軟堅清脈顆粒促進骨髓間充質(zhì)干細胞遷移的實驗研究*

宗媛，張永康，曹燁民，，馬 斌

1 上海中醫(yī)藥大學，上海 201203； 2 上海中醫(yī)藥大學附屬上海市中西醫(yī)結合醫(yī)院，上海 200082；3 上海交通大學MED-X研究院，上海 202402

動脈硬化閉塞癥（arteriosclerosis obliterans，ASO）是一種較為嚴重的缺血性周圍血管疾病，臨床上主要表現(xiàn)為肢體局部發(fā)涼、怕冷、缺血性靜息痛和間歇性跛行，嚴重的患者肢體發(fā)黑或壞死壞疽［1］。針對ASO的西醫(yī)治療方法［2-5］主要有：藥物治療、血管腔內(nèi)治療、手術治療，近年來干細胞療法成為血管類疾病治療的重要補充。骨髓間充質(zhì)干細胞是非造血和成纖維細胞樣的細胞群體，占骨髓有核細胞的0.001%～0.01%［6］。實驗發(fā)現(xiàn)BMSCs在合適的體外環(huán)境下可以分化為HUVECs［7-8］，廣泛用于血液系統(tǒng)疾病、循環(huán)系統(tǒng)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病及骨科疾病等多種系統(tǒng)疾病的治療［9］。通過增加遷移至靶器官的BMSCs細胞數(shù)量可以提高臨床療效［10］。通過靜脈內(nèi)注射的干細胞在體內(nèi)示蹤顯示體內(nèi)分布特點與其質(zhì)量、數(shù)量、組織類型、損傷程度、血管分布，對損傷和炎癥情況有一定的趨向性［11-12］。而植入的干細胞異常衰老持續(xù)影響移植效果［13］。既往研究表明，軟堅清脈顆粒含藥血清可以促進內(nèi)皮細胞的損傷修復［14］，其是否可以促進間充質(zhì)干細胞增殖與趨化值得深入研究。

1 材料與方法

1.1 實驗設計 本實驗為體外細胞學實驗，2020年3月至10月在上海市中西醫(yī)結合醫(yī)院實驗動物中心及上海交通大學MED-X研究院完成。

1.2 實驗動物 10周齡SPF級雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量約200 g，用于軟堅清脈顆粒含藥血清的制備。新生兩周內(nèi)SPF級乳鼠10只由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供，實驗動物合格證書編號：2018000610995，經(jīng)上海市實驗動物質(zhì)量檢測檢驗站質(zhì)檢，用于BMSCs細胞的提取。均由上海中醫(yī)藥大學附屬上海市中西醫(yī)結合醫(yī)院倫理委員會批準，動物飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學附屬上海市中西醫(yī)結合醫(yī)院SPF級動物房。

1.3 細胞株 HUVECs細胞由上海交通大學MEDX研究院高維強課題組饋贈，細胞培養(yǎng)于完全培養(yǎng)基并置于正常培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，隔天換液，細胞融合至80%時按1∶3傳代，取P3代細胞用于后續(xù)實驗。

1.4 儀器與設備 D180型CO2培養(yǎng)箱（瑞沃德）、酶標儀（Multiskan? FC）、-80℃冰箱（Thermo）；DW-40W255J型-20 ℃冰箱（中國海爾公司）；FACSCanto II型流式細胞儀（BD公司）；Optima MAX-XP型超速離心機（美國Beckman公司）；1658040型電泳儀（美國Bio-Rad公司）；Quant-Studio3型RT-PCR儀（美國ABI公司）。

1.5 藥品與試劑 DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清（Gibco）；青霉素、鏈霉素、4%甲醛、細胞裂解液、臺盼藍、蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒（上海碧云天公司）；CD29、CD44、CD73、CD90（BD公司）CD11b、CD19、CD3、CD34（e Bioscience公司）；CCK-8試劑盒（日本同仁）；TRIzol試劑、PrimeScript TM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex Taq TM試劑盒（日本TaKaRa）；pcr反應引物由金唯智生物科技（北京）有限公司合成；CCND1抗體、MYC抗體、erk1/2抗體（Cell Signaling Technology），β-actin抗體（abcam）；Transwell小室（美國康寧公司）。軟堅清脈顆粒（上海中醫(yī)藥大學附屬上海市中西醫(yī)結合醫(yī)院藥劑科提供，規(guī)格：6 g/袋）。將1 g顆粒溶解于1 mL蒸餾水中，制得溶液。

1.6 實驗方法

1.6.1 軟堅清脈顆粒含藥血清的制備 健康10周齡SD大鼠40只，適應性喂養(yǎng)10天后，將其隨機分為4組，分別為正常對照組和軟堅清脈顆粒低、中、高劑量組，每組10只。正常對照組灌胃給予等體積0.9%NaCl溶液，軟堅清脈顆粒各劑量組分別灌胃0.275 g/（kg·d）、0.550 g/（kg·d）（臨床等效量）、1.100 g/（kg·d）。連續(xù)灌胃10天，早上8點30給藥一次，下午3點30給藥一次，第10天末次給藥完成后1.5 h腹主動脈采血。靜置一個小時后2500 r/min離心10 min，吸取上清，過濾除菌后分裝，-80 ℃保存。利用高效液相色譜儀研究軟堅清脈顆粒含藥血清與正常對照組血清的色譜，其中入血的主要成分為軟堅清脈顆粒的主要藥物活性成分。

1.6.2 BMSCs細胞的分離與培養(yǎng) 將SPF級新生兩周內(nèi)乳鼠脫臼處死后在75%乙醇中泡10 min后分離股骨及脛骨，在完全培養(yǎng)基中剪去骨骺。用完全培養(yǎng)基反復沖洗骨髓腔直至變白。反復吹打細胞懸液使其懸浮后置于培養(yǎng)皿中。將其置于正常培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，此代細胞為原代。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后半換液，丟棄未貼壁的細胞，2天后全換液待細胞融合至80%時加入胰酶消化細胞，在離心管中1000 r/min離心5 min，棄掉上清后重懸細胞，按1∶2傳代后標記為1代。待細胞融合至80%重復上述步驟，取P3代細胞進行流式鑒定及后續(xù)實驗。

1.6.3 BMSCs細胞的鑒定 取P3代BMSCs細胞待融合至80%時，胰酶消化細胞后重懸。在檢測管中放入細胞離心5 min，加入PBS洗滌細胞后，取P3代進行后續(xù)實驗。將細胞編號為1-10號。1號不加任何抗體，2號加入PE同型對照，3號加入CD29-PE，4號加入CD44-PE，5號加入CD73-PE，6號加入CD90-PE，7號加入CD11b-PE，8號加入CD19-PE，9號加入CD31-PE，10號加入CD34-PE，全程避光條件下進行流式檢測。用流式細胞儀檢測相關表達。

1.6.4 實驗分組及細胞處理 取P3代BMSCs細胞隨機分為六組，用完全培養(yǎng)基將其稀釋，在正常培養(yǎng)箱中將其培養(yǎng)24 h。1）正常組更換為完全培養(yǎng)基，置于體積分數(shù)為5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；2）模型組更換為無血清無糖DMEM培養(yǎng)基置于低氧裝置中培養(yǎng)；3）空白血清組更換為無血清無糖DMEM培養(yǎng)基加入“1.6.1”項中正常對照組血清置于低氧裝置中培養(yǎng)；4）中藥低劑量組換為無血清無糖DMEM培養(yǎng)基加入“1.6.1”項中中藥低劑量組血清置于低氧裝置中培養(yǎng)；5）中藥中劑量組換為無血清無糖DMEM培養(yǎng)基加入“1.6.1”項中中藥中劑量組血清置于低氧裝置中培養(yǎng)；6）中藥高劑量組換為無血清無糖DMEM培養(yǎng)基加入“1.6.1”項中中藥高劑量組血清置于低氧裝置中培養(yǎng)。

1.6.5 CCK-8法檢測細胞增殖能力 取P3代BMSCs細胞，用完全培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度，取100 uL接種于96孔板，每孔細胞數(shù)為6000個，設置6個復孔。置于正常培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后按“1.6.4”項條件進行細胞處理。各組細胞分別培養(yǎng)6、12、18、24 h，加入（ck-8）檢測液，培養(yǎng)2 h后，酶標儀測定吸光度值。

1.6.6 qRT-PCR檢測CCND1、MYC、ERK1/2 mRNA的相對表達量 取P3代BMSCs細胞用完全培養(yǎng)基將其稀釋，按“1.6.4”項中意見的六個分組進行造模、給藥。各組分別培養(yǎng)24 h后，收集BMSCs細胞。用Rrizol提取總RNA，檢測RNA的純度和濃度后，取1ug RNA為模板進行反轉(zhuǎn)錄，合成DNA進行實時熒光定量檢測，以人β-actin為內(nèi)參。引物序列見表1。

表1 PCR引物序列

1.6.7 Western blot 檢測CCND1、MYC、ERK1/2蛋白的表達 取P3代BMSCs細胞按“1.6.4”項分組處理后培養(yǎng)24 h。吸取細胞培養(yǎng)液后加入裂解液。冰上裂解30 min后，于4 ℃下14 000 r/min離心10 min后提取總蛋白。采用BCA法測定各組蛋白濃度，采用SDS-PAGE電泳及蛋白進行電轉(zhuǎn)，將PVDF膜封閉于4 ℃過夜；TBST洗膜5 min洗3次；加入相應的一抗4 ℃過夜，TBST洗膜5 min共3次后加入二抗稀釋液孵育1 h；TBST洗膜5 min共3次；蒸餾水漂洗膜2 min，洗3次。將發(fā)光液加至膜表面后孵育5 min，去除發(fā)光液后至暗盒顯影。

1.6.8 Transwell遷移實驗 此實驗用于鑒定預處理后的BMSCs細胞向HUVECs細胞遷移的能力，將BMSCs與HUVECs分別按“1.6.4”項中空白血清組與中藥中劑量組處理方式培養(yǎng)后將其置于低氧培養(yǎng)箱中處理24 h。將5×104個BMSCs細胞重懸于“1.6.4”項中空白血清組或中藥中劑量組的100 μL培養(yǎng)基中并接種于Transwell上室。將5×104個HUVECs重懸于“1.6.4”項中空白血清組或中藥中劑量組的600 μL培養(yǎng)基中并接種于Transwell下室。孵育12 h后，BMSCs遷移到膜下側(cè)，將遷移的細胞用多聚甲醛固定20 min。用PBS洗滌后用1%結晶紫溶液染色30 min。用棉簽從小室上側(cè)擦除非遷移細胞后在顯微鏡下計數(shù)遷移的細胞。

1.6.9 qRT-PCR檢測HUVECs細胞PDGFB、CXCL12、CCL21的相對表達量 取第三代內(nèi)皮細胞用完全培養(yǎng)基將其稀釋，按“1.6.4”項條件中空白血清組與中藥中劑量組處理后將其置于低氧培養(yǎng)箱中處理24 h。加入Trizol試劑提取總RNA后按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄qRT-PCR反應體系置于PCR儀中，程序設置為95 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，循環(huán)40次，72 ℃延伸10 min。PDGFB、CXCL12、CCL25以b2m為內(nèi)參基因，以2-ΔΔCt方法計算相對表達量。擴增引物序列及長度見表2。

1.6.10 qRT-PCR 檢測BMSCs細胞PDGFRB、CXCR4、CCR7的相對表達量 取P3代BMSCs用完全培養(yǎng)基將其稀釋，按“1.6.4”項條件中空白血清組與中藥中劑量組處理方式將其置于低氧培養(yǎng)箱中處理24 h。加入Trizol試劑提取總RNA后按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄后將qRT-PCR反應體系置于PCR儀中，程序設置為95 ℃ 5 min，95 ℃10 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，循環(huán)40次，72 ℃終延伸10 min。PDGFRB、CXCR4、CCR9以b2m為內(nèi)參基因，以2-ΔΔCt方法計算相對表達量。擴增引物序列及長度見表1。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 21.0軟件進行分析，計量資料以表示，采用單因素方差分析，組間多重比較采用Bonferroni法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 BMSCs細胞的鑒定 利用流式細胞儀對骨髓間充質(zhì)干細胞表面抗原進行鑒定，發(fā)現(xiàn)P3代細胞能夠表達CD29、CD44、CD73、CD90，而不表達CD11b、CD19、CD31、CD34，符合間充質(zhì)干細胞的特點。

圖1 大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的流式細胞鑒定結果

2.2 對糖氧剝奪條件下BMSCs細胞增殖的影響 分別將BMSCs細胞于“1.6.4”項條件下進行處理6、12、18、24 h后，CCK-8實驗結果得出：糖氧剝奪6 h時，與正常組相比，模型組增殖效果顯著，組間差異顯著（P＜0.01）；與模型組相比，空白血清組增殖效果不顯著，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與空白血清組相比，中藥低、高劑量組增殖效果較差，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。糖氧剝奪12 h時，與正常組相比，模型組增殖效果顯著，組間差異顯著（P＜0.01）；與模型組相比，空白血清組增殖效果不顯著，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與空白血清組相比，中藥各劑量組差異不顯著（P＞0.05）。糖氧剝奪18 h時，與正常組相比，模型組增殖效果不顯著，組間差異不顯著（P＞0.05）；與模型組相比，空白血清組增殖效果不顯著，差異沒有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與空白血清組相比，中藥各劑量組差異不顯著（P＞0.05）。糖氧剝奪24 h時，與正常組相比，模型組抑制效果顯著（P＜0.01）；與模型組相比，空白血清組增殖效果顯著（P＜0.01）；與空白血清組相比，中藥各劑量組增殖效果顯著（P＜0.01）；與低劑量組相比，中藥中、高劑量組增殖效果顯著（P＜0.01）；與中劑量組相比，中藥高劑量組增殖效果較差，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見表3。

表3 各組大鼠不同時間點BMSCs細胞增殖比較（）

表3 各組大鼠不同時間點BMSCs細胞增殖比較（）

注：a表示與正常組比較，P＜0.01；b表示與模型組比較，P＜0.01；c表示與空白血清組比較，P＜0.01；d表示與中藥低劑量組比較，P＜0.01；e表示與中藥中劑量組比較，P＜0.01

24 h 1.316±0.027 1.036±0.032a 1.114±0.041b 1.221±0.031c 1.363±0.036cd 1.293±0.019cde組別正常組模型組空白血清組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組鼠數(shù)軟堅清脈顆粒劑量（g/kg）8 8 8 8 8 8 O2（%）21 0 0 0 0 0--0 0.275 0.550 1.100 6 h 0.490±0.011 0.569±0.013a 0.584±0.041 0.549±0.018c 0.567±0.008 0.545±0.008ce 12 h 0.625±0.225 0.873±0.014a 0.786±0.019 0.780±0.014 0.760±0.010 0.787±0.013 18 h 0.892±0.321 0.877±0.009 0.909±0.008 0.960±0.006 0.967±0.006 0.937±0.005

2.3 糖氧剝奪條件下24 h BMSCs細胞CCND1、MYC、ERK1/2 mRNA表達的影響 與正常組相比，模型組細胞CCND1、MYC、ERK1/2 mRNA表達降低（P＜0.01）；與模型組相比，空白血清組MYC mRNA表達水平升高（P＜0.01）；與空白血清組相比，軟堅清脈顆粒各劑量組細胞CCND1、MYC、ERK1/2 mRNA表達水平升高（P＜0.01）；與低劑量組相比，軟堅清脈顆粒中、高劑量組CCND1、ERK1/2 mRNA表達水平升高（P＜0.01），中劑量組MYC mRNA表達水平升高（P＜0.01）；與中劑量組相比，高劑量組CCND1 mRNA表達水平升高（P＜0.01），MYC、ERK1/2 mRNA表達水平降低（P＜0.01）。見圖2。

圖2 糖氧剝奪條件下24 hBMSCs細胞CCND1、MYC、ERK1/2 mRNA及蛋白表達比較

2.4 糖氧剝奪條件下24 h BMSCs細胞CCND1、MYC、ERK1/2蛋白表達的影響 與空白組相比，模型組細胞CCND1、MYC、ERK1/2蛋白表達水平下調(diào)；與空白血清組相比，軟堅清脈顆粒各劑量組細胞CCND1、MYC、ERK1/2蛋白表達水平上調(diào)。見圖3。

圖3 糖氧剝奪條件下24 h BMSCs細胞ERK1/2蛋白表達情況

2.5 糖氧剝奪條件下24 h軟堅清脈顆粒含藥血清對BMSCs遷移的影響 Transwell結果顯示：軟堅清脈顆?？梢燥@著促進BMSCs向HUVECs遷移，同對照組比較，BMSCs細胞加藥組，HUVECs細胞加藥組或同時加藥組所遷移的細胞數(shù)量具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見圖4。

圖4 軟堅清脈顆粒含藥血清對BMSCs向HUVECs遷移的情況

2.6 糖氧剝奪條件下24 h軟堅清脈顆粒含藥血清對HUVECs細胞趨化因子表達的影響 同空白血清組相比，中藥中劑量組細胞表面PDGFB、CXCL21表達水平顯著升高。見圖5A。

圖5 糖氧剝奪條件下24 hHUVECs表面趨化因子及BMSCs表面趨化因子受體表達的情況

2.7 糖氧剝奪條件下24 h軟堅清脈顆粒含藥血清對BMSCs細胞表面趨化因子受體表達的影響 同空白血清組相比，中藥中劑量組細胞表面PDGFRB、CXCR4、CCR7表達顯著升高。見圖5B。

3 討論

動脈硬化閉塞癥對應中醫(yī)外科學里的“脫疽”病屬。關于脫疽的記載，最早見于《靈樞·癰疽》篇，其中生動描述了該病的臨床特點，提出了截肢治療方法，曰：“發(fā)于足趾，名脫癰。其狀赤黑，死不治；不赤黑，不死。不衰，急斬之，不則死矣”。其病機以飲食不節(jié)為主要病因，脾虛為本，寒濕外傷為標，血脈瘀阻為其基本病機［15］。

奚九一教授多年臨證總結本病病機不離“痰濕致瘀”，該病患者基本為中老年，加之飲食起居不節(jié)致脾腎虧虛、中焦運化失衡，后漸聚濕生痰、痰血互結、阻絡成瘀；又或痰濕郁而化熱、灼血成瘀。因此，奚九一教授認為濕、熱、痰三邪為該病的主要致病因素［16-17］。進而提出“因邪致瘀”的觀點，即邪入脈絡，致瘀之表象，濕、熱、痰為邪之主要，此三種邪可兼容轉(zhuǎn)化瘀阻脈絡，又可獨立與血搏結致瘀。故本病“內(nèi)生痰濕為本，外感化熱之邪為標”為病機關鍵，臨證注意血瘀為表征，不可遵從，當究其本源三邪，治療應遵循“因邪致瘀，祛邪為先”［18］。中醫(yī)學里的血管屬于“脈”的范疇，在中醫(yī)學中自古以來就認為血脈是可以新生的，雖歷代文獻中沒有明確提出生脈（指血管新生，而非生脈飲之生津復脈之意）概念，但既往“生肌”“生新”“生血”三詞即已包含此意［19］。如“祛瘀生新”就包括祛瘀血生新絡這一含義，強調(diào)絡脈的存在補充了經(jīng)脈線性分布的不足，具有無限可分性和潛在再生性［20］。軟堅清脈方因其針對ASO的“軟堅化痰、祛風除濕、清熱通絡”，當為祛瘀生新的延伸，有著良好的生脈理論基出。臨床應用效果促進側(cè)支循環(huán)效果顯著［21］。實驗研究顯示軟堅清脈方含藥血清可以通過穩(wěn)定基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）抑制缺氧誘導的HUVECs細胞凋亡［22］動物實驗表明軟堅清脈方能夠促進下肢缺血性小鼠血流增加，劑量性的促進VEGF和CD31的表達，對VEGF和PDGF表達具有促進作用，促進下肢血管新生并建立側(cè)支循環(huán)［23］。

對于ASO的治療中醫(yī)學界主要運用活血化瘀法治療，同時輔以“清熱”“化濕”“益氣”“行氣”“溫經(jīng)”和“健脾”等治法，隨證加減。其多以“活血化瘀”為主要治則，雖然亦有佳效，但是長期使用則活血太甚，輕則出現(xiàn)不適癥狀，重則動血傷正［24］；加之血管狹窄閉塞導致局部組織血流減少，而正常血管過度擴張，導致“盜血”，致使局部缺血愈甚，療效難再提高。探索有效修復側(cè)支循環(huán)治療手段是十分需要的。骨髓間充質(zhì)干細胞在各種趨化因子的作用下可動員歸巢至缺血部位參與血管的修復和新生［25］。并且在臨床上有報道顯示，骨外科常運“骨搬移”技術來促進骨缺損，誘導BMSCs可分化為HUVECs參與血管生成［26］。骨髓間充質(zhì)干細胞的歸巢率直接決定了其治療效果，所以只有在治療中有一個可觀的歸巢率，才能保證其療效。

SDF-1/CXCR4軸的主要功能之一是調(diào)節(jié)前體細胞的移植、趨化及歸巢至損傷部位，是介導BMSCs遷移分布的關鍵信號［27］。相關研究表明，BMSCs在治療缺血性疾病在跨內(nèi)皮細胞遷移時CCL25，CCL19表達都又顯著升高［28］，更有研究表明msc表面可以表達趨化因子受體CCR9、CCR7、CXCR6等［29］。PDGF促進骨髓間充質(zhì)干細胞遷移并形成新生血管［30-31］。

本次在實驗中采用CCK-8法觀察骨髓間充質(zhì)干細胞的增殖情況，統(tǒng)計結果顯示模型組在6、12 h時增殖顯著，但中藥對BMSCs的干預無明顯作用，差異無統(tǒng)計學意義。但在24 h時，藥物的增殖作用出現(xiàn)了顯著性差異，骨髓間充質(zhì)干細胞自身能量消耗后，中藥維持了其數(shù)量。且中高劑量組效果明顯，說明藥物需要達到一定濃度時才能體現(xiàn)其作用。同時在Transwell實驗中，當BMSCs與HUVECs同時加藥時，遷移效果顯著。證明軟堅清脈顆粒含藥血清對于BMSCs的遷移作用可能是對兩種細胞同時發(fā)揮作用的。因此我們認為軟堅清脈顆粒可能通過促進BMSCs細胞增殖遷移從而促進血管新生、建立側(cè)支循環(huán)進而改善缺血肢體遠端組織血供。

不足之處：此實驗為體外細胞實驗，軟堅清脈顆粒在體內(nèi)是否促進BMSCs的實驗有待進一步驗證：軟堅清脈方為成方，有效成分復雜，在發(fā)生增殖及趨化作用中起具體作用的成分有待進一步探尋。