藏紅花素通過PI3K/Akt/GSK-3β通路誘導人乳腺癌細胞凋亡的初步研究*

趙寧，夏利敏，宋濤

邯鄲市中心醫院，河北 邯鄲 056001

乳腺癌是全球女性最常見的惡性腫瘤之一，每年新發病例超過150萬，并且仍以年度約2%的速度在增長，嚴重威脅著女性的生命健康。目前，手術切除并輔助放化療是臨床治療乳腺癌的首選治療方案，但化療藥物毒副作用廣泛且易產生耐藥性［1-2］。中醫藥因其整體調理、標本兼治、毒副作用小的優點，在腫瘤治療方面得到了廣泛的關注與認可。藏紅花素為我國傳統中藥藏紅花的主要活性成分，屬于水溶性類胡蘿卜素化合物，具有抗炎、抗氧化等多種生物學活性［3-4］。近年來藥理學研究發現，藏紅花素具有抗腫瘤活性，能夠誘導細胞凋亡，延緩胃癌、胰腺癌、卵巢癌的進展［5-7］。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/糖原合成酶激酶3β（phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B/ glycogen synthase kinase-3β，PI3K/Akt/GSK-3β）信號通路在細胞凋亡過程中發揮著重要的調控作用，并且有研究報道，藏紅花素能夠通過調控PI3K/Akt/GSK-3β信號通路，促進人食管鱗狀細胞癌KYSE-150細胞凋亡［8-9］。本研究于2019年6月至2020年4月通過體外培養人正常乳腺MCF-10A細胞和人乳腺癌MCF-7細胞，并給予藏紅花素進行干預，探討藏紅花素對人乳腺癌細胞凋亡及PI3K/Akt/GSK-3β信號通路的影響，現報道如下：

1 材料與方法

1.1 細胞 人正常乳腺MCF-10A細胞和人乳腺癌MCF-7細胞株購自中國科學院上海細胞庫（貨號：SCSP-575、SCSP-531）。

1.2 藥物與試劑 藏紅花素（美國Sigma公司，批號：E180924b）；LY294002、胰蛋白酶（美國Sigma公司，批號：L9762、190106）；DMEM培養基（高糖）、胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司，批號：190509、190611）；四甲基偶氮唑藍（MTT）（美國AMRESCO公司，批號：1324B37）；Annexin V-FITC試劑盒（江蘇凱基生物技術股份有限公司，批號：20190417）；PI3K、磷酸化PI3K（p-PI3K）、Akt、磷酸化Akt（p-Akt）、GSK-3β、磷酸化GSK-3β（p-GSK-3β）、半胱氨酸天門冬氨酸蛋白酶9（cysteine aspartic proteases-9，Caspase-9）、激活型半胱氨酸天門冬氨酸蛋白酶3（cleaved cysteine aspartate protease-3，Cleaved Caspase-3）、B淋巴細胞瘤2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2 related X protein，Bax）抗體（北京博奧森生物技術有限公司，貨號：bs-10276R、bs-5570R、bs-6951R、bs-0876R、bs-0023R、bs-5368R、bs-5241R、bs-0081R、bs-20352R、bs-4564R）；增強化學發光（ECL），超敏化學發光液（美國Thermo Fisher Scientific公司，批號：34580）。

1.3 細胞培養 人正常乳腺MCF-10A細胞和人乳腺癌MCF-7細胞株復蘇后用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基進行培養，培養設置條件：5%二氧化碳、恒溫37 ℃、飽和濕度，每2天換液1次，觀察并記錄細胞生長狀態。取對數生長期MCF-10A細胞和MCF-7細胞分別給予DMSO（空白對照組）、終濃度200、400、800 mg/L的藏紅花素溶液［10］和15 mg/L的LY294002溶液［11］。

1.4 MTT法測定細胞增殖抑制率 藥物干預48 h后，滴加0.25%胰酶進行消化后計數細胞、制備濃度1×105個/mL單細胞懸液，100 μL/孔接種于96孔培養板，每組設10個復孔。10 μL/孔加入濃度5 μg/mL的MTT溶液，繼續培養4 h后更換培養液并加入150 μL 二甲基亞砜（DMSO）終止反應，通過酶標儀檢測各組細胞490 nm處吸光度值（A490 nm）。

增殖抑制率（%）=（1-A實驗組）/A空白對照組×100%

1.5 細胞克隆實驗檢測細胞克隆能力 藥物干預48 h后更換不含藥培養基，繼續常規培養14天后離心（離心半徑10 cm，1500 r/min離心5 min）取細胞，經PBS溶液洗滌后，4%多聚甲醛溶液固定15 min、0.5%結晶紫染液染色30 min并晾干后，通過顯微鏡觀察并計數細胞。

1.6 Annexin V-FlTC染色法檢測細胞凋亡水平 藥物干預48 h后，滴加0.25%胰酶進行消化后計數細胞、制備濃度1×106個/mL單細胞懸液，1 mL/孔接種于96孔培養板，每組設10個復孔。500 μL/孔滴加濃度1%的FITC染液并避光孵育10 min后通過流式細胞儀檢測細胞凋亡水平。

1.7 Western blot法檢測細胞蛋白表達 藥物干預48 h后離心（離心半徑10 cm，1500 r/min離心5 min）取細胞，4 ℃超聲破碎處理后離心（離心半徑10 cm，12 000 r/min離心20 min）取上清，二喹啉甲酸（BCA）法定量蛋白濃度、沸水浴變性后行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉聚偏二氟乙烯（PVDF）膜、5%脫脂牛奶封閉1 h，滴加一抗4 ℃孵育12 h，滴加二抗37 ℃孵育1 h，用磷酸鹽緩沖溶液充分洗滌后滴加ECL顯色，運用凝膠成像系統獲得條帶；以β-actin為內參，以條帶灰度值半定量目標蛋白表達。

1.8 統計學方法 運用SPSS 13.0軟件進行數據統計分析，計量資料以方式表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 藏紅花素對人正常乳腺MCF-10A細胞和人乳腺癌MCF-7細胞克隆能力的影響 與空白對照組相比，200、400、800 mg/L藏紅花素組和LY294002組MCF-10A細胞克隆數目差異均無統計學意義（P＞0.05），400、800 mg/L藏紅花素組和LY294002組MCF-7細胞克隆數目較空白對照組顯著降低（P＜0.01）；與LY294002組相比，800 mg/L藏紅花素組MCF-7細胞克隆數目顯著降低（P＜0.05）。見圖1—2、表1—2。

表1 藏紅花素對人正常乳腺MCF-10A細胞增殖抑制率、克隆數目和凋亡率的影響（）

表1 藏紅花素對人正常乳腺MCF-10A細胞增殖抑制率、克隆數目和凋亡率的影響（）

組別空白對照組藏紅花素200 mg/L組藏紅花素400 mg/L組藏紅花素800 mg/L組LY294002 15 mg/L組復孔數10 10 10 10 10增殖抑制率（%）4.13±0.45 4.36±0.48 4.29±0.46 4.34±0.49 4.35±0.48克隆數目（個）762.40±164.21 796.50±173.59 804.60±154.36 798.10±177.42 787.20±163.07凋亡率（%）3.41±0.40 3.62±0.47 3.59±0.45 3.71±0.48 3.65±0.46

表2 藏紅花素對人乳腺癌MCF-7細胞增殖抑制率、克隆數目和凋亡率的影響（）

表2 藏紅花素對人乳腺癌MCF-7細胞增殖抑制率、克隆數目和凋亡率的影響（）

注：與空白對照組比較，**表示P＜0.01；與LY294002 15 mg/L組比較，△表示P＜0.05，△△表示P＜0.01

凋亡率（%）2.86±0.34 13.54±1.72**21.73±3.08**34.28±5.10**△△27.35±4.82**組別空白對照組藏紅花素200 mg/L組藏紅花素400 mg/L組藏紅花素800 mg/L組LY294002 15 mg/L組復孔數10 10 10 10 10增殖抑制率（%）3.95±0.42 16.31±2.84**25.06±5.15**39.62±6.19**△33.70±5.03**克隆數目（個）1952.86±248.41 1680.95±231.62 1427.64±218.59**1245.57±184.30**△1481.06±209.21**

圖1 各組人正常乳腺MCF-10A細胞克隆形成狀況

圖2 各組人乳腺癌MCF-7細胞克隆形成狀況

2.2 藏紅花素對人正常乳腺MCF-10A細胞和人乳腺癌MCF-7細胞增殖的影響 較空白對照組，200、400、800 mg/L藏紅花素組和LY294002組MCF-10A細胞增殖抑制率差異均無統計學意義（P＞0.05），400、800 mg/L藏紅花素組和LY294002組MCF-7細胞增殖抑制率升高（P＜0.01）；與LY294002組比較，800 mg/L藏紅花素組MCF-7細胞增殖抑制率升高（P＜0.05）。見表1—2。

2.3 藏紅花素對人正常乳腺MCF-10A細胞和人乳腺癌MCF-7細胞凋亡的影響 較空白對照組，200、400、800 mg/L藏紅花素組和LY294002組MCF-10A細胞凋亡水平差異均無統計學意義（P＞0.05），200、400、800 mg/L藏紅花素組和LY294002組MCF-7細胞凋亡水平升高（P＜0.01）；較LY294002組，800 mg/L藏紅花素組MCF-7細胞凋亡水平升高（P＜0.01）。見圖3—4，表1—2。

圖3 各組人正常乳腺MCF-10A細胞凋亡狀況

圖4 各組人乳腺癌MCF-7細胞凋亡狀況

2.4 藏紅花素對人乳腺癌MCF-7細胞Pl3K、p-Pl3K、Akt、p-Akt、GSK-3β、p-GSK-3β蛋白表達的影響 400、800 mg/L藏紅花素組和LY294002組MCF-7細胞p-PI3K、p-Akt、p-GSK-3β蛋白表達較空白對照組下調（P＜0.01），PI3K、Akt、GSK-3β磷酸化率（p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-GSK-3β/GSK-3β）較空白對照組降低（P＜0.01）；800 mg/L藏紅花素組與LY294002組比較，各指標差異無統計學意義（P＞0.05）。表3—5，見圖5。

表3 藏紅花素對人乳腺癌Pl3K、p-Pl3K蛋白相對表達量及Pl3K磷酸化率的影響（）

表3 藏紅花素對人乳腺癌Pl3K、p-Pl3K蛋白相對表達量及Pl3K磷酸化率的影響（）

注：與空白對照組比較，**表示P＜0.01

p-PI3K/PI3K 0.54±0.11 0.46±0.09 0.24±0.06**0.12±0.03**0.14±0.04**組別空白對照組藏紅花素200 mg/L組藏紅花素400 mg/L組藏紅花素800 mg/L組LY294002 15 mg/L組復孔數10 10 10 10 10 PI3K/β-actin 0.95±0.24 0.93±0.28 1.04±0.25 1.01±0.26 0.97±0.25 p-PI3K/β-actin 0.51±0.13 0.43±0.10 0.26±0.07**0.12±0.03**0.14±0.03**

表4 藏紅花素對人乳腺癌Akt、p-Akt蛋白相對表達量及Akt磷酸化率的影響（）

表4 藏紅花素對人乳腺癌Akt、p-Akt蛋白相對表達量及Akt磷酸化率的影響（）

注：與空白對照組比較，**表示P＜0.01

p-Akt/Akt 0.91±0.24 0.72±0.20 0.54±0.16**0.27±0.08**0.32±0.10**組別空白對照組藏紅花素200 mg/L組藏紅花素400 mg/L組藏紅花素800 mg/L組LY294002 15 mg/L組復孔數10 10 10 10 10 Akt/β-actin 1.12±0.27 1.09±0.29 1.03±0.26 1.10±0.27 1.05±0.28 p-Akt/β-actin 1.02±0.28 0.78±0.22 0.56±0.14**0.30±0.05**0.34±0.06**

表5 藏紅花素對人乳腺癌GSK-3β、p-GSK-3β蛋白相對表達量及GSK-3β磷酸化率的影響（）

表5 藏紅花素對人乳腺癌GSK-3β、p-GSK-3β蛋白相對表達量及GSK-3β磷酸化率的影響（）

注：**表示與空白對照組比較，P＜0.01

p-GSK-3β 0.69±0.19 0.62±0.17 0.24±0.07**0.18±0.05**0.22±0.06**組別空白對照組藏紅花素200 mg/L組藏紅花素400 mg/L組藏紅花素800 mg/L組LY294002 15 mg/L組復孔數10 10 10 10 10 GSK-3β/β-actin 0.93±0.26 0.91±0.23 0.92±0.25 0.90±0.22 0.92±0.24 p-GSK-3β/β-actin 0.64±0.18 0.56±0.15 0.22±0.06**0.16±0.04**0.20±0.05**

圖5 各組人乳腺癌MCF-7細胞PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、GSK-3β、p-GSK-3β蛋白表達

2.5 藏紅花素對人乳腺癌MCF-7細胞Caspase-9、Cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達的影響 400、800 mg/L藏紅花素組和LY294002組MCF-7細胞Caspase-9、Cleaved Caspase-3、Bax蛋白表達較空白對照組上調，而Bcl-2表達較空白對照組下調（P＜0.01），Bax/Bcl-2比值升高（P＜0.01）；800 mg/L藏紅花素組MCF-7細胞Caspase-9、Cleaved Caspase-3、Bax表達較LY294002組上調，且Bax/Bcl-2比值較LY294002組升高（P＜0.05或P＜0.01），其他指標兩組間差異無統計學意義（P＞0.05）。見表6、圖6。

表6 藏紅花素對人乳腺癌Caspase-9、Cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白相對表達量及Bax/Bcl-2比值的影響（）

表6 藏紅花素對人乳腺癌Caspase-9、Cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白相對表達量及Bax/Bcl-2比值的影響（）

注：與空白對照組比較，**表示P＜0.01；與LY294002組比較，△表示P＜0.05，△△表示P＜0.01

組別空白對照組藏紅花素200 mg/L組藏紅花素400 mg/L組藏紅花素800 mg/L組LY294002 15 mg/L組Bax/Bcl-2 0.38±0.07 0.53±0.11**1.09±0.20**3.56±0.68**△△2.47±0.49**復孔數10 10 10 10 10 Caspase-9/β-actin 0.08±0.02 0.23±0.04**0.35±0.07**0.61±0.13**△△0.19±0.05**Cleaved Caspase-3/β-actin 0.11±0.03 0.13±0.04 0.26±0.05**0.69±0.16**△△0.41±0.07**Bcl-2/β-actin 0.45±0.08 0.38±0.07 0.30±0.05**0.18±0.04**0.21±0.05**Bax/β-actin 0.17±0.04 0.20±0.05 0.33±0.07**0.64±0.11**△0.52±0.08**

圖6 各組人乳腺癌MCF-7細胞Caspase-9、Cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達

3 討論

乳腺癌屬中醫“乳巖”“乳石癰”“妒乳”等范疇，其病機為情志不舒、氣血紊亂、肝氣郁結［12-13］。藏紅花首載于《本草綱目》，具有活血化瘀、涼血解毒之功效，藏紅花素為藏紅花的主要活性成分。本研究發現，400、800 mg/L藏紅花素和LY294002能夠明顯提高人乳腺癌MCF-7細胞增殖抑制率和凋亡率，降低MCF-7細胞克隆能力，800 mg/L藏紅花素上述作用優于LY294002，提示藏紅花素具有抑制人乳腺癌MCF-7細胞增殖和誘導其凋亡的作用。

細胞凋亡是由多種基因調控的自主程序化死亡過程，細胞凋亡受阻是腫瘤細胞異常生長的重要因素。Cleaved Caspase-3參與細胞凋亡的啟動與執行，是細胞內最重要的促凋亡因子［14］。Bcl-2家族蛋白在細胞凋亡過程中發揮著重要作用，其中Bax能夠誘導線粒體膜通道異常開放，導致細胞色素C（cytochrome C，Cyt C）釋放入細胞質，而Cyt C能夠剪切激活Caspase-3；主要表達于線粒體膜的Bcl-2能夠與Bax形成異源二聚體，從而對線粒體膜通透性起到保護作用，因此Bcl-2表現為抑凋亡作用，因此Bax/Bcl-2比值能夠反映二者對細胞凋亡的真實調控作用［15-16］。本研究發現，400、800 mg/L藏紅花素和LY294002能夠明顯上調人乳腺癌MCF-7細胞Cleaved Caspase-3、Bax表達并下調Bcl-2表達，顯著提高Bax/Bcl-2比值，800 mg/L藏紅花素上述作用優于LY294002，這可能是藏紅花素誘導人乳腺癌MCF-7細胞凋亡的重要分子機制。

PI3K被磷酸化（p-PI3K）后能夠誘導其下游效應分子Akt磷酸化（p-Akt）活化。GSK-3β是一種多效應激酶，具有誘導Cyt C釋放并激活Caspase-3的生理活性，表現為促凋亡作用；而GSK-3β為Akt下游靶分子，p-Akt能夠誘導GSK-3β磷酸化（p-GSK-3β）而失活。因此，PI3K/Akt/GSK-3β信號通路在細胞凋亡過程中發揮著重要調控作用［17-18］。Caspase-9是Caspase-3重要的活化刺激因子，而既往研究發現，p-Akt能夠誘導Caspase-9磷酸化失活，進而間接抑制Caspase-3活化［19］。本研究發現，400、800 mg/L藏紅花素和LY294002能夠明顯下調人乳腺癌MCF-7細胞p-PI3K、p-Akt、p-GSK-3β表達，并降低磷酸化率；800 mg/L藏紅花素組與LY294002組各指標差異無統計學意義，提示藏紅花素具有抑制MCF-7細胞PI3K/Akt/GSK3β信號通路的作用。

綜上所述，藏紅花素具有誘導人乳腺癌MCF-7細胞凋亡的作用，其機制可能與抑制PI3K/Akt/GSK3β信號通路進而影響凋亡相關蛋白表達有關。本研究結果還需開展動物實驗進行驗證。