槲皮素對奈瑟球菌感染腦膜炎大鼠腦保護作用的研究*

王旭東，朱海生，李曉蕾，麻瑞娟

邯鄲市中心醫院，河北 邯鄲 056001

細菌性腦膜炎是一種中樞神經系統感染性疾病，兒科較為多見。及時應用抗菌藥物能夠明顯改善細菌性腦膜炎患者轉歸，但仍有20%的患者死亡，約30%的患者留下腦麻痹、癲癇、聽力損傷、認知障礙等永久性神經系統后遺癥［1-2］。革蘭氏陰性菌被殺滅解體后，其細胞壁中的內毒素脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）釋放入血，引發內毒素血癥，破壞腦組織結構，是導致患者死亡的主要因素之一［3］，而抗菌藥物不能有效控制LPS水平的升高［4］。槲皮素（Quercetin，Que）是一種天然存在的黃酮醇化合物，對內毒素所致肺損傷、心肌損傷具有保護作用［5-6］。腦膜炎奈瑟球菌屬革蘭氏陰性菌，是細菌性腦膜炎常見致病菌之一，氨芐青霉素（ampicillin，AMP）是臨床治療革蘭氏陰性菌感染腦膜炎的一線用藥。本實驗通過小延髓池注射奈瑟球菌懸液制備奈瑟球菌感染腦膜炎大鼠模型，以AMP為陽性對照藥物，研究Que對奈瑟球菌感染腦膜炎大鼠腦組織的保護作用及其機制，現將研究結果報道如下：

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級2周齡SD大鼠180只，雌雄不限，體質量（75±5）g，購自河北醫科大學實驗動物中心，實驗動物許可證號：SCXK（冀）2018-004。飼養條件：在室溫（25±1）℃、相對濕度（60±5）%、光照黑暗各12 h交替的環境中飼養3天后開展實驗。動物實驗遵守實驗動物福利倫理審查指南。

1.2 藥物與試劑 腦膜炎奈瑟球菌由邯鄲市中心醫院微生物室提供；Que（純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司，批號：B20527）；注射用氨芐西林鈉（齊魯制藥有限公司，批號：2020B011302，規格：0.5 g/瓶）；HE染色試劑盒和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）酶聯免疫（ELISA）試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號：G1120、SEKR-0009、SEKR-0002、SEKR-0005）；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）ELISA試劑盒和BCA試劑盒（江蘇晶美生物科技有限公司，批號：JM-02053R1、JM-100009A）；p65、IκBα、高遷移率族蛋白1（HMGB1）、β-actin抗體和IgG二抗（北京博奧森生物科技有限公司，批號：bs-20159R、bs-1287R、bs-55098R、bs-0061R、bs-0295G）。

1.3 分組、造模及給藥 將180只實驗大鼠按照隨機數字表法分為6組，分別為正常對照組，模型組，AMP組和Que低、中、高劑量組，每組30只。除正常對照組外，其余各組大鼠均采用小延髓池注射10 μL奈瑟球菌懸液（濃度1×108個/L）的方法制備奈瑟球菌感染腦膜炎大鼠模型。造模后，AMP組以200 mg/kg劑量皮下注射給藥，Que低、中、高劑量組分別以50、100、200 mg/kg劑量灌胃給藥［7］，正常對照組和模型組灌胃給予生理鹽水，每12 h進行1次，共給藥5次。

1.4 觀察指標

1.4.1 大鼠存活率 分別于造模完成后第12、24、36、48、60 h統計存活率。60 h正常對照組存活30只、模型組11只、AMP組15只、Que低劑量組12只、Que中劑量組16只、Que高劑量組22只。

1.4.2 癥狀評分及血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）通透性檢測 1）參照文獻［8］報道的方法行癥狀評分：活動和行走未見異常計0分，活動和行走遲緩、減少計1分，直立動作緩慢計2分；不能直立計3分。2）尾靜脈注射濃度2%的伊文思藍溶液（4 mL/kg），1 h后實施麻醉，開胸暴露心臟，由左心室-右心耳通路灌注300 mL生理鹽水，斷頭取腦，去除小腦、腦干、繡球，研磨勻漿后加入3倍甲酰胺溶液，60 ℃、避光孵育24 h，取上清液（離心半徑15 cm、3000 r/min離心10 min），通過酶標儀檢測伊文思藍含量，伊文思藍含量越高則表示BBB通透性越高。

1.4.3 腦組織病理學檢查 實施麻醉后開胸，由左心室-右心耳通路依次灌注300 mL生理鹽水、300 mL 4%多聚甲醛溶液，斷頭取腦，去除小腦、腦干、繡球后置于4%多聚甲醛溶液固定3天，石蠟包埋、切片、展片、梯度乙醇脫蠟后行常規HE染色，中性樹脂封片后通過光學顯微鏡行腦組織病理學檢查。

1.4.4 血漿LPS含量和腦組織生化指標檢測 實施麻醉后，于眼眶內取血，滴加抗凝劑，離心（半徑15 cm、1500 r/min離心5 min）取血漿，按照ELISA試劑盒說明檢測血漿LPS含量。脊椎脫臼處死后，取腦組織，去除小腦、腦干，加入9倍冷裂解液，于冰上研磨勻漿，離心（半徑15 cm、3000 r/min離心10 min）取上清液，按照ELISA試劑盒操作說明檢測腦組織TNF-α、IL-1β、IL-6含量；黃嘌呤氧化法檢測SOD活性，鉬酸銨法檢測CAT活性，硫代巴比妥酸法檢測MDA含量。

1.5 腦組織蛋白表達檢測 取腦組織勻漿液，4 ℃，離心半徑15 cm，12 000 r/min離心20 min后取上清液，提取蛋白、BCA法檢測總蛋白濃度、95 ℃水浴使蛋白變性，30 μg總蛋白量上樣、凝膠電泳、轉膜、5%脫脂牛奶室溫封閉1 h后，滴加目標蛋白、β-actin一抗4 ℃過夜，洗膜后滴加二抗室溫孵育1 h，洗膜后DAB顯色，以目標蛋白條帶灰度值與β-actin（內參）條帶灰度值的比值計算目標蛋白相對表達量。

1.6 統計學方法 運用SPSS 17.0進行統計分析，計量資料以表示，采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗，計數資料采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠死亡率 造模后60 h時，正常對照組大鼠全部存活，模型組存活11只；造模24 h后，AMP組和Que中、高劑量組大鼠存活率較模型組升高（P＜0.01）；造模48 h后，Que高劑量組大鼠存活率較AMP組升高（P＜0.01）。見表1。

表1 各組大鼠不同時間段存活率比較

2.2 大鼠癥狀評分 較正常對照組，模型組大鼠癥狀評分升高（P＜0.01）；較模型組，AMP組和Que中、高劑量組癥狀評分降低（P＜0.01）；較AMP組，Que高劑量組癥狀評分降低（P＜0.01）。見表2。

表2 各組大鼠癥狀評分和腦組織伊文思藍含量比較（）

表2 各組大鼠癥狀評分和腦組織伊文思藍含量比較（）

注：與正常對照組比較，**表示P＜0.01；與模型組比較，△△表示P＜0.01；與AMP組比較，#表示P＜0.05，##表示P＜0.01

伊文思藍含量（μg/g）1.30±0.22 12.83±1.61**7.09±1.24△△11.53±1.76 8.62±1.40△△5.64±0.98△△#組別正常對照組模型組AMP組Que低劑量組Que中劑量組Que高劑量組鼠數30 11 15 12 16 22癥狀評分（分）0.00±0.00 2.41±0.42**1.26±0.27△△2.08±0.46 1.57±0.35△△0.85±0.17△△##

2.3 大鼠BBB通透性檢測 較正常對照組，模型組大鼠腦組織伊文思藍含量升高（P＜0.01）；較模型組，AMP組和Que中、高劑量組伊文思藍含量降低（P＜0.01）；較AMP組，Que高劑量組伊文思藍含量降低（P＜0.05）。見表2。

2.4 大鼠腦組織病理學改變 觀察HE染色病理切片發現，正常對照組大鼠腦組織未見異常。模型組呈現神經數量減少、細胞間隙增大，胞體腫脹，大量炎性細胞浸潤等病理性改變。較模型組，AMP組和Que低、中、高劑量組神經細胞腫脹、炎性細胞浸潤等呈不同程度減輕；其中Que高劑量組效果較優，神經細胞數量、胞體形態基本正常，僅可見極少量炎性細胞浸潤。見圖1。

圖1 各組大鼠腦組織病理學改變（HE，×200）

2.5 大鼠血漿LPS和腦組織TNF-α、lL-1β、lL-6含量 較正常對照組，模型組大鼠血漿LPS和腦組織TNF-α、IL-1β、IL-6含量升高（P＜0.01）；較模型組，AMP組和Que中、高劑量組血漿LPS和腦組織TNF-α、IL-1β、IL-6含量降低（P＜0.05或P＜0.01）；較AMP組，Que高劑量組血漿LPS和腦組織TNF-α含量降低（P＜0.01）。見表3。

表3 各組大鼠血漿LPS和腦組織TNF-α、lL-1β、lL-6含量比較（）pg/mL

表3 各組大鼠血漿LPS和腦組織TNF-α、lL-1β、lL-6含量比較（）pg/mL

注：與正常對照組比較，**表示P＜0.01；與模型組比較，△表示P＜0.05，△△表示P＜0.01；與AMP組比較，##表示P＜0.01

組別正常對照組模型組AMP組Que低劑量組Que中劑量組Que高劑量組IL-6 56.35±5.97 138.07±14.35**74.29±8.56△△126.85±13.52 97.63±10.18△△71.36±8.56△△鼠數30 11 15 12 16 22 LPS 9.35±1.96 35.84±5.70**29.14±4.59△30.11±4.82 21.75±3.37△△14.29±2.64△△##TNF-α 23.76±3.28 76.35±9.04**55.31±7.16△△64.94±10.25 48.50±7.28△△33.96±6.01△△##IL-1β 35.97±5.15 120.58±14.82**54.73±8.65△△106.48±12.27 85.24±9.36△△52.01±7.49△△

2.6 大鼠腦組織MDA含量和SOD、CAT活性 較正常對照組，模型組大鼠腦組織MDA含量顯著升高，SOD、CAT活性降低（P＜0.01）；較模型組，AMP組和Que中、高劑量組MDA含量降低，SOD、CAT活性升高（P＜0.05或P＜0.01）；較AMP組，Que高劑量組MDA含量顯著降低，SOD活性升高（P＜0.05或P＜0.01）。見表4。

表4 各組大鼠腦組織MDA含量和SOD、CAT活性（）

表4 各組大鼠腦組織MDA含量和SOD、CAT活性（）

注：與正常對照組比較，**表示P＜0.01；與模型組比較，△表示P＜0.05，△△表示P＜0.01；與AMP組比較，#表示P＜0.05，##表示P＜0.01

CAT（U/mg）組別鼠數MDA（nmol/mg）SOD（U/mg）47.06±7.34 32.61±5.28**41.23±6.49△36.41±5.88 39.73±6.05△43.28±6.61△△正常對照組模型組AMP組Que低劑量組Que中劑量組Que高劑量組）30 11 15 12 16 22 8.01±1.47 26.43±3.90**19.47±3.05△△23.96±3.64 21.07±3.22△12.53±2.81△△##2.36±0.36 1.24±0.20**1.79±0.29△△1.37±0.22 1.76±0.28△△2.18±0.30△△#

2.7 大鼠腦組織p65、lκBα、HMGB1蛋白表達 較正常對照組，模型組大鼠腦組織p65、HMGB1相對表達量升高而IκBα相對表達量降低（P＜0.01）；較模型組，AMP組和Que中、高劑量組p65、HMGB1相對表達量降低而IκBα相對表達量升高（P＜0.01）；與AMP組比較，Que高劑量組p65、HMGB1相對表達量降低而IκBα相對表達量升高（P＜0.05或P＜0.01）。見表5、圖2。

圖2 各組大鼠腦組織p65、IκBα、HMGB1蛋白表達電泳圖

表5 各組大鼠腦組織p65、lκBα、HMGB1蛋白相對表達量比較（）

表5 各組大鼠腦組織p65、lκBα、HMGB1蛋白相對表達量比較（）

注：與正常對照組比較，**表示P＜0.01；與模型組比較，△△表示P＜0.01；與AMP組比較，#表示P＜0.05，##表示P＜0.01

HMGB1/β-actin 0.04±0.02 0.45±0.12**0.15±0.06△△0.32±0.09 0.16±0.05△△0.06±0.03△△##組別正常對照組模型組AMP組Que低劑量組Que中劑量組Que高劑量組鼠數30 11 15 12 16 22 p65/β-actin 0.12±0.04 1.03±0.16**0.20±0.05△△0.93±0.14 0.55±0.09△△0.14±0.04△△#IκBα/β-actin 1.02±0.18 0.14±0.05**0.78±0.16△△0.29±0.08△△0.41±0.10△△1.05±0.21△△#

3 討論

細菌性腦膜炎是一種中樞神經系統感染性疾病，及時給予抗菌藥物能夠挽救大部分腦膜炎患者的生命，但革蘭氏陰性菌被殺滅過程可能引發內毒素血癥，破壞腦組織結構和功能，導致其治療結局并不理想。因此，尋找抗菌藥物之外的新型藥物對改善革蘭氏陰性菌感染腦膜炎預后至關重要。

細菌性腦膜炎中奈瑟球菌是最常見的病原菌之一，屬于革蘭氏陰性菌；AMP對革蘭氏陰性菌具有較好的抗菌活性，是臨床治療奈瑟球菌感染腦膜炎的一線用藥。Que是一種黃酮醇類化合物，具有抗菌、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤等多種藥理學作用［9-10］。本實驗采用經小延髓池注射奈瑟球菌懸液的方法制備奈瑟球菌感染腦膜炎大鼠模型，給予AMP或Que治療則能夠顯著提高奈瑟球菌感染腦膜炎大鼠存活率，其中Que高劑量組存活率達73%，顯著高于AMP組；并且經Que治療能夠明顯降低癥狀評分、改善腦組織神經數量減少、胞體腫脹、炎性細胞浸潤等病理性改變。BBB是存在于血液循環和腦組織之間的一種特殊屏障，對維持腦組織內環境穩定起著重要作用，BBB通透性異常升高是導致血管源性腦水腫而致殘、致死的重要因素［11-12］。本研究發現，經Que治療能夠明顯降低奈瑟球菌感染腦膜炎大鼠BBB通透性。提示Que對奈瑟球菌感染腦膜炎大鼠腦組織具有保護作用。

奈瑟球菌細胞壁中含有大量LPS，被殺滅解體后LPS釋放進入血液循環，LPS分子上的類脂A結構能夠與Toll樣受體4結合，刺激單核、巨噬細胞大量釋放炎癥因子（TNF-α、IL-1β、IL-6等），進而導致系列炎癥反應，引發內毒素血癥［13］。并且TNF-α、IL-1β作為炎性趨化因子能夠刺激粒細胞而進一步釋放炎癥因子，形成炎癥級聯反應而加重炎癥損傷［14-15］。IL-6則能夠刺激細胞大量產生活性氧（reactive oxygen species，ROS），抗氧化酶（SOD、CAT）被過度消耗，導致ROS過剩而引發氧化應激損傷，產生具有生物毒性的MDA［16］。NF-κB以p50/p65二聚體形式存在，對機體炎癥反應具有重要調控作用。生理狀態下，p50/p65與酶抑制劑IκBα結合而以無活性形式存在；病理狀態下，p50/p65與IκBα解離而被激活，位移至細胞核后p65亞基與DNA特異性位點結合而誘導單核、巨噬細胞合成與釋放TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子［17］。本研究發現，經Que治療能夠明顯降低奈瑟球菌感染腦膜炎大鼠血漿LPS和腦組織TNF-α、IL-1β、IL-6含量，降低腦組織MDA含量并提高SOD、CAT活性，下調p65、HMGB1表達并上調IκBα表達；并且Que高劑量組對血漿LPS和腦組織TNF-α、MDA含量，SOD活性，腦組織p65、IκBα、HMGB1蛋白表達的調控作用優于AMP組。說明Que對奈瑟球菌感染腦膜炎大鼠的腦保護作用可能與降低LPS水平、抑制NF-κB炎癥通路、下調HMGB1蛋白表達有關。

綜上所述，Que可通過降低LPS水平、抑制NF-κB炎癥通路、下調HMGB1表達、改善抗氧化酶活性，降低腦組織炎癥反應和氧化應激損傷，進而起到保護奈瑟球菌感染腦膜炎大鼠腦組織的作用。