升后平穩(wěn)的趨勢(shì)。當(dāng)提取時(shí)間為3 h 時(shí)，多糖得率達(dá)到最大，繼續(xù)延長提取時(shí)間，多糖得率沒有明顯的變化，趨于穩(wěn)定。這是因?yàn)榻?jīng)過3 h 的提取，元寶楓種仁多糖被充分提取，再繼續(xù)延長提取時(shí)間也不會(huì)增加PATM 的得率。因此，最佳提取時(shí)間確定為3 h。

圖3 提取時(shí)間對(duì)PATM 得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on the yield of PATM

2.1.4 液固比對(duì)多糖得率的影響 如圖4 所示，液固比在10:1～40:1 mL/g 的范圍內(nèi)，隨著液固比的增加元寶楓種仁多糖得率先上升后下降，以30:1 mL/g的液固比為轉(zhuǎn)折點(diǎn)，PATM 得率略微下降。因此，最佳液固比確定為30:1 mL/g。

圖4 液固比對(duì)PATM 得率的影響Fig.4 Effect of liquid-solid ratio on the yield of PATM

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化分析

基于單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，考慮到提取次數(shù)對(duì)PATM得率影響較小，故將提取次數(shù)固定為1 次。以提取溫度、提取時(shí)間和液固比三個(gè)因素為自變量，PATM得率為響應(yīng)值，通過響應(yīng)面分析法對(duì)PATM 的提取工藝進(jìn)行三因素三水平優(yōu)化。響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。通過Box-Behnken 對(duì)比實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到PATM 得率的回歸方程如下：

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Response surface test design and test results

回歸模型方差分析結(jié)果，見表3，該回歸模型極其顯著（P<0.0001），失擬項(xiàng)P=0.5120>0.05，說明失擬項(xiàng)差異不顯著；決定系數(shù)R2=0.9893，校正后R2adj=0.9756，說明該回歸方程擬合度良好，實(shí)驗(yàn)方法可信度較高[23]，可用于PATM 得率的分析和預(yù)測(cè)。

表3 回歸模型及方差分析結(jié)果Table 3 Regression model and analysis of variance results

依據(jù)回歸模型，可預(yù)測(cè)PATM 最佳提取工藝為：提取溫度79.879 ℃，提取時(shí)間3.341 h，液固比30.259:1 mL/g，此時(shí)PATM 得率理論值為18.316%?？紤]到實(shí)際可操作性，將最佳提取工藝參數(shù)調(diào)整為：提取溫度80 ℃，提取時(shí)間3.5 h，液固比30:1 mL/g，進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn)，PATM 多糖平均得率為18.17%±0.48%，這也與理論值相近，可見該模型能較好地預(yù)測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2.3 元寶楓種仁多糖的分離純化

2.3.1 纖維素層析柱分離純化 如圖5 所示，經(jīng)DEAE-纖維素52 陰離子交換柱對(duì)PATM 進(jìn)行純化，PATM 經(jīng)由NaCl 溶液洗脫，得到四個(gè)多糖組分：PATM-1（16.44%）、PATM-2（3.58%）、PATM-3（79.20%）、PATM-4（0.76%）。在比較樣品中每個(gè)級(jí)別組分的百分比后，PATM-3 被認(rèn)為是PATM 的主要組分，收集并用于SephadexG-100 凝膠層析柱進(jìn)一步純化。

圖5 DEAE-纖維素52 陰離子交換柱純化PATMFig.5 Purification of PATM by DEAE-Cellulose 52 anion exchange column

2.3.2 凝膠層析柱分離純化 SephadexG-100 凝膠層析柱是根據(jù)分子量大小對(duì)多糖樣品進(jìn)行分離純化，大分子量的多糖分子先流出凝膠柱，而小分子量的多糖分子后流出，從而實(shí)現(xiàn)分離。如圖6 所示，PATM-3經(jīng)由SephadexG-100 凝膠層析柱分離純化得到PATM-3-1、PATM-3-2、PATM-3-3。將PATM-3-1收集進(jìn)行濃縮、透析和凍干，測(cè)定結(jié)果表明，PATM-3-1 多糖的純度為97.17%。

圖6 SephadexG-100 凝膠柱純化PATM-3Fig.6 Purification of PATM-3 by SephadexG-100 gel column

2.4 單糖組成分析

如圖7A 所示，標(biāo)準(zhǔn)品L-巖藻糖、D-氨基半乳糖、L-鼠李糖、L-阿拉伯糖、D-氨基葡萄糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-木糖、D-甘露糖、D-果糖、D-核糖、D-半乳糖醛酸、L-古羅糖醛酸、D-葡萄糖醛酸和D-甘露糖醛酸出峰時(shí)間依次為3.68、7.05、7.45、7.75、8.91、9.77、11.25、13.19、13.85、15.88、17.27、34.17、34.96、36.68、39.03 min，峰形勻稱且分離度較好，無干擾現(xiàn)象，可用于多糖組成分析。通過與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比，PATM-3-1（圖7B）是由D-半乳糖醛酸、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、L-鼠李糖、D-葡萄糖、D-木糖、D-甘露糖、D-葡萄糖醛酸、L-巖藻糖、D-核糖和D-氨基葡萄糖組成，其摩爾質(zhì)量之比為12.40:12.81:5.08:3.86:2.69:2.31:1:0.66:0.32:0.06:0.02，說 明PTAM-3-1 為酸性雜多糖，主要以D-半乳糖醛酸和L-阿拉伯糖兩種單糖為主。

圖7 單糖標(biāo)準(zhǔn)品（A）和PATM-3-1（B）的色譜圖Fig.7 Chromatograms of monosaccharide standard (A) and PATM-3-1 (B)

2.5 紅外光譜分析

FT-IR 光譜是闡明多糖特征官能團(tuán)的重要工具之一，PATM-3-1 的紅外光譜表現(xiàn)出多糖的典型吸收峰（圖8）。在3283 cm-1處出現(xiàn)強(qiáng)而寬的特征峰，歸因于O-H 拉伸振動(dòng)；在2928 cm-1處的弱吸收峰歸因于C-H 拉伸振動(dòng)[24]；1740 cm-1左右的吸收峰歸因于-OH 羧酸羰基的拉伸振動(dòng)[25]，這表明多糖結(jié)構(gòu)中存在糖醛酸；1643 cm-1處的條帶歸因于-OH 的彎曲振動(dòng)；1600 cm-1處的條帶歸因于糖醛酸的CO 拉伸振動(dòng)[26]；1411 和1240 cm-1處的峰是C-H 的可變角度振動(dòng)，可以判斷為多糖；1077 和1013 cm-1之間的特征吸收峰歸因于吡喃糖環(huán)的拉伸振動(dòng)[27-28]；767 cm-1處的吸收峰則表明該多糖為β構(gòu)型吡喃糖。

圖8 PATM-3-1 紅外光譜圖Fig.8 Infrared spectrogram of PATM-3-1

2.6 熱重分析

PATM-3-1 的TG 和DTG 曲線見圖9，其中存在兩個(gè)顯著的熱損失：第一個(gè)是由于水分蒸發(fā)，多糖從40 ℃到126.27 ℃損失了8.80%的質(zhì)量，這一結(jié)果表明多糖具有一定的持水能力；第二個(gè)是多糖熱分解產(chǎn)生的，從221.25 ℃至443.73 ℃損失了54.90%的質(zhì)量，在260.70 ℃達(dá)到最快的熱分解速率。

圖9 PATM-3-1 的TG-DTG 曲線Fig.9 TG-DTG curve of PATM-3-1

2.7 剛果紅分析

剛果紅能與三股螺旋結(jié)構(gòu)的多糖結(jié)合在一起形成絡(luò)合物，從而使其最大吸收波長發(fā)生改變。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖10 所示，元寶楓種仁多糖PATM-3-1 與剛果紅絡(luò)合物的最大吸收波長在0～0.4 mol/L NaOH 濃度下向長波長方向偏移，在0.4～0.5 mol/L NaOH 濃度下最大吸收波長明顯下降，證明元寶楓種仁多糖PATM-3-1 具備三股螺旋結(jié)構(gòu)[29]。

圖10 PATM-3-1 在不同 NaOH 濃度下最大吸收波長變化Fig.10 Maximum absorption wavelength of PATM-3-1 under different NaOH concentrations

2.8 體外降血糖活性分析

2.8.1α-淀粉酶抑制活性α-淀粉酶抑制劑可以與體內(nèi)的α-淀粉酶發(fā)生作用，阻止淀粉轉(zhuǎn)化為葡萄糖，可以有效控制血糖水平[30]。因此，尋找α-淀粉酶的天然抑制劑是目前國內(nèi)外降糖的研究熱點(diǎn)之一。在本研究中，不同質(zhì)量濃度的PATM-3-1 對(duì)α-淀粉酶抑制活性見圖11，PATM-3-1 在0.3～5 mg/mL 濃度范圍內(nèi)表現(xiàn)出對(duì)α-淀粉酶的抑制率呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系，PATM-3-1 和阿卡波糖α-淀粉酶的半抑制質(zhì)量濃度IC50值分別為2.04 和0.032 mg/mL。宋田源等[31]的研究發(fā)現(xiàn)，紅毛藻多糖對(duì)α-淀粉酶抑制隨著濃度增加而增強(qiáng)，其IC50值為1.26 mg/mL，PATM-3-1對(duì)α-淀粉酶的半數(shù)抑制濃度與紅毛藻多糖相接近，由此可以看出PATM-3-1 展現(xiàn)出良好的α-淀粉酶抑制活性。

圖11 不同質(zhì)量濃度的PATM-3-1 對(duì)α-淀粉酶的抑制率Fig.11 α-Amylase inhibition rate of different mass concentration of PATM-3-1

2.8.2 胰島素抵抗模型 目前認(rèn)為胰島素抵抗（insulin resistance，IR）不僅是2 型糖尿病的發(fā)病基礎(chǔ)，也是貫穿多種代謝相關(guān)疾病的主線，是心血管疾病、高脂血癥、高尿酸血癥及代謝綜合癥的共同病理基礎(chǔ)。構(gòu)建胰島素抵抗細(xì)胞模型是進(jìn)行IR 相關(guān)疾病治療研究及藥物研發(fā)的有效途徑[32]。通過含有不同濃度的胰島素（10-5～10-9mol/L）的MEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)36 h，誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞產(chǎn)生胰島素抵抗（圖12），模型組與正常組相比，葡萄糖的消耗量明顯降低，顯著低于正常組（P<0.05），說明胰島素抵抗模型建立成功。其中胰島素濃度為10-7mol/L 時(shí)，其葡萄糖的消耗量最低，顯著低于其他濃度模型組（P<0.05）。因此，選擇該濃度的胰島素來構(gòu)建胰島素抵抗的HepG2細(xì)胞模型，用于進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖12 胰島素抵抗HepG2 細(xì)胞模型Fig.12 Insulin-resistant HepG2 cell model (IR-HepG2)

2.8.3 細(xì)胞毒性 采用MTT 法檢測(cè)PATM-3-1 對(duì)HepG2 細(xì)胞毒性，并依據(jù)HepG2 細(xì)胞存活率篩選出后續(xù)實(shí)驗(yàn)所使用PATM-3-1 的安全劑量。不同質(zhì)量濃度的PATM-3-1 對(duì)HepG2 細(xì)胞干預(yù)24 h 后的細(xì)胞存活情況見圖13?？梢钥闯鲈?0～2560 μg/mL的濃度范圍內(nèi)，PATM-3-1 對(duì)HepG2 細(xì)胞無明顯的抗增殖作用，這表明元寶楓種仁多糖PATM-3-1 對(duì)HepG2 細(xì)胞無毒性，80～2560 μg/mL 可以作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)PATM-3-1 的安全濃度范圍。

圖13 不同質(zhì)量濃度的PATM-3-1 對(duì)HepG2 細(xì)胞存活率的影響Fig.13 Effect of different mass concentration of PATM-3-1 on the survival rate of HepG2 cells

2.8.4 葡萄糖消耗量和糖原含量分析 在正常機(jī)體內(nèi)細(xì)胞利用胰島素將葡萄糖分解為機(jī)體提供能量。當(dāng)機(jī)體產(chǎn)生胰島素抵抗時(shí)，細(xì)胞對(duì)胰島素敏感性降低，導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)葡萄糖攝取量下降[33]。使用改善胰島素抵抗的藥物會(huì)提高細(xì)胞對(duì)葡萄糖的消耗量[34]。不同質(zhì)量濃度的PATM-3-1 對(duì)胰島素抵抗的HepG2 細(xì)胞（Insulin Resistance-HepG2，IR-HepG2）葡萄糖消耗量的影響見圖14A?？瞻捉M、模型組、陽性對(duì)照組、高劑量組、中劑量組和低劑量組細(xì)胞的葡萄糖消耗量分別為8.63、2.86、8.69、8.55、7.53 和7.03 mmol/L。與空白組細(xì)胞相比，模型組細(xì)胞的葡萄糖消耗量顯著降低（P<0.05），降低約為66.86%；與模型組相比，樣品組和陽性對(duì)照組細(xì)胞的葡萄糖消耗量顯著提高（P<0.05），并且高劑量組、中劑量組和低劑量組細(xì)胞的葡萄糖消耗量與PATM-3-1 呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系?？瞻捉M、高劑量組和陽性對(duì)照組細(xì)胞的葡萄糖消耗量無明顯差異，這說明PATM-3-1 能有效調(diào)節(jié)IR-HepG2 細(xì)胞對(duì)葡萄糖的吸收，高劑量PATM-3-1作用與陽性藥相當(dāng)。

圖14 不同質(zhì)量濃度的PATM-3-1 對(duì)IR-HepG2 細(xì)胞葡萄糖含量（A）和糖原含量（B）的影響Fig.14 Effects of different mass concentration of PATM-3-1 on glucose content (A) and glycogen content (B) in IR-HepG2 cells

此外，細(xì)胞攝取葡萄糖經(jīng)各種酶作用合成糖原，糖原的合成與分解對(duì)維持血糖平衡極為重要。不同質(zhì)量濃度的PATM-3-1 對(duì)IR-HepG2 細(xì)胞合成糖原的影響見圖14B，其中空白組、模型組、陽性對(duì)照組、高劑量組、中劑量組和低劑量組的糖原含量分別為5.32、1.93、5.02、5.16、4.84 和4.03 mg/g。與空白組相比，模型組細(xì)胞的糖原含量顯著降低（P<0.05），降低約為63.72%。與模型組相比，經(jīng)由PATM-3-1 和陽性藥（二甲雙胍）處理后的IRHepG2 細(xì)胞的糖原含量得到顯著提高（P<0.05），這表明PATM-3-1能發(fā)揮改善IR-HepG2 細(xì)胞糖代謝紊亂的作用。

2.8.5 己糖激酶（HK）和丙酮酸激酶（PK）活性分析己糖激酶（HK）被認(rèn)為是糖酵解途徑中催化己糖磷酸化為磷酸己糖的一種重要的酶。丙酮酸激酶（PK）是糖酵解中的另一種重要酶，胰島素抵抗會(huì)降低己糖激酶和丙酮酸激酶的活性。因此，調(diào)節(jié)HK 和PK 活性是促進(jìn)葡萄糖代謝的關(guān)鍵因素[35]。如圖15A 和圖15B 所示，空白組、模型組、陽性對(duì)照組、高劑量組、中劑量組和低劑量組細(xì)胞的HK 活性分別為16.18、7.32、15.17、15.91、13.57 和11.93 nmol/min/mg prot；細(xì)胞的PK 活性分別為74.93、52.31、73.30、72.66、68.73 和67.33 U/g prot。與空白組相比，模型組細(xì)胞的HK 和PK 活性顯著降低（P<0.05）；而陽性對(duì)照組細(xì)胞的HK 和PK 活性顯著升高。與模型組相比，經(jīng)PATM-3-1 處理后，細(xì)胞的HK 和PK 活性顯著提高（P<0.05），呈現(xiàn)與PATM-3-1 劑量依賴關(guān)系。這說明PATM-3-1 具有增強(qiáng)IR-HepG2 細(xì)胞HK和PK 活性，促進(jìn)糖代謝，發(fā)揮降糖作用。

圖15 不同質(zhì)量濃度的PATM-3-1 對(duì)IR-HepG2 細(xì)胞HK活性（A）和PK 活性（B）的影響Fig.15 Effects of different mass concentration of PATM-3-1 on HK activity (A) and PK activity (B) in IR-HepG2 cells

3 結(jié)論

本研究通過單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化了元寶楓種仁多糖的提取工藝，在最佳提取工藝條件下，多糖平均得率為18.17%，通過脫蛋白、DEAE-DE 纖維素52 層析柱和SephadexG-100 凝膠層析柱分離純化得到不具有三螺旋結(jié)構(gòu)的多糖PATM-3-1，其純度為97.17%，它是由D-半乳糖醛酸、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、L-鼠李糖、D-葡萄糖、D-木糖、D-甘露糖、D-葡萄糖醛酸、L-巖藻糖、D-核糖和D-氨基葡萄糖單糖組成。PATM-3-1 屬于β構(gòu)型吡喃糖，具有良好的熱穩(wěn)定性和降糖活性，能夠有效調(diào)節(jié)IR-HepG2 細(xì)胞對(duì)葡萄糖吸收和糖原合成，增強(qiáng)HK 和PK 活性，從而改善IR-HepG2 細(xì)胞的糖代謝。PATM-3-1 展現(xiàn)出良好的降血糖活性，為植物元寶楓種仁多糖在藥物和功能性食品中的研發(fā)、提取和應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。

? The Author(s) 2024.This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).