針刀對肌性斜頸模型兔胸鎖乳突肌中calpain-1、CD45、MMP-2、TIMP-2蛋白表達的影響

高國莉

河北醫(yī)科大學第三醫(yī)院，河北 石家莊 050051

肌性斜頸（congenital muscular torticollis，CMT）以一側(cè)胸鎖乳突肌間質(zhì)纖維化及攣縮為主，導致患兒頭頸部向患側(cè)偏斜，下頜部轉(zhuǎn)向健側(cè)，患兒出現(xiàn)頭頸部和下頜部向患側(cè)不能轉(zhuǎn)動或活動受限，是小兒常見疾患之一［1-2］。隨著年齡增長，若不及時治療，CMT兒童病情逐漸加重，出現(xiàn)顱面部不對稱，嚴重者可出現(xiàn)斜頭畸形及脊柱側(cè)凸等癥狀，手法干預較困難，需要進行手術(shù)治療［3-5］。目前CMT的臨床治療手段包括超聲短波、手術(shù)及中醫(yī)推拿按摩、針灸、針刀治療。研究發(fā)現(xiàn)，針刀較推拿按摩能夠明顯縮短胸鎖乳突肌腫塊直徑，并且腫塊縮小程度明顯大于推拿按摩［6］。研究表明，針刀可以對病變組織起到剝離粘連、松解攣縮、疏通堵塞，鎮(zhèn)痛減壓、促進局部微循環(huán)、調(diào)節(jié)免疫等作用，但是針刀的具體作用機制尚未明確。骨骼肌出現(xiàn)萎縮，提示肌纖維中的蛋白含量減少［7］，其中鈣蛋白酶1（calpain-1）是ATP-泛素-蛋白酶體途徑的上游，可確保肌聯(lián)蛋白和伴肌動蛋白降解［8］。分化抗原決定簇45（CD45）是一種特異性受體，定位于T細胞細胞膜上，能特異識別組織相容性復合體呈遞的抗原，兩者結(jié)合激活T細胞，促進其分化、發(fā)育［9］。基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）與骨骼肌損傷后的修復和再生階段有關(guān)［10］，而基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子2（matrix metalloproteinase-2，TIMP-2）是其重要的內(nèi)源性調(diào)節(jié)因子，能夠抑制MMPs的活性。本研究觀察針刀與按摩對肌性斜頸模型兔胸鎖乳突肌中calpain-1、CD45、MMP-2、TIMP-2蛋白表達的影響，探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康SPF級新西蘭兔48只，雌雄各24只，周齡為4～5周，體質(zhì)量2.0～3.0 kg，購于北京實驗動物研究中心，實驗動物許可證號：SCXK（京）2018-0016。實驗期間實驗動物可自由飲水、進食及活動。本研究經(jīng)河北醫(yī)科大學第三醫(yī)院倫理委員會審批（倫理審批號：2019-007）。

1.2 試劑及儀器 TUNEL試劑盒（德國羅氏公司40308ES50）；一抗calpain-1為兔多克隆抗體（美國abcam公司，批號：ab239930），一抗CD45為兔多克隆抗體（美國abcam公司，批號：ab40763）；一抗MMP-2為兔多克隆抗體（美國abcam公司，批號：ab213910），一抗TIMP-2為兔多克隆抗體（美國abcam公司，批號：ab180630）；二抗辣根酶標記山羊抗兔IgG（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。漢章牌一次性針刀（0.40 mm×40 mm，北京華夏針刀醫(yī)療器械廠），無水酒精（國藥集團化學試劑有限公司，批號：100092680）。FS/FAS5030石蠟切片機（德國LETIZ公司），全自動免疫組化染色機［徠卡顯微系統(tǒng)（上海）貿(mào)易有限公司BOND-MAX］，Nikon eclipse50i光學顯微鏡（日本Nikon株式會社）。

1.3 實驗方法

1.3.1 造模方法 參照文獻［11］研究方法，選取右側(cè)胸鎖乳突肌中段注射部位常規(guī)消毒，用注射器吸入無水酒精后做肌肉注射，回抽無回血后緩慢注射，注射量按照1 mL/kg標準，15天后形成肌性斜頸動物模型。造模成功表現(xiàn)：模型組鏡下可以非常明顯觀察到成片的肌細胞變性、壞死，炎性細胞浸潤，SCM間質(zhì)增生以及大量組織纖維化，模型組周圍組織可見明顯、大量陽性反應產(chǎn)物（α-SMA），陽性反應區(qū)呈彌漫性分布。

1.3.2 分組及干預 由SPSS軟件產(chǎn)生兩組隨機數(shù)，將實驗動物性別分為兩組，再按照體質(zhì)量升序排列將其隨機分為正常組、模型組、針刀組、按摩組，每組各12只，雌雄各半。正常組：不做任何處理，常規(guī)飼養(yǎng)。模型組：造模成功后不做任何干預治療，常規(guī)飼養(yǎng)。針刀組：造模成功后動物固定在治療臺上，對其頸部進行觸診，每次選取斜方肌起點、胸鎖乳突肌乳突附著點及局部硬結(jié)或條索狀物2～3個點定為針刀進針部位，記號筆標記，常規(guī)備皮、消毒，然后刺入針刀，于進針部位先行縱向疏通，再輔以橫向剝離等手法操作，出針并按壓3 min止血，每周1次，4次為1個療程，療程間休息2天，共治療2個療程。按摩組：造模成功后，采用拿揉法，以單手拇指指腹與食、中二指指腹相對，拿持住模型兔的胸鎖乳突肌作吸定基出之上的回旋與提起揉動，邊拿揉邊沿胸鎖乳突肌纖維方向從上至下緩緩移動，在移動中若發(fā)現(xiàn)指下有結(jié)塊，則定點揉動1 min。頻率為120次/min，每次操作5 min，每天操作1次，10次為1個療程，療程間休息2天，共治療5個療程。

1.3.3 標本采集 治療結(jié)束后，沿實驗動物耳背靜脈注入空氣致死，沿右側(cè)胸鎖乳突肌外緣作縱切口，暴露出完整的胸鎖乳突肌，取胸鎖乳突肌中段組織約0.5 cm，進行HE染色和免疫組化檢測。

1.4 觀察指標

1.4.1 效應觀察 治療后觀察各組實驗動物頸部活動情況，以及是否出現(xiàn)斜頸、頭頸不對稱表現(xiàn)，觀察胸鎖乳突肌色澤、粗細、血管等。

1.4.2 calpain-1、CD45、TIMP-2及MMP-2表達 采用HE染色和免疫組織化學染色檢測各組兔胸鎖乳突肌中段肌肉組織中calpain-1、CD45、MMP-2、TIMP-2的表達情況。

1.5 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以表示，采用完全隨機設(shè)計資料方差分析，方差齊則組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，方差不齊則組間兩兩比較采用Dunnett's T3檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 效應觀察 與正常組比較，其余各組動物明顯出現(xiàn)頸部活動受限、斜頸、頭頸不對稱癥狀，治療結(jié)束后，針刀組和按摩組實驗動物頸部活動受限明顯改善，頭頸無明顯不對稱。見表1。

表1 各組兔治療結(jié)束后胸鎖乳突肌形態(tài)學表現(xiàn)

2.2 機制探討

2.2.1 calpain-1表達 正常組中肌性斜頸細胞表達較少；模型組中表達量多，呈強陽性表達，鏡下表現(xiàn)為多量膠原纖維包繞呈萎縮或變性；針刀組和按摩組表達較模型組明顯減少，呈弱陽性表達。與正常組比較，模型組、按摩組上調(diào)（P＜0.01）；與模型組比較，針刀組、按摩組下調(diào)（P＜0.01）；與針刀組比較，按摩組上調(diào)（P＜0.01）。見表2、圖1。

圖1 各組兔calpain-1表達免疫組化圖（HE，×100）

表2 各組兔肌性斜頸細胞中calpain-1、CD45、MMP-2及TlMP-2表達量比較（）%

表2 各組兔肌性斜頸細胞中calpain-1、CD45、MMP-2及TlMP-2表達量比較（）%

注：與正常組比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；與模型組比較，#表示P＜0.05，##表示P＜0.01；與針刀組比較，△表示P＜0.05，△△表示P＜0.01

TIMP-2 7.21±2.72 17.21±3.84**6.07±2.11##10.75±2.93*##△△24.806＜0.001組別正常組模型組針刀組按摩組兔數(shù)12 12 12 12 CD45 5.6±3.1 15.6±2.3**6.2±1.4##10.4±1.8**##△△53.525＜0.001 calpain-1 10.4±5.3 47.9±14.6**11.3±8.2##20.4±10.7**##△△42.233＜0.01 F P MMP-2 6.83±2.44 2.65±1.34**6.44±2.27##4.57±1.80#△9.043＜0.001

2.2.2 CD45免疫表達 CD45陽性表達為細胞膜有黃棕色顆粒。在正常組及針刀組中表現(xiàn)較少，而在模型組中大量表達。與正常組比較，模型組、按摩組上調(diào)（P＜0.01）；與模型組比較，針刀組、按摩組下調(diào)（P＜0.01）；與針刀組比較，按摩組上調(diào)（P＜0.01）。見表2、圖2。

圖2 各組兔CD45表達免疫組化圖（HE，×100）

2.2.3 MMP-2免疫表達 MMP-2的表達多在細胞的胞質(zhì)，表現(xiàn)為棕黃色或者棕褐色顆粒。模型組及針刀組中表現(xiàn)較多，模型組表現(xiàn)較少。與正常組比較，模型組下調(diào)（P＜0.01），與模型組比較，針刀組、按摩組上調(diào)（P＜0.05）；與針刀組比較，按摩組下調(diào)（P＜0.05）。見表2、圖3。

圖3 各組兔MMP-2表達免疫組化圖（HE，×100）

2.2.4 TIMP-2免疫表達 TIMP-2的表達多在細胞的胞質(zhì)，表現(xiàn)為棕黃色或者棕褐色顆粒。與正常組比較，模型組、按摩組上調(diào)（P＜0.01），與模型組比較，針刀組、按摩組下調(diào)（P＜0.01）；與針刀組比較，按摩組上調(diào)（P＜0.01）。見表2、圖4。

圖4 各組兔TIMP-2表達免疫組化圖（HE，×100）

3 討論

CMT是因一側(cè)胸鎖乳突肌（sternocleidomastoid muscle，SCM）因不同原因出現(xiàn)間質(zhì)纖維化，最終出現(xiàn)肌肉攣縮，導致頭頸部向患側(cè)一方偏斜，易造成患側(cè)面部與健側(cè)不對稱，患側(cè)面部偏小，同時限制頭頸部轉(zhuǎn)向患側(cè)一方。胸鎖乳突肌出現(xiàn)此種變化不僅僅是簡單纖維化的結(jié)果，是動態(tài)變化過程［7］。

骨骼肌出現(xiàn)萎縮提示肌肉體積較正常變小，肌纖維縮小，肌纖維中的蛋白含量減少［8-9］。其中肌內(nèi)肌球蛋白、肌凍蛋白含量均減少。以上兩種蛋白與肌纖維收縮功能有著密切關(guān)系［10］。與鈣依賴的蛋白酶途徑和ATP-泛素-蛋白酶體途徑相關(guān)，而鈣蛋白酶途徑是ATP-泛素-蛋白酶體途徑的上游，是確保肌聯(lián)蛋白和伴肌動蛋白降解［11］。本研究結(jié)果表明，模型組中，calpain-1在肌性斜頸肌纖維中表達多量，呈強陽性表達，calpain-1為多量膠原纖維包繞呈萎縮或變性。在按摩組和針刀組，calpain-1在肌性斜頸肌纖維中表達較模型組明顯減少，呈弱陽性表達。針刀組calpain-1表達水平較按摩組和模型組下降。

肌性斜頸病理特點顯示膠原沉積在間質(zhì)其中，且在肌細胞周邊沉積多量成纖維細胞，兩者共同作用導致肌纖維化改變，在肌細胞中混雜大量成纖維細胞［10］。在頸部患側(cè)群肌肉中存在CD45。CD45陽性表達為細胞膜有黃棕色顆粒。本研究結(jié)果顯示：針刀組CD45表達水平低于按摩組和模型組。

檢測MMP-2在模型組中強陽性表達較正常組、針刀組、按摩組明顯減少。MMP2主要水解的膠原物有Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ、Ⅺ、Ⅸ型膠原及明膠（膠原降解后的產(chǎn)物），降解非膠原的細胞外基質(zhì)有纖維連接蛋白、層粘連蛋白、蛋白多糖連接蛋白、多功能蛋白聚糖、彈力蛋白及骨結(jié)合素。研究表明，MMP2與骨骼肌損傷后的修復和再生階段有關(guān)，在運動48 h和120 h這個階段，運動針刺組MMP2的蛋白表達高于運動組，也說明運動針刺可以提高MMP2的含量［11］。針刀組中MMP-2的表達水平高于模型組和按摩組。本研究結(jié)果表明，針刀組中病變組織，肌細胞萎縮，MMP-2表達增加，TIMP-2表達下降，提示纖維組織減少，而肌肉組織有所增加。

CMT的主要發(fā)病機制為分娩時一側(cè)胸鎖乳突肌受產(chǎn)道擠壓或產(chǎn)鉗助產(chǎn)牽拉，間質(zhì)纖維化，椎周軟組織的急慢性損傷引起無菌性炎癥，以及組織間的疤痕、粘連及攣縮，刺激、卡壓穿行其間的血管、神經(jīng)，同時粘連、攣縮的椎周軟組織可牽拉其附著的椎骨發(fā)生力平衡失調(diào)，最終出現(xiàn)肌肉攣縮，導致肌性斜頸。拿揉按摩法可使細胞蛋白分解，促進組織修復，加速病變產(chǎn)物的吸收，使肌攣縮得以改善。兩種方法治療CMT，但是針刀療法作用更為直接，具有更好的臨床療效。

綜上所述，針刀治療肌性斜頸可改善局部肌肉攣縮情況，能促進肌肉組織增加，能改善預后。其作用機制可能與減少calpain-1、CD45、TIMP-2表達，增加MMP-2表達有關(guān)。